Summary
胃患者来源的类器官在研究中得到了越来越多的应用，但缺乏从具有标准化接种密度的单细胞消化物中生成人胃类器官的正式方案。该协议提出了一种从上消化道内窥镜检查期间获得的活检组织可靠地创建胃类器官的详细方法。
Abstract
胃患者来源的类器官 （PDO） 为研究胃生物学和病理学提供了一种独特的工具。因此，这些 PDO 在广泛的研究应用中得到越来越多的应用。然而，在保持标准化初始细胞接种密度的同时，从单细胞消化物中生产胃 PDO 的已发表方法存在短缺。在该协议中，重点是从分离的单细胞中启动胃类器官，并提供一种通过片段传代类器官的方法。重要的是，该方案表明，初始细胞接种密度的标准化方法始终如一地从良性活检组织中产生胃类器官，并允许类器官生长的标准化定量。最后，证据支持新的观察结果，即胃PDOs显示出不同的形成和生长速率，这取决于类器官是来自身体的活检还是胃的窦区。具体来说，与胃体活检产生的类器官相比，使用窦活检组织进行类器官启动会导致在 20 天内形成更多的类器官和更快的类器官生长。本文描述的方案为研究人员提供了一种及时且可重复的方法，用于成功生成和使用胃 PDO。
Introduction
类器官是微型三维 （3D） 细胞结构，类似于它们衍生的器官的结构和功能 1,2。这些实验室培养的模型是通过在受控环境中培养干细胞或组织特异性细胞而创建的，该环境允许这些细胞自组织并分化成各种细胞类型1,2,3。类器官的主要优势之一是它们能够比传统的二维 （2D） 细胞培养物更接近地概括人类生物学 1,2,3。特别是，人类类器官已被证明可以维持其起源组织的遗传多样性3,4,5。类器官提供了一个独特的机会，可以在受控的实验室环境中研究人体器官发育、模拟疾病和测试潜在的治疗方法。此外，类器官可以从个体患者样本中衍生出来，从而实现个性化医疗方法和个性化治疗的潜在发展3,6,7。
研究人员使用人类胃类器官来研究胃生物学和病理学的各个方面。突出的例子包括使用患者来源的类器官 （PDO） 来预测胃癌化疗反应 8,9,10 和模拟对幽门螺杆菌感染的上皮反应 11,12,13。人胃类器官由胃中发现的各种细胞类型组成，包括颈部细胞、凹陷细胞和其他支持细胞11,14。胃类器官可以由诱导多能干细胞（iPSCs）产生，也可以从通过活检获得的胃组织或胃切除标本中直接分离的干细胞产生11,14。从胃组织中分离胃干细胞通常通过分离和培养胃腺或酶消化组织样本以释放单个细胞来完成 9,13,15。重要的是，使用这些技术中的任何一种产生的胃类器官内细胞的分化已被证明是相似的13。本文描述的方案侧重于单细胞消化物。
类器官代表了一种科学创新，它弥合了传统细胞培养和整个器官之间的差距。随着该领域研究的不断进展，类器官有望为开发更有效的治疗方法和疗法做出贡献，以实现广泛的应用。鉴于胃PDO的使用率不断提高，及时需要一种标准化的方法来产生它们。在这里，描述了从上消化道内窥镜检查期间获得的良性胃活检组织中分离的单个细胞中产生人胃PDO的方案。重要且独特的是，确定标准化数量的单细胞进行接种，以可靠地产生胃PDO并允许随后的表征。使用这种技术，证明了胃体或胃窦活检产生的类器官形成和生长的可靠差异。
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Protocol
本协议中使用的所有人体组织都是从通过宾夕法尼亚大学机构审查委员会 （IRB #842961） 批准的胃组织收集研究提供组织收集知情同意的个人收集的。作为常规护理的一部分，本研究的参与者被要求接受上消化道内窥镜检查，至少年满 18 岁，并能够提供知情同意。所有研究均遵循宾夕法尼亚大学制定的指导方针。
