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Muestreo de sangre de la vena subclavia en ratas conscientes

Published: November 3, 2023 doi: 10.3791/66075
Automatic Translation
*1,2,3, *4, 5, 6, 1,2,3
1Institute of Urology, Lanzhou University Second Hospital, 2Key Laboratory of Gansu Province for Urological Diseases, 3Gansu Nephro-Urological Clinical Center, 4The First Clinical Medical College of Lanzhou University, 5The Second Clinical Medical College of Lanzhou University, 6Medical Experimental Center of Lanzhou University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Aquí presentamos una combinación de métodos efectivos de restricción en ratas y punción de la vena subclavia que permiten la recolección de sangre rápida, segura y repetida en ratas sin anestesia.

Abstract

Existen varios métodos establecidos para obtener muestras de sangre repetidas de ratas, siendo los métodos más comúnmente empleados el muestreo de la vena lateral de la cola sin anestesia y el muestreo de la vena yugular con anestesia. Sin embargo, la mayoría de estos métodos requieren asistencia y equipo anestésico y, en ocasiones, plantean dificultades en cuanto a la extracción de sangre o la mala calidad de las muestras de sangre. Además, estos métodos de extracción de sangre consumen mucho tiempo y recursos humanos cuando se requiere la toma repetida de muestras de sangre para un gran número de ratas. Este estudio presenta una técnica para la toma repetitiva de muestras de sangre en ratas no anestesiadas por un solo individuo competente. Se pueden obtener muestras de sangre altamente satisfactorias mediante la punción de la vena subclavia. El método demostró una impresionante tasa de éxito general del 95%, con una mediana de tiempo de solo 2 minutos desde la sujeción de la rata hasta la finalización de la extracción de sangre. Además, realizar recolecciones de sangre consecutivas dentro del rango designado no inflige ningún daño a las ratas. Vale la pena promover este método para la recolección de sangre, especialmente en estudios farmacocinéticos a gran escala.

Introduction

Las ratas son uno de los animales de experimentación más comunes, y hay muchas formas de obtener muestras de sangre. En el caso de los experimentos que impliquen una sola extracción de sangre en la fase final, se puede obtener una cantidad suficiente de sangre mediante punción cardíaca o extracción de sangre de la aorta abdominal1. Sin embargo, algunos estudios requieren la recolección repetida de sangre de ratas para análisis de sangre o bioquímicos de rutina, especialmente en estudios de farmacocinética y toxicología, donde se requiere la recolección repetida de sangre para determinar la absorción, distribución y metabolismo de los medicamentos2.

En la actualidad, aunque la extracción de sangre en las venas de la cola es el método más común para la toma de muestras de sangre de ratas, a pesar de no requerir anestesia, este método puede ser un desafío para las recolecciones repetidas, y el volumen de sangre recolectado es relativamente pequeño 3,4. Además, aunque se puede recolectar sangre de las venas safena y del pene, la cantidad de sangre obtenida es limitada y se requiere anestesia 1,5. Además, las muestras de sangre recogidas del plexo venoso submandibular, así como de las venas sublingual, yugular y subclavia, proporcionan muestras de mayor calidad, pero suelen requerir anestesia o la asistencia de varios individuos 1,6,7,8,9. Por último, la extracción de sangre de los senos paranasales retroorbitarios no solo requiere anestesia, sino que también puede causar lesiones y estrés a las ratas9.

La calidad de las muestras de sangre que normalmente se obtienen de las venas principales es generalmente del másalto nivel. En la actualidad, algunos estudios han encontrado que la microtoma continua a través de la vena yugular es un método muy adecuado para la investigación toxicológica en ratas, aunque este método suele requerir el cateterismo de la vena yugular 10,11,12. Por lo tanto, vale la pena explorar cómo obtener muestras de sangre de alta calidad de acuerdo con el principio de las 3R de la investigación con animales sin intervención quirúrgica. El objetivo de este estudio fue presentar un método para extraer sangre de la vena subclavia de manera eficiente en ratas. Esta técnica permite la rápida recogida de muestras satisfactorias a través de un procedimiento de una sola persona sin necesidad de anestesia.

