Summary
Les organoïdes dérivés de patients gastriques sont de plus en plus utilisés dans la recherche, mais il n’existe pas de protocoles formels pour générer des organoïdes gastriques humains à partir de digestats unicellulaires avec une densité d’ensemencement standardisée. Ce protocole présente une méthode détaillée pour créer de manière fiable des organoïdes gastriques à partir de tissus de biopsie obtenus lors de l’endoscopie haute.
Abstract
Les organoïdes gastriques dérivés de patients (PDO) offrent un outil unique pour l’étude de la biologie et de la pathologie gastriques. Par conséquent, ces PDO sont de plus en plus utilisés dans un large éventail d’applications de recherche. Cependant, il existe une pénurie d’approches publiées pour produire des AOP gastriques à partir de digestats unicellulaires tout en maintenant une densité d’ensemencement cellulaire initiale standardisée. Dans ce protocole, l’accent est mis sur l’initiation d’organoïdes gastriques à partir de cellules isolées et sur la mise au point d’une méthode de transmission d’organoïdes par fragmentation. Il est important de noter que le protocole démontre qu’une approche standardisée de la densité d’ensemencement cellulaire initiale permet d’obtenir systématiquement des organoïdes gastriques à partir de tissus de biopsie bénins et permet une quantification standardisée de la croissance des organoïdes. Enfin, les preuves soutiennent la nouvelle observation selon laquelle les AOP gastriques présentent des taux de formation et de croissance variables selon que les organoïdes proviennent de biopsies du corps ou de régions antrales de l’estomac. Plus précisément, il est révélé que l’utilisation de tissu de biopsie antrale pour l’initiation des organoïdes entraîne la formation d’un plus grand nombre d’organoïdes et une croissance plus rapide des organoïdes sur une période de 20 jours par rapport aux organoïdes générés à partir de biopsies du corps gastrique. Le protocole décrit dans le présent document offre aux chercheurs une méthode opportune et reproductible pour générer et travailler avec succès des AOP gastriques.
Introduction
Les organoïdes sont des structures cellulaires tridimensionnelles miniatures (3D) qui ressemblent à l’architecture et à la fonctionnalité des organes dont ils sont issus 1,2. Ces modèles cultivés en laboratoire sont créés en cultivant des cellules souches ou des cellules tissulaires spécifiques dans un environnement contrôlé qui permet à ces cellules de s’auto-organiser et de se différencier en différents types cellulaires 1,2,3. L’un des principaux avantages des organoïdes est leur capacité à récapituler la biologie humaine de plus près que les cultures cellulaires bidimensionnelles (2D) traditionnelles 1,2,3. En particulier, il a été démontré que les organoïdes humains maintiennent la diversité génétique de leurs tissus d’origine 3,4,5. Les organoïdes offrent une occasion unique d’étudier le développement des organes humains, de modéliser des maladies et de tester des thérapies potentielles dans un environnement de laboratoire contrôlé. De plus, les organoïdes peuvent être dérivés d’échantillons individuels de patients, ce qui permet des approches de médecine personnalisée et le développement potentiel de traitements individualisés 3,6,7.
Les chercheurs ont utilisé des organoïdes gastriques humains pour étudier divers aspects de la biologie et de la pathologie gastriques. Parmi les exemples les plus frappants, citons l’utilisation d’organoïdes dérivés du patient (PDO) pour prédire les réponses à la chimiothérapie du cancer gastrique 8,9,10 et modéliser la réponse épithéliale à l’infection à Helicobacter pylori 11,12,13. Les organoïdes gastriques humains sont constitués de divers types de cellules présentes dans l’estomac, notamment les cellules du cou, les cellules de la fosse et d’autres cellules de soutien11,14. Les organoïdes gastriques peuvent être générés soit à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi), soit à partir de cellules souches directement isolées à partir de tissus gastriques obtenus par biopsies ou à partir d’échantillons de résection gastrique11,14. L’isolement des cellules souches gastriques du tissu gastrique se fait généralement en isolant et en cultivant des glandes gastriques ou en digérant enzymatiquement des échantillons de tissus pour libérer des cellules individuelles 9,13,15. Il est important de noter que la différenciation des cellules au sein des organoïdes gastriques générés à l’aide de l’une ou l’autre de ces techniques s’est avérée similaire13. Le protocole décrit ici se concentre sur un condensé unicellulaire.