1.实验准备
- 如前所述制备有条件的L-WRN培养基16。虽然不是强制性的，但可以按照制造商的说明使用市售的 ELISA 试剂盒检查条件培养基中所含的 Wnt-3A、R-spondin 和 noggin 的浓度（参见 材料表）。
- 制备RPMI-抗生素（RPMI-ABX），PBS-抗生素（PBS-ABX），PBS-二硫苏糖醇（PBS-DTT），消化缓冲液和胃类器官培养基（详细组成见 补充表1 ）。胃类器官培养基在4°C下稳定1周。
- 高压灭菌镊、细解剖剪刀和 1.5 mL 管。
- 开始在冰上解冻基底膜基质（基质胶）。
- 开始在37°C水浴中解冻消化缓冲液和胰蛋白酶-EDTA。
- 将培养箱轨道振荡器设置为37°C和200rpm。
2. 从活检组织中分离单细胞
- 在上消化道内窥镜检查期间收集胃活检17 遵循机构临床方案，可能涉及使用大镊子。使用钝头针从镊子中提取组织样本，并将其放入含有 RPMI-ABX 培养基的 15 mL 锥形管中。将试管放在冰上，以便快速转移到实验室。
注意：至少应收集 2-4 次活检。 - 让活检组织沉淀在锥形管的底部。使用移液管吸出培养基，并用 1 mL PBS-ABX 缓冲液洗涤活检两次。无需离心，因为组织碎片自然沉降在锥形管中。
- 将至少 20 mg 活检组织转移到含有 1 mL PBS-DTT 的 1.5 mL 试管中。
- 使用精细解剖剪刀将组织切成 1-2 毫米或更小的碎片。
- 使用台式微型离心机 15 秒，将组织碎片聚集在试管底部并吸出尽可能多的上清液。少量残留的 PBS-DTT 是可以接受的。
- 将 5 mL 新鲜加热的消化缓冲液加入 50 mL 锥形管中。为了在不丢失组织的情况下转移小组织块，取 500 μL 消化缓冲液并将其加入含有组织的 1.5 mL 管中。接下来，用剪刀修改 1000 μL 移液器吸头的吸头，以增加吸头的直径，以便于抽吸并将组织块转移到含有消化缓冲液的 50 mL 锥形管中。
- 将消化缓冲液和组织混合物在37°C下孵育30分钟，以200rpm的轨道振荡。
- 向消化缓冲液中加入5mL含有0.25%EDTA的温热胰蛋白酶，并在37°C下以200rpm的轨道振荡再孵育10分钟。
- 通过加入等体积的高级（高级）DMEM / F12培养基中和消化缓冲液和胰蛋白酶，并将溶液通过70μm细胞过滤器。
- 通过在4°C下以1400× g 离心4分钟来沉淀细胞。 根据活检组织的初始大小，小细胞颗粒可能可见，也可能不可见。
- 将细胞沉淀重悬于 1 mL Adv. DMEM/F12 培养基中，并使用台盼蓝和血细胞计数器计数活细胞数。
- 在4°C下通过1400× g 离心再次沉淀细胞4分钟，并除去上清液。
注： 图1 显示了从活检组织中分离单细胞的过程示意图。
3. 将单个细胞嵌入基底膜基质“圆顶”
- 根据计数的活细胞数，计算达到每 50 μL 基底膜基质 105 个活细胞的最终浓度所需的基底膜基质体积。
- 在电镀前迅速执行以下操作，以防止基底膜基质聚合。从冰中取出解冻的基底膜基质，将先前计算的基底膜基质体积加入细胞中，并通过上下移液约10秒轻轻混合。
注意：在此步骤中避免产生气泡至关重要。不要稀释基底膜基质。 - 将 50 μL 基底膜基质/细胞混合物的等分试样快速移液到 24 孔组织培养板中单个孔的中心。