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Protocol

Este estudio se adhirió a las directrices trazadas en la 8ª edición de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio13. La investigación recibió la aprobación del Comité de Ética del Segundo Hospital de la Universidad de Lanzhou y se documentó el cumplimiento de las directrices ARRIVE 2.014. Doce ratas Wistar sanas (seis machos con un peso de 290-330 g y seis hembras con un peso de 250-280 g) de entre 12 y 16 semanas de edad se alojaron en el Laboratorio de Animales GLP de la Universidad de Lanzhou durante 3 días antes del experimento real. Las jaulas para ratas utilizadas eran del tipo R5, de 545 mm x 395 mm x 200 mm, y estaban equipadas con material de cama esterilizado en autoclave. A todas las ratas se les proporcionó acceso sin restricciones tanto a comida como a agua. El laboratorio mantuvo una humedad promedio de 25%, una temperatura promedio de 24 °C y un ciclo de luz que alternaba entre el día y la noche (7:00 AM/7:00 PM). Al final del estudio, todos los animales fueron sacrificados humanamente con una sobredosis de isoflurano. Para obtener información completa sobre los materiales e instrumentos empleados en este estudio, consulte la Tabla de materiales.

1. Cálculo del tamaño de la muestra y selección de animales

  1. Elija el método de la ecuación de recursos15 para estimar el tamaño de la muestra animal utilizando la ecuación (1).
    E = Número total de animales − Número total de grupos (1)
    Donde E es el grado de libertad de análisis de varianza (ANOVA) y oscila entre 10 y 20.
    NOTA: En este estudio, 12 animales fueron divididos en dos grupos A y B (tres machos y tres hembras por grupo).
  2. Defina el resultado primario de este estudio como la tasa de éxito y el consumo de tiempo de la toma repetida de muestras de sangre por parte de un solo individuo.
  3. Defina las medidas de resultado secundarias como los cambios en el peso corporal de la rata, la ingesta de alimentos y agua, así como la incidencia de eventos adversos (como fracturas de clavícula, hematomas subcutáneos, neumotórax y mortalidad).
  4. Defina el muestreo de sangre exitoso como el cumplimiento de los siguientes criterios: i) menos de tres punciones para una sola extracción de sangre; ii) un tiempo total (desde la inmovilización de las ratas hasta la finalización de la extracción de sangre) que no exceda de 5 min; y iii) lograr el volumen sanguíneo deseado mientras se obtiene plasma claro. Considere cualquier desviación de estos criterios como un error de muestreo.

2. Sujeción de animales y extracción de sangre

NOTA: Las muestras de sangre de ratas de los grupos A y B fueron recolectadas por dos investigadores experimentados, quienes habían extraído al menos 100 muestras de sangre. Se recogieron muestras de sangre de ambos grupos de ratas un total de 96 veces en el transcurso de 4 días. Este método de extracción de sangre no requiere anestesia ni dispositivos de sujeción adicionales para las ratas. Sin embargo, requiere técnicas de manejo expertas.