Les organoïdes représentent une innovation scientifique qui comble le fossé entre la culture cellulaire traditionnelle et les organes entiers. Alors que la recherche dans le domaine continue de progresser, les organoïdes sont sur le point de contribuer au développement de traitements et de thérapies plus efficaces pour un large éventail d’applications. Compte tenu de l’utilisation croissante des AOP gastriques, il est nécessaire d’adopter une approche standardisée de leur génération. Ici, le protocole de génération de PDO gastriques humaines à partir de cellules uniques isolées à partir de tissus de biopsie gastrique bénigne acquis lors de l’endoscopie haute est décrit. Il est important de noter qu’un nombre normalisé de cellules individuelles est déterminé pour l’ensemencement afin de générer de manière fiable des AOP gastriques et de permettre une caractérisation ultérieure. À l’aide de cette technique, des différences fiables dans la formation et la croissance des organoïdes générés à partir de biopsies du corps gastrique ou de l’antre gastrique sont démontrées.
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Protocol
Tous les tissus humains utilisés dans ce protocole ont été prélevés auprès de personnes qui ont donné leur consentement éclairé pour le prélèvement de tissus dans le cadre d’une étude de collecte de tissus gastriques approuvée par le Institutional Review Board de l’Université de Pennsylvanie (IRB #842961). Les participants à cette étude devaient subir une endoscopie haute dans le cadre de leurs soins de routine, être âgés d’au moins 18 ans et être en mesure de donner un consentement éclairé. Toutes les recherches menées ont respecté les directives établies par l’Université de Pennsylvanie.
1. Préparation expérimentale
- Préparez le support L-WRN conditionné comme décrit précédemment16. Bien que cela ne soit pas obligatoire, les concentrations de Wnt-3A, de R-spondine et de caboche contenues dans le milieu conditionné peuvent être vérifiées à l’aide d’une trousse ELISA disponible dans le commerce en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Préparer les antibiotiques RPMI (RPMI-ABX), PBS-ANTIBIOTIQUES (PBS-ABX), PBS-Dithiothreitol (PBS-DTT), le tampon de digestion et les milieux organoïdes gastriques (voir le tableau supplémentaire 1 pour la composition détaillée). Le milieu organoïde gastrique est stable pendant 1 semaine à 4 °C.
- Pince autoclave, ciseaux à dissection fine et tubes de 1,5 ml.
- Commencez à décongeler la matrice de la membrane basale (Matrigel) sur de la glace.
- Commencez à décongeler le tampon de digestion et la trypsine-EDTA dans un bain-marie à 37 °C.
- Réglez un agitateur orbital d’incubateur à 37 °C et 200 tr/min.
2. Isolement des cellules individuelles du tissu de biopsie
- Prélever des biopsies gastriques lors d’une endoscopie haute17 en suivant le protocole clinique de l’établissement, impliquant probablement l’utilisation de pinces géantes. À l’aide d’une aiguille à bout émoussé, prélever des échantillons de tissus de la pince et les placer dans un tube conique de 15 ml contenant le milieu RPMI-ABX. Gardez le tube sur de la glace pour un transfert rapide au laboratoire.
REMARQUE : Au minimum, 2 à 4 biopsies doivent être prélevées. - Laissez le tissu de biopsie se déposer au fond du tube conique. À l’aide d’une pipette, aspirer le milieu et laver les biopsies deux fois avec 1 mL de tampon PBS-ABX. Il n’y a pas besoin de centrifugation, car les morceaux de tissu se déposent naturellement dans le tube conique.