- 立即盖上 24 孔板，然后以一个平稳的动作将板倒置。将倒置的板置于37°C组织培养箱中35分钟，以使基底膜基质聚合。
注意：倒置板对于防止细胞下沉到板底部并使基底膜基质聚合成 3D“圆顶”形状至关重要。 - 向每个孔中加入 500 μL 预热的胃类器官培养基，确保每个“圆顶”的顶部完全浸没在培养基中。将介质分配到每个孔的侧面，以免干扰“圆顶”。
- 每 2-3 天更换一次介质。
4. 类器官通过 片段化的常规传代
- 一旦类器官准备好传代，从每个指定的孔中取出培养基。
注意：要确定适当的传代时间，请参阅代表性结果部分。 - 将 1 mL 冰冷的 Adv. DMEM/F12 培养基直接分配到基底膜基质“圆顶”上。这应该很容易引发“穹顶”的解体。继续吸气和分配，直到“圆顶”的所有碎片从板上分离。
- 将介质和破碎的基底膜基质运输到下一个孔，对所有计划传代的孔重复此过程。拆卸最终的基底膜基质“圆顶”后，将培养基以及类器官和基底膜基质的混合物分配到 1.5 mL 管中。
- 将 1000 μL 吸头连接到 P1000 移液器，然后将该吸头插入 200 μL 吸头中。这将创建一个直径足够小的移液器吸头，以碎片化类器官，同时仍允许吸入更大体积的移液器。
- 用力将类器官和基底膜基质的混合物上下移液约25次，以将类器官碎片化成小块。
- 使用台式离心机在4°C下以2000× g离心30秒，将碎片化的类器官混合物离心。这将导致从基底膜基质和培养基中分离出碎片类器官的颗粒。使用移液器吸出培养基和基底膜基质上清液。不要使用真空吸出上清液，因为沉淀是松散的。
- 计算所需的新解冻基底膜基质的体积，以便以 1：2 的比例（50 μL/圆顶）拆分孔/圆顶的数量。加入新鲜的基底膜基质，轻轻上下移液混合，注意避免产生气泡。
- 将 50 μL 类器官片段和基底膜基质的混合物快速分装到 24 孔板的单个孔中。
- 盖上板，将其倒置，并将其置于37°C组织培养箱中35分钟，以使基底膜基质聚合。
- 向每个孔中加入 500 μL 预热的胃类器官培养基。
注： 图 2 显示了胃患者来源的类器官通过碎片传代的示意图。
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Representative Results
随后的代表性结果来自接受上消化道内窥镜检查的五名不同患者的胃体和胃窦区域的良性上皮的活检。每位患者铺上两到四个“圆顶”/孔，并分析胃体和胃窦活检。从所有五名患者的胃体和胃窦活检组织中成功生成类器官。平均而言，每个“圆顶”/孔分析了 41 个类器官。所有图像都是使用共聚焦显微镜采集的 z 投影，并使用市售的图像分析软件进行类器官大小和球形度的定量（参见 材料表）。
类器官通常在单细胞接种后10天内被识别（图3A）。到第 20 天，类器官很大，通常需要传代。虽然单细胞接种后形成的类器官数量可能有些可变，但由身体和胃窦胃活检形成的类器官数量的预期结果如 图 3B 所示。体和窦类器官的数量在播种后第 10 天达到峰值。虽然不显着，但类器官的总数从第 10 天到第 15 天和第 15 天到第 20 天开始减少。似乎有一个小类器官的亚群，它们在第 10 天形成，然后在接下来的 10 天内停止生长并死亡，这可以解释这一趋势。重要的是，表明在第 10、15 和 20 天，由窦活检组织形成的类器官数量显着高于来自身体的活检组织。形成的窦状类器官的数量平均比从身体形成的类器官的数量高2倍。