  1. A las 8:00 a.m. del día anterior a la toma de muestras de sangre (día 1), asigne a cada rata a su jaula individual mientras se pesan su comida y agua. Luego, haga que otro investigador, ciego a las mediciones, registre el peso, el consumo de alimentos y la ingesta de agua de las ratas todos los días a las 8:00 a.m. desde el día 1 en adelante.
  2. Para seguir este protocolo, primero se debe extraer sangre a las 10:00 a.m. y luego a las 10:00 p.m. todos los días, recolectando 0.15 mL de sangre alternativamente de las venas subclavias en ambos lados.
    NOTA: La cantidad de sangre a recolectar se determinó por el volumen máximo que la rata de menor peso podía tolerar dentro de una semana.
  3. Enjuague una jeringa con heparina sódica (25 U/mL) y desinfecte el lugar de la inyección con alcohol.
  4. Acaricia suavemente la piel de la espalda de la rata y pellizca su cuello repetidamente para ayudar a la rata a relajarse (Video 1).
  5. Con el pulgar y el índice de la mano no dominante, agarre y levante firmemente la piel del cuello de la rata (Figura 1A y Video 1).
  6. Con la coordinación de la mano dominante, use los tres dedos restantes y la palma de la mano no dominante para asegurar la piel de la espalda de la rata e inmovilizar sus extremidades delanteras (Figura 1B, C y Video 2).
    NOTA: Si la rata se resiste o lucha, este procedimiento se puede repetir varias veces para ayudar a la rata a acostumbrarse a la manipulación. Los siguientes pasos son clave para una recolección de sangre exitosa.
  7. Usando el dedo índice de la mano no dominante, empuja suavemente hacia abajo la piel de la cabeza de la rata mientras los otros dedos, junto con la palma, ayudan a rotar hacia afuera la articulación del hombro. Durante este proceso, use la mano dominante para extender completamente la articulación del hombro de la rata (Figura 1D-F y Video 2).
  8. Sujete a la rata firmemente con la mano no dominante para alinear la cabeza y el cuerpo de la rata en línea recta (Figura 1G, H). Luego, use la mano dominante para ubicar la posición de la clavícula y confirmar el sitio de punción (Figura 1I, Video 2 y Video 3).
    NOTA: No es necesario afeitar a la rata. En la Figura 1, el afeitado se realizó solo para mostrar la clavícula y la posición de punción en mayor medida. Al sujetar a las ratas, especialmente a las ratas >350 g, permitir que la rata descanse las patas sobre una superficie sólida ayudará a soportar su peso corporal. Además, el inmovilizador debe controlar la frecuencia respiratoria de cada rata mientras recolecta sangre para asegurarse de que la sujeción no esté demasiado apretada, lo que puede causar dificultad respiratoria.
  9. Sosteniendo la jeringa paralela al cuerpo de la rata en la mano dominante, con la punta de la aguja hacia arriba y la escama de la jeringa hacia el experimentador, mantenga un ángulo de aproximadamente 15° con la línea media del cuerpo de la rata. Inserte la aguja 0,5 cm por debajo de la muesca de la clavícula (en la unión del tercio proximal de la clavícula y el esternón), asegurándose de que la aguja permanezca paralela al cuerpo de la rata (Figura 1J y Video 3).
    NOTA: Se debe prestar especial atención al ángulo y la profundidad de la inserción de la aguja para evitar perforar el vaso sanguíneo o causar daños inadvertidos a los vasos adyacentes.
  10. Retire suavemente la jeringa ligeramente para crear una presión negativa, a menudo acompañada de una sensación palpable de avance al entrar en el vaso sanguíneo (particularmente pronunciada durante la extracción inicial de sangre). Mantenga esta posición y recoja 0,1-1,0 ml de sangre a una velocidad constante según sea necesario (siguiendo las pautas de la IACUC de aproximadamente 4-5,3 ml/kg de sangre por semana1) (Figura 1K y video 3).
  11. Si no hay sangre en el momento de la punción, intente ajustar suavemente el ángulo y la profundidad de la aguja o gire suavemente la jeringa (Video 3). Si tres intentos consecutivos en el mismo lado no tienen éxito, detenga todo el sangrado y luego cambie al lado opuesto para la punción.
    NOTA: Es aconsejable realizar una punción rápida a través de la piel para evitar que la rata luche debido a la incomodidad.
  12. Aplique un hisopo de algodón para la hemostasia y devuelva a la rata a su jaula (Video 4).
  13. Procesar las muestras de sangre de acuerdo con los requisitos experimentales.

3. Procesamiento de muestras de sangre

  1. Deseche la aguja de la jeringa en un recipiente para objetos punzocortantes. Transferir la sangre recolectada a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL previamente enjuagado con heparina. Coloque el tubo en una centrífuga, ajustándolo a 4 °C y 1.200 x g, y centrifugue durante 10 minutos para separar el plasma. Transfiera el suero con una pipeta Pasteur de 1,0 ml a un tubo de microcentrífuga limpio y guárdelo a -80 °C.
    NOTA: Para evitar la hemólisis debida a la presión, retire la punta de la aguja cuando sea necesario. Durante la aspiración de plasma, evite extraer células sanguíneas del fondo del tubo. Ocasionalmente, la superficie de la jeringa puede acumular pelo de rata; Tenga cuidado de no permitir que entre pelo en el tubo, ya que puede provocar coágulos.