- Transférez un minimum de 20 mg de tissu de biopsie dans un tube de 1,5 mL contenant 1 mL de PBS-DTT.
- Utilisez des ciseaux de dissection fins pour couper le tissu en morceaux de 1 à 2 mm ou moins.
- Utilisez une minicentrifugeuse de table pendant 15 s pour agréger les morceaux de tissu au fond du tube et aspirer autant de surnageant que possible. Un petit volume résiduel de PBS-TNT est acceptable.
- Ajouter 5 mL de tampon de digestion fraîchement réchauffé dans un tube conique de 50 mL. Pour transférer les petits morceaux de tissu sans perdre de tissu, prélevez 500 μL du tampon de digestion et ajoutez-le dans le tube de 1,5 mL contenant le tissu. Ensuite, modifiez l’embout d’un embout de pipette de 1000 μL avec des ciseaux pour augmenter le diamètre de l’embout, ce qui permet d’aspirer et de transférer facilement les morceaux de tissu dans le tube conique de 50 mL contenant le tampon de digestion.
- Incuber le tampon de digestion et le mélange tissulaire à 37 °C pendant 30 min avec agitation orbitale à 200 tr/min.
- Ajouter 5 mL de trypsine réchauffée avec 0,25 % d’EDTA dans le tampon de digestion et incuber pendant 10 min supplémentaires à 37 °C avec agitation orbitale à 200 tr/min.
- Neutraliser le tampon de digestion et la trypsine en ajoutant un volume égal de milieu Advanced (Adv.) DMEM/F12 et faire passer la solution à travers une passoire cellulaire de 70 μm.
- Granuler les cellules par centrifugation à 1400 x g pendant 4 min à 4 °C. Selon la taille initiale du tissu de biopsie, une pastille à petites cellules peut être visible ou non.
- Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de milieu Adv. DMEM/F12 et compter le nombre de cellules viables à l’aide de Trypan Blue et d’un hémocytomètre.
- Pulvériser à nouveau les cellules par centrifugation à 1400 x g pendant 4 min à 4 °C et retirer le surnageant.
REMARQUE : La figure 1 présente une représentation schématique du processus d’isolement des cellules individuelles du tissu de biopsie.
3. Intégration de cellules individuelles dans un « dôme » de matrice de membrane basale
- En fonction du nombre compté de cellules viables, calculer le volume de matrice de membrane basale nécessaire pour atteindre une concentration finale de 10à 5 cellules viables par 50 μL de matrice de membrane basale.
- Effectuez rapidement les opérations suivantes pour éviter que la matrice de la membrane basale ne polymérise avant le placage. Retirez la matrice de la membrane basale décongelée de la glace, ajoutez le volume de matrice de la membrane basale précédemment calculé dans les cellules et mélangez doucement en pipetant de haut en bas pendant environ 10 s.
REMARQUE : Il est crucial d’éviter de créer des bulles lors de cette étape. Ne pas diluer la matrice de la membrane basale. - Pipeter rapidement 50 μL d’aliquotes du mélange matrice membranaire/cellule de la membrane basale au centre des puits individuels dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits.
- Couvrez immédiatement la plaque à 24 puits et, d’un seul mouvement fluide, retournez la plaque à l’envers. Placez la plaque inversée dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C pendant 35 min pour permettre à la matrice de la membrane basale de polymériser.
REMARQUE : L’inversion de la plaque est essentielle pour empêcher les cellules de couler au fond de la plaque et pour permettre à la matrice de la membrane basale de polymériser en une forme de « dôme » 3D. - Ajouter 500 μL de milieu organoïde gastrique préchauffé dans chaque puits, en veillant à ce que le haut de chaque « dôme » soit complètement immergé dans le milieu. Distribuez le média sur le côté de chaque puits pour éviter de perturber le « dôme ».
- Changez le support tous les 2-3 jours.
4. Passage de routine d’organoïdes par fragmentation
- Une fois que les organoïdes sont prêts à être transportés, retirez le milieu de chaque puits désigné.