在 图 3C 中，显示了第 10 天和第 20 天之间单细胞接种后类器官生长的代表性结果。虽然来自窦和身体活检的类器官从第 10 天到第 20 天都稳定增长，但与身体活检组织产生的类器官相比，窦活检组织产生的类器官显示出更高的生长速度。特别是，在第 20 天，窦类器官的面积比身体类器官大近 4 倍。
在不同的患者中，通常在任何单个“圆顶”/孔中观察到类器官形态的多样性（图4A）。一些类器官更圆或球形，而另一些则表现出更不规则的形态。然而，平均而言，球形度（衡量类器官球形程度的指标）（其中 1 分 = 完美球体）18 显示由身体或窦活检组织产生的类器官内部和之间几乎没有变化（图 4B）。因此，尽管生长速率不同，但胃体或胃窦活检组织产生的类器官之间通常没有显着的形态差异。
到开始后第 20 天，胃类器官通常已准备好排出。类器官的大尺寸（≥直径1500μm）或类器官的深色内部（提示广泛的细胞更新）是类器官需要传代的关键标志（图5A）。超过这一点的类器官可能会开始分解成2D单层（图5B），这些单层在传代后不能可靠地重新形成类器官，可能表明活力或干性的丧失。在使用本文所述的片段化方案传代和重新接种胃类器官后，“圆顶”将包含许多类器官片段（图5C），与单细胞的初始接种相比，这些类器官片段将重组成更多的类器官并且生长得更快（图5D）。如果类器官生长在传代时仍需要表征和/或标准化，则胃类器官可以被消化为单细胞，如前所述19。
图 1：胃患者来源的类器官的生成。 示意图概述了从良性胃上皮的活检中产生胃患者来源的类器官的过程。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：胃患者来源的类器官的传代。 示意图概述了胃患者来源的类器官通过碎裂的传代。 请点击这里查看此图的较大版本.
图3：胃患者来源的类器官形成和生长。 （A） 代表性的 z 投影图像，显示单细胞接种后第 10、15 和 20 天胃类器官的生长。图像是从同一患者的胃体和胃窦活检组织生成的类器官。比例尺 = 1 毫米。 （B） 单细胞接种后指定时间点胃体和胃窦类器官的平均 （±SD） 数量。（C） 单细胞接种后指定时间点胃体和胃窦类器官的平均 （±SD） 面积 （μm2）。n = 每组和时间点 5 名患者。* = 在指定时间点的统计学显著差异 （p ≤ 0.05）。n.s. = 在指定的时间点没有统计学上的显著差异。 通过 2 因素方差分析进行统计比较。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：胃患者来源的类器官形态。 （A） 在单细胞接种后第 15 天，来自胃体来源类器官的单个“圆顶”/孔的不同胃类器官形态的代表性 z 投影图像。比例尺 = 200 μm。 （B） 平均 （±SD） 胃体和胃窦类器官球形度（其中值 1 = 完美球体）。n = 每组和时间点 5 名患者。n.s. = 在任何时间点均无统计学显著差异。通过 2 因素方差分析进行统计比较。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：胃患者来源的类器官传代。 （A） 单细胞接种后第 20 天准备传代的类器官的代表性图像。（B） 单细胞接种后第 25 天过期传代的类器官的代表性图像。（C） 重新播种后片段类器官的代表性图像（第 1 代 - 第 0 天）。（D） 重新播种后 5 天内类器官生长的代表性图像（第 1 代 - 第 5 天）。所有图像均为 z 投影。比例尺 = 1 mm. 请点击这里查看此图的较大版本.