4. Análisis estadístico

  1. Presente todos los datos como media ± desviación estándar y pruebe la homogeneidad de la varianza.
  2. Utilice la prueba exacta de Fisher para comparar las tasas de éxito entre los grupos.
  3. Utilice una prueba t independiente de dos muestras para comparar las medias generales entre los dos grupos.
  4. Utilice el análisis de varianza (ANOVA) para mediciones continuas como el tiempo de muestreo de sangre, el peso corporal, la ingesta de alimentos y el consumo de agua. Considere que P < 0,05 es estadísticamente significativo.

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Representative Results

Las muestras de plasma de alta calidad exhiben un tono, claridad y transparencia de color amarillo pálido, desprovistos de cualquier tinte rojo o coagulación, como se muestra en la Figura 2A. La Figura 2B muestra hemólisis (lado izquierdo) o coagulación (lado derecho) como resultado de procedimientos inadecuados, respectivamente. En el transcurso de 96 sesiones de extracción de sangre en 4 días, los tiempos promedio de extracción de sangre para los grupos A y B fueron de 119,87 ± 33,62 s y 123,28 ± 30,96 s, respectivamente. No hubo diferencias significativas en los tiempos de extracción de sangre entre los dos grupos sobre una base diaria (t = 0,66, p = 0,54, Tabla 1). Los tiempos de extracción de sangre individuales más cortos fueron de 78 s y 89 s, respectivamente.

El promedio de intentos requeridos para una sola extracción de sangre exitosa fue de 1,21 y 1,17 para los grupos A y B, respectivamente. No hubo diferencia significativa en el número de intentos entre los dos grupos (t = 0,58, P = 0,60, Tabla 2). Las tasas de éxito global fueron del 93,8% (45/48) y del 95,8% (46/48) para los grupos A y B, respectivamente, sin diferencias significativas en las tasas de éxito global entre los dos grupos (P > 0,05, Tabla 1). No hubo diferencias significativas en el momento de la extracción de sangre en el grupo B en cada momento. En el grupo A, el tiempo de extracción de sangre en el segundo día fue menor que el del cuarto día (105,75 ± 14,22 s vs 144,5 ± 25,45 s, t = 12,39, p < 0,01; Tabla 1) . Además, un mayor número de intentos y tiempos de punción más largos a menudo indican tasas de fracaso más altas (Figura 3A-C). Al tercer día, el grupo B encontró una falla atribuida a la hemólisis. En el cuarto día, el Grupo A encontró tres fallas: una por hemólisis y las otras dos por la imposibilidad de obtener muestras de sangre. El grupo B también experimentó un fracaso debido a la imposibilidad de obtener una muestra de sangre.

En el transcurso de 4 días consecutivos de observación, ambos grupos de ratas mostraron un aumento de peso constante. La ingesta de agua y alimentos se mantuvo relativamente constante entre las ratas del mismo sexo. A lo largo de todo el proceso de extracción de sangre, no se observaron casos de mortalidad en ratas, ni se observaron complicaciones significativas, como fracturas de clavícula, neumotórax o hematomas en el sitio de punción (Figura 3D-F y Tabla 3).