REMARQUE : Pour déterminer le moment approprié pour le passage, veuillez vous référer à la section Résultats représentatifs. - Distribuez 1 mL de média Adv. DMEM/F12 glacé directement sur un « dôme » de matrice membranaire basale. Cela devrait facilement initier la rupture du « dôme ». Continuez à aspirer et à distribuer jusqu’à ce que tous les fragments du « dôme » se détachent de la plaque.
- Transporter à la fois le milieu et la matrice de la membrane basale fragmentée vers le puits suivant, en répétant ce processus pour tous les puits destinés au passage. Après avoir désassemblé le « dôme » final de la matrice de la membrane basale, distribuer le milieu et le mélange d’organoïdes et de matrice de la membrane basale dans un tube de 1,5 ml.
- Fixez un embout de 1000 μL à une pipette P1000, puis insérez cet embout dans un embout de 200 μL. Cela permettra de créer une pointe de pipette d’un diamètre suffisamment petit pour fragmenter les organoïdes tout en permettant l’aspiration d’un volume plus important.
- Pipeter vigoureusement le mélange d’organoïdes et de matrice de membrane basale de haut en bas environ 25 fois pour fragmenter les organoïdes en petits morceaux.
- Centrifuger le mélange organoïde fragmenté à l’aide d’une centrifugeuse de table à 4 °C pendant 30 s à 2000 x g. Il en résultera une pastille d’organoïdes fragmentés séparés de la matrice et du milieu de la membrane basale. À l’aide d’une pipette, aspirer le milieu et le surnageant de la matrice de la membrane basale. N’utilisez pas d’aspirateur pour aspirer le surnageant, car la pastille est lâche.
- Calculer le volume de matrice de membrane basale fraîchement décongelée nécessaire pour que le nombre de puits/dômes soit divisé dans un rapport de 1 :2 (50 μL/dôme). Ajoutez la matrice de la membrane basale fraîche et pipetez doucement de haut en bas pour mélanger, en prenant soin d’éviter de créer des bulles.
- Aliquote rapidement 50 μL du mélange de fragments organoïdes et de matrice de membrane basale dans des puits individuels d’une plaque à 24 puits.
- Couvrez la plaque, retournez-la et placez-la dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C pendant 35 min pour permettre à la matrice de la membrane basale de polymériser.
- Ajouter 500 μL de milieux organoïdes gastriques préchauffés dans chaque puits.
NOTE : La figure 2 présente un aperçu schématique du passage des organoïdes dérivés de patients gastriques par fragmentation.
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Representative Results
Les résultats représentatifs ultérieurs sont dérivés de biopsies prélevées sur l’épithélium bénin du corps gastrique et de l’antre gastrique de l’estomac de cinq patients différents subissant une endoscopie haute. Deux à quatre « dômes » / puits ont été plaqués et analysés par patient pour les biopsies du corps gastrique et de l’antre. Des organoïdes ont été générés avec succès à partir du corps gastrique et du tissu de biopsie de l’antre gastrique des cinq patients. En moyenne, 41 organoïdes ont été analysés par « dôme » ou puits. Toutes les images sont des projections z acquises à l’aide d’un microscope confocal, et la quantification de la taille et de la sphéricité des organoïdes a été effectuée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
Les organoïdes sont généralement identifiables dans les 10 jours suivant l’ensemencement des cellules individuelles (figure 3A). Au jour 20, les organoïdes sont gros et doivent généralement être évacués. Bien que le nombre d’organoïdes qui se forment après l’ensemencement d’une cellule unique puisse être quelque peu variable, les résultats attendus pour le nombre d’organoïdes formés à partir de biopsies gastriques corporelles et antrales sont présentés à la figure 3B. Le nombre d’organoïdes corporels et antraux atteint son maximum au jour 10 après l’ensemencement. Bien qu’il ne soit pas significatif, le nombre total d’organoïdes commence à diminuer du jour 10 au jour 15 et du jour 15 au jour 20. Il semble y avoir une sous-population de petits organoïdes qui se forment au 10e jour, puis cessent de croître et meurent au cours des 10 jours suivants, ce qui expliquerait cette tendance. Il est important de noter qu’il est démontré que le nombre d’organoïdes formés à partir du tissu de biopsie antral est significativement plus élevé que le tissu de biopsie du corps aux jours 10, 15 et 20. Le nombre d’organoïdes antraux formés était en moyenne 2 fois plus élevé que le nombre d’organoïdes formés à partir du corps.