附表1：溶液和培养基配方。请点击此处下载此文件。
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Discussion
本文概述了从胃体和胃窦的良性上皮活检中分离出的单细胞可靠地产生人胃类器官的详细方案。该协议中的关键步骤围绕着定时以及处理基底膜基质。为了保持活力，必须在获得活检组织后尽快启动方案。目的是在进行活检后 30 分钟内开始消化活检组织。处理基底膜基质也可能具有挑战性。在冰上解冻时，它仍然是液体;然而，在高于4°C的温度下，它会聚合。因此，必须立即将基底膜基质从冰中转移出来，与单细胞或类器官片段混合以用于电镀“圆顶”，因为它在一分钟内开始聚合。一旦它在试管中聚合，就不能被吸入移液器吸头。如果发生这种情况，可以将试管放在冰上，直到基质胶解聚回液体。当轻轻上下移液以将单个细胞或类器官片段与基底膜基质混合时，避免产生气泡也很重要。虽然基底膜基质“圆顶”中的气泡似乎不会阻碍类器官的形成和生长，但它们会阻碍可视化。此外，将基底膜基质/细胞混合物等分到细胞培养板的孔中后，必须将板倒置并放入培养箱中。这一步对于让基底膜基质聚合成 3D“圆顶”形状并防止单细胞或类器官片段沉入板底部至关重要。
使用该方案，可以在单细胞接种后 10 天内鉴定胃类器官。经验表明，在第 10 天之后形成的新胃类器官很少，事实上，类器官的总数可能会从第 10-20 天略有减少。对于从胃体和胃窦产生的类器官都是如此。然而，胃窦活检形成的类器官总数明显高于胃体活检。此外，在单细胞接种后第 10-20 天之间，窦类器官的生长大大超过了身体类器官。这种差异可能归因于Wnt灵敏度的变化。最近的一项研究表明，胃体 PDO 在较低的 Wnt 激活下表现出更好的生长，而胃窦 PDO 在较高的 Wnt 激活下茁壮成长20。文献中通常没有指定用于生成胃 PDO 的胃活检的位置。在未来利用不同胃部区域胃活检产生的胃PDO的研究中，应考虑这种差异。
该协议的另一个关键方面是建立每个“圆顶”/孔的标准化单细胞数量，以可靠地产生胃PDO。虽然之前的一项研究报告了用于 PDO 生成的标准化胃腺数量，但之前使用单细胞消化方法的研究没有提到接种的细胞数量或数量在不同 PDO 系中是否一致。未能标准化接种的细胞数量会导致每个“圆顶”/孔接种的干细胞数量差异很大。由于干细胞是胃类器官形成的主要来源，这可能导致类器官形成和生长的速率不同。因此，使用非标准化数量的单细胞可能会混淆不同胃PDO系的形成或生长比较的解释。在这里，证明将接种的细胞数量标准化为每个“圆顶”/井 105 个 细胞，可靠地从胃的身体和胃窦区域的活检中产生胃 PDO。
该方案针对新鲜胃活检组织的使用进行了优化。因此，当使用冷冻组织或通过其他方式保存的组织时，该协议的成功可能会有所不同。此外，没有关于新鲜活检维持活力多长时间的数据，因为活检组织在从患者胃中取出后会尽快处理。据推测，新鲜组织在加工前放置的时间越长，分离出的活细胞就越少。
如本方案所述，通过碎片传代胃PDOs为常规传代提供了一种简单的方法。虽然使用这种技术已经成功传代了胃PDO多达4次，但没有尝试确定它们在保持稳定生长和活力的同时可以传代多少次。一些报告表明，胃类器官的生长可能会在 5 次或更多次传代后减慢21,22，而其他报告则观察到多达 10 次传代的可靠生长23。
本方案中使用的胃类器官培养基含有源自 L-WRN 细胞条件培养基的 Wnt-3A、noggin 和 R-spondin。为了生产条件培养基，使用了 Miyoshi 和 Stappenbeck 描述的协议16。或者，Wnt-3A、noggin 和 R-spondin 可以作为重组蛋白单独购买。单独购买单个组分是避免使用L-WRN细胞条件培养基时可能出现的潜在批次效应的理想选择。然而，购买重组蛋白是昂贵的，对于经常使用类器官的研究人员来说，成本可能过高。
鉴于胃PDO在各种应用中的使用越来越多，建立产生良性胃PDO的标准化方法是及时和必要的。这里描述的方案为未来利用胃PDO进行研究提供了一种可靠的方法。根据我们的经验，该协议在90%以上的时间内成功地从良性胃粘膜的活检中生成类器官。
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Disclosures
作者没有相关披露。
Acknowledgments
宾夕法尼亚大学基因组医学T32 HG009495（KHB），NCI R21 CA267949（BWK），Basser BRCA中心的男性和BRCA项目（KHB，BWK），DeGregorio家庭基金会资助奖（BWK）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
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