Figure 1
Figura 1: Métodos de fijación y extracción de sangre de la vena subclavia en ratas. (A-H) Manipulación de la fijación; (I) ubicación de la clavícula y el sitio de extracción de sangre; (J-L) el proceso de extracción de sangre y hemostasia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Muestras de sangre recogidas con éxito y sin éxito. (A) Muestras de sangre típicas y plasma aislado; (B) muestras de sangre hemolizadas (izquierda) y coaguladas (derecha) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Evaluación de la eficacia y seguridad de la extracción de sangre. (A) Tiempo promedio de recolección de sangre por día; (B) número promedio de pinchazos por día; (C) las tasas de éxito y fracaso de la recolección de sangre en ambos grupos; (D-F) cambios en el peso corporal, la ingesta de alimentos y la ingesta de agua durante la extracción de sangre en ambos grupos de ratas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Anatomía de los vasos del cuello de rata. (A) Estructuras anatómicas superficiales; (B) estructuras anatómicas profundas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Grupo Hora Tiempo promedio de extracción de sangre
Día 1 Día 2* Día 3 Día 4
Un 10:00 a.m. 92,83 ± 7,38 100,5 ± 17,36 117,83 ± 12,02 146,6 ± 24,76
22:00 108,67 ± 10,86 111.00 ± 6.95 158,33 ± 60,47 142,40 ± 25,96
Tiempo medio 100.75 ± 12.20 105,75 ± 14,22 138,08 ± 48,07 144,5 ± 25,45
Tasa de éxito 100% (12/12) 100% (12/12) 100% (12/12) 75% (9/12)
Tasa de éxito general 93.8% (45/48)
Tiempo medio total 119,87 ± 33,62
B 10:00 a.m. 98,17 ± 7,24 110.17 ± 14.33 123,67 ± 30,99 147,2 ± 17,47
22:00 106.00 ± 14.35 126,67 ± 17,12 123.17 ± 17.50 165,67 ± 49,70
Tiempo medio 102.08 ± 12.02 118,42 ± 17,82 123,92 ± 25,16 157,27 ± 39,63
Tasa de éxito 100% (12/12) 100% (12/12) 91.7% (11/12) 91.7% (11/12)
Tasa de éxito general 95.8% (46/48)
Tiempo medio total 123,28 ± 30,96

Tabla 1: Tiempos de extracción de sangre y tasas de éxito de los dos grupos de ratas. *El tiempo de extracción de sangre del segundo día fue menor que el del cuarto día en el grupo A (t = 12,39 P < 0,01).

Grupo Hora Número medio de pinchazos
Día 1 Día 2 Día 3 Día 4
Un 10:00 a.m. 1 1 1 1.67
22:00 1 1 1.33 1.67
Promedio 1 1 1.17 1.67
Promedio general 1.21
B 10:00 a.m. 1 1 1.17 1.5
22:00 1.17 1 1.17 1.33
Promedio 1.08 1 1.17 1.42
Promedio general 1.17

Tabla 2: Número medio de punciones para la extracción de sangre en ratas.

Género Grupo Peso (g) Ingesta de alimentos (g) Ingesta de agua (g)
Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4
♀ Un 260 ± 7.5 267,7 ± 6,3 271 ± 5.4 278 ± 6.5 13,3 ± 0,79 13,5 ± 0,93 14,0 ± 0,29 14,0 ± 0,77 23,9 ± 0,36 23,1 ± 0,77 24,4 ± 0,70 24,6 ± 0,12
B 262 ± 12.8 268,3 ± 14,0 272,7 ± 9,4 279 ± 7.0 14,4 ± 0,45 13,9 ± 0,52 14,7 ± 0,26 14,3 ± 0,56 23,6 ± 0,73 23,7 ± 0,65 24,4 ± 0,91 24,1 ± 1,79
T/Q 0.35 0.09 0.38 0.23 2.44 1.22 2.34 1.12 0.43 0.76 0.00 0.71
Valor de p ajustado >0.99 >0.99 >0.99 >0.99 0.68 0.98 0.71 0.99 >0.99 >0.99 >0.99 >0.99
♂ Un 313,7 ± 12,0 325,7 ± 9,1 329 ± 14.2 340 ± 15.6 15,9 ± 0,64 16,2 ± 0,08 15,7 ± 0,70 15,9 ± 0,73 26,2 ± 0,62 27,2 ± 0,9 26,9 ± 1,0 25.3 ± 1.1
B 311 ± 16.4 322,3 ± 18,0 330,7 ± 17,6 342 ± 16,9 15,3 ± 0,74 15,7 ± 0,85 15,1 ± 0,33 15,3 ± 0,86 27,1 ± 0,37 25,6 ± 1,27 27,5 ± 0,76 26,2 ± 0,99
q 1.50 1.88 0.94 1.13 2.34 1.85 2.10 1.97 1.90 3.57 1.24 1.82
Valor de p ajustado 0.94 0.86 >0.99 0.99 0.71 0.87 0.79 0.83 0.86 0.33 0.98 0.88

Tabla 3: Cambios en el peso corporal diario, la ingesta de alimentos y la ingesta de agua de ratas.