La figure 3C présente des résultats représentatifs de la croissance des organoïdes après l’ensemencement d’une cellule unique entre le jour 10 et le jour 20. Alors que les organoïdes provenant de biopsies antrales et corporelles ont connu une croissance régulière du 10e au 20e jour, les organoïdes générés à partir de tissus de biopsie antrale ont affiché un taux de croissance plus élevé que les organoïdes générés à partir de tissus de biopsie corporelle. En particulier, les organoïdes antraux avaient une surface près de 4 fois plus grande que les organoïdes corporels au jour 20.
Chez différents patients, une diversité de morphologie organoïde est généralement observée dans un seul « dôme » ou puits (Figure 4A). Certains organoïdes sont plus ronds ou sphériques tandis que d’autres présentent une morphologie plus irrégulière. Cependant, en moyenne, la sphéricité, une mesure de la sphérie d’un organoïde (où un score de 1 = une sphère parfaite)18, a montré peu de variation à l’intérieur et entre les organoïdes générés à partir de tissus de biopsie corporelle ou antrale (Figure 4B). Par conséquent, bien qu’il existe des taux de croissance différents, il n’y a généralement pas de différences morphologiques significatives entre les organoïdes générés à partir de tissu de biopsie du corps gastrique ou de l’antre.
Au 20e jour après l’initiation, les organoïdes gastriques sont généralement prêts à être évacués. Une grande taille d’organoïde (≥1500 μm de diamètre) ou un intérieur sombre (suggérant un renouvellement cellulaire important) de l’organoïde sont des signes clés que les organoïdes doivent être évacués (Figure 5A). Les organoïdes laissés à aller au-delà de ce point peuvent commencer à se décomposer en monocouches 2D (Figure 5B) qui ne reforment pas de manière fiable les organoïdes après le passage, ce qui indique peut-être une perte de viabilité ou de tige. Après le passage et le réensemencement des organoïdes gastriques à l’aide du protocole de fragmentation décrit ici, les « dômes » contiendront de nombreux fragments d’organoïdes (Figure 5C) qui se réorganiseront en beaucoup plus d’organoïdes et se développeront beaucoup plus rapidement que l’ensemencement initial de cellules individuelles (Figure 5D). Si la croissance des organoïdes a encore besoin d’être caractérisée et/ou normalisée au moment du passage, les organoïdes gastriques peuvent être digérés en cellules individuelles, comme décrit précédemment19.
Figure 1 : Génération d’organoïdes dérivés de patients gastriques. Vue d’ensemble schématique décrivant le processus de génération d’organoïdes dérivés de patients gastriques à partir de biopsies d’épithélium gastrique bénin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Passage d’organoïdes dérivés de patients gastriques. Vue d’ensemble schématique illustrant le passage d’organoïdes dérivés de patients gastriques par fragmentation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Formation et croissance d’organoïdes dérivés de l’estomac chez le patient. (A) Images représentatives de projection z montrant la croissance des organoïdes gastriques aux jours 10, 15 et 20 après l’ensemencement d’une cellule unique. Les images sont des organoïdes générés à partir de tissus de biopsie du corps gastrique et de l’antre du même patient. Barre d’échelle = 1 mm. (B) Nombre moyen (±ET) d’organoïdes du corps gastrique et de l’antre aux moments indiqués après l’ensemencement d’une cellule unique. (C) Aire moyenne (±ET) (μm2