Vídeo 1: Calmar y manipular ratas. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2: Procedimientos de sujeción para ratas. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 3: El procedimiento de extracción de sangre para ratas. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 4: Compresión hemostática en el lugar de la punción. Haga clic aquí para descargar este video.

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Discussion

Aunque la extracción de sangre de la vena de la cola es el método más común para la toma repetida de muestras de sangre en ratas, podría estar influenciado por los fármacos anestésicos y, debido al pequeño tamaño de la vena de la cola, la cantidad de sangre que se puede recolectar en una sola instancia es limitada, lo que lleva a una mayor duración de la recolección de sangre 4,5. Aunque los sistemas de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y espectrometría de masas en tándem (MS/MS) combinados con micromuestreo capilar (CMS) de las venas de la cola de rata pueden reducir la cantidad de sangre utilizada en ratas11, no todas las instituciones están equipadas con este costoso equipo. La extracción de sangre del plexo retrobulbar/seno a menudo causa ansiedad y dolor en las ratas, y una operación incorrecta puede incluso dañar la visión y la salud de las ratas. Por lo tanto, este método no se recomienda para la toma de muestras de sangre en ratas9.

La vena subclavia está situada entre el pectoral mayor y el músculo deltoides de la rata y drena hacia la vena yugular en un tercio de la clavícula interna (Figura 4). En el estudio de Yang et al., la tasa de éxito de la extracción de sangre de la vena subclavia en ratas bajo anestesia fue de aproximadamente el 90% por un operador experto, cuyo tiempo mínimo desde el inicio hasta el final de la punción fue de 65 s7. En el estudio de Wang et al., se recogieron muestras de sangre de la vena subclavia de rata utilizando un enfoque vertical. Aunque su método no implicaba anestesia, sí requería la colaboración de dos individuos para restringir de forma segura a la rata6. Este protocolo de estudio muestra una buena ventaja de la extracción de sangre. Este protocolo no requiere ningún dispositivo de sujeción especial ni instalación de anestesia. Con un manejo adecuado, las ratas generalmente exhiben una resistencia mínima. La mediana de tiempo desde la sujeción de las ratas hasta la finalización de la extracción de sangre fue de solo 2 minutos, logrando una impresionante tasa de éxito general del 95%. Este método conserva significativamente los recursos humanos y reduce el tiempo necesario para la extracción de sangre. Además, las muestras de plasma obtenidas son claras y transparentes, con una ocurrencia mínima de eventos de hemólisis y coagulación, lo que minimiza la repetición del experimento. El dominio de esta técnica es particularmente valioso para el manejo de experimentos farmacocinéticos y toxicológicos a gran escala en ratas que requieren la recolección repetitiva de sangre.

En nuestro estudio, la principal ocurrencia de fracaso de la extracción de sangre fue el día 4, lo que podría estar relacionado con el daño venoso causado por punciones repetidas. Las punciones repetidas pueden provocar daños en la pared vascular y provocar una respuesta inflamatoria, lo que hace que la pared vascular se engrose y endurezca, e incluso induzca un estrechamiento vascular. Si la hemostasia es inadecuada después de la punción, la sangre extravasada puede causar edema tisular e inflamación, lo que posteriormente conduce a la formación de tejido cicatricial. Estos tejidos cicatriciales son difíciles de penetrar y también pueden tirar y hacer que los vasos sanguíneos cambien de posición, todo lo cual hace que los vasos sanguíneos sean más difíciles de localizar y perforar. En nuestro estudio, se utilizó una jeringa de 26G (0,45 mm) para la extracción de sangre, que está bien en relación con las venas humanas, pero aún causa un daño considerable a las venas de ratas. Esto se evidencia por la clara sensación de penetración cuando la aguja pasa a través del vaso durante la primera extracción de sangre, que disminuye a medida que aumenta el número de extracciones de sangre, con tiempos de extracción de sangre más largos y mayores tasas de fracaso. Por lo tanto, recomendamos usar una aguja de insulina más fina para la extracción de sangre, y se debe aplicar la presión adecuada después de la extracción de sangre para prevenir la formación de hematomas, y se deben realizar extracciones de sangre alternas para permitir una reparación venosa suficiente. En nuestra experiencia, un flebotomista bien entrenado puede usar una aguja de 26G para extraer alternativamente sangre de las venas subclavias bilaterales de la misma rata de 8 a 10 veces en 24 horas, con un intervalo promedio de 2 a 3 horas entre cada extracción de sangre. Sin embargo, el número máximo de extracciones de sangre que una rata puede tolerar, el período de recuperación y el ciclo de extracción de sangre pueden verse influenciados por el calibre de aguja utilizado, los intervalos de extracción de sangre requeridos por diferentes experimentos y la competencia del flebotomista. Estos factores deben explorarse más a fondo en futuras investigaciones. Para la toma intensiva de muestras de sangre requeridas para experimentos farmacocinéticos, es mejor recolectar sangre alternativamente de las venas subclavias izquierda y derecha. En los casos en los que realmente no se dispone de ella, se pueden complementar otros métodos de extracción de sangre.

El peso corporal, el consumo de agua y la ingesta de alimentos son los indicadores más básicos y sencillos para evaluar el estado de salud de las ratas16. Un estudio anterior había demostrado que la extracción de sangre a través de la vena yugular de menos de 0,9 ml por día no afectaba a la hemodinámica de las ratas y no daba lugar a ninguna pérdida de peso significativa. Sin embargo, cuando la extracción de sangre supera 1,5 mL, puede conducir a la pérdida de peso17. En el estudio de Yokoya et al., el micromuestreo repetido de la vena yugular (50 μL cada vez, 6-7 veces en 24 h) no afectó el peso corporal de la rata ni la ingesta de alimentos10. Además, la forma de recolección de sangre puede afectar el peso corporal y la ingesta de alimentos de las ratas. En un estudio previo en el que se utilizó la extracción de sangre en las venas sublinguales, una recolección de 24 h de 0,5-1,0 mL de sangre el primer día resultó en una reducción del peso corporal de la rata y una disminución de la ingesta de alimentos, aunque la pérdida de peso no fue significativa18. En este estudio, el peso corporal de las ratas aumentó constantemente durante el período de recolección de sangre, y no hubo cambios significativos en la ingesta de alimentos y agua, complicaciones relacionadas con la recolección de sangre y muerte de las ratas, lo que indica que este método es seguro y confiable.

Es crucial enfatizar que aclimatar a las ratas al proceso de restricción antes de realizar la extracción de sangre probablemente disminuirá el estrés en la rata y mejorará la tasa de éxito de la recolección de sangre. La fijación inadecuada y la exposición insuficiente de las venas pueden provocar fallos en la extracción de sangre e incluso provocar la ruptura local de las venas debido a la lucha de las ratas contra el dolor. En los casos más leves, esto podría dar lugar a hematomas subcutáneos notables, mientras que en los casos graves, podría provocar la muerte de ratas. Además, una fijación deficiente podría hacer que las ratas se escapen y causen daño a las personas. Por lo tanto, recomendamos encarecidamente dominar a fondo la técnica de manipulación antes de proceder con el procedimiento de extracción de sangre. Además, es importante tener cuidado con la fuerza aplicada para rotar hacia afuera la articulación del hombro, ya que una presión excesiva puede provocar fracturas de clavícula en la rata.

Una limitación de este estudio es que no evaluamos sistemáticamente los cambios en el estrés inducidos por este método de extracción de sangre en ratas mediante la medición de los cambios en el nivel de corticosterona o mediante el monitoreo en la jaula, lo que debe explorarse en futuras investigaciones. Otra limitación de este artículo es la ausencia de métodos alternativos de extracción de sangre como control. Las comparaciones con otros métodos de extracción de sangre para conocer sus ventajas y desventajas se abordarán en futuras investigaciones. En total, este estudio introduce un método para la extracción de sangre de ratas por una sola persona sin necesidad de anestesia. Este enfoque ofrece un medio sencillo, rápido y seguro de obtener muestras de sangre de ratas.

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Disclosures

Los autores no tienen intereses financieros o no financieros relevantes que revelar.

Acknowledgments

Este estudio fue apoyado por el Proyecto del Plan Cuiying del Segundo Hospital de la Universidad de Lanzhou (Subvención No. PR0121015) y el Laboratorio Provincial Clave de Investigación de Enfermedades del Sistema Urinario de Gansu (Subvención Nº 0412D2).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.75% normal saline Gansu Fuzheng Pharmaceutical Technology Co., Ltd. —— Prepared heparin sodium solution
1 mL Pasteur pipette  Biosharp BS-XG-01-NS Blood collection
1 mL syringe (26 G, 0.45 mm x 12 mm) Shinva Medical Instrument Co.,Ltd. 0.45*12RWLB Blood collection 
1.5 mL Eppendorf tube Biosharp BS-15-M Blood storage and collection
75% medical alcohol Shandong Lircon Medical Technology Co., Ltd. —— Disinfection of rat blood collection site
Centrifuge tube holder Biosharp BS-05/15-SM60 ——
Electronic scale Shanghai PUCHUN Measure Instrument Co., Ltd. JE1002 Weigh
Heparin sodium injection Hebei Changshan Biochemical Pharmaceutical Co., Ltd. —— Rinse the syringe and EP tube; dilute with normal saline to 25 U/mL
Low temperature centrifuge HuNan Xiang Yi Centrifuge Instrument  Co., Ltd.  H1750R Separation of serum

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References

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Este mes en JoVE Número 201 Rata vena subclavia muestra de sangre

Erratum

Formal Correction: Erratum: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats
Posted by JoVE Editors on 03/21/2024. Citeable Link.

An erratum was issued for: Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. The Discussion section was updated.

The third paragraph in the Discussion section was updated from:

In this study, the failure of blood sampling mainly occurred on day 4, which may be related to repeated punctures causing damage to the veins. During the first blood sampling, there was a noticeable sensation of penetration as the needle pierced the blood vessel. As the number of blood samples increased, this sensation diminished, prolonging blood collection and increasing the failure rate. Therefore, after each blood collection, local pressure hemostasis is necessary to promote vascular repair and prevent local hematoma formation. It is also recommended to try a finer needle, such as an insulin needle, for blood collection. Once puncture fails on one side, the puncture site should be applied with compression and the rat should be allowed to rest for a few minutes before changing to the contralateral side for blood collection. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.

to:

In our study, the main occurrence of blood draw failure was on day 4, which might be related to the venous damage caused by repeated punctures. Repeated punctures can lead to damage of the vascular wall and provoke an inflammatory response, causing the vascular wall to thicken and harden, and even induce vascular narrowing. If hemostasis is inadequate after puncture, the extravasated blood can further cause tissue edema and inflammation, subsequently leading to the formation of scar tissue. These scar tissues are tough to penetrate and can also pull and cause blood vessels to shift position, all of which make the blood vessels more difficult to locate and puncture. In our study, a 26G syringe (0.45mm) was used for blood collection, which is fine relative to human veins but still causes considerable damage to rat veins. This is evidenced by the clear sensation of penetration when the needle passes through the vessel during the first blood draw, which diminishes as the number of blood draws increases, with longer blood collection times and higher failure rates. Therefore, we recommend using a finer insulin needle for blood collection, and adequate pressure should be applied after blood collection to prevent hematoma formation, and alternate blood draws should be performed to allow sufficient venous repair. In our experience, a well-trained phlebotomist can use a 26G needle to alternately draw blood from the bilateral subclavian veins of the same rat 8-10 times within 24 hours, with an average interval of 2-3 hours between each blood draw. However, the maximum number of blood draws a rat can tolerate, the recovery period, and the blood draw cycle may be influenced by the needle gauge used, the blood draw intervals required by different experiments, and the proficiency of the phlebotomist. These factors need to be further explored in future research. For intensive blood sampling required for pharmacokinetics experiments, it is better to alternately collect blood from the left and right subclavian veins. In cases where it is truly unavailable, other methods of blood collection may be complemented.

Muestreo de sangre de la vena subclavia en ratas conscientes
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Zhang, X. h., Peng, S., Pei, Z. x.,… More

Zhang, X. h., Peng, S., Pei, Z. x., Sun, J., Wang, Z. p. Subclavian Vein Blood Sampling in Conscious Rats. J. Vis. Exp. (201), e66075, doi:10.3791/66075 (2023).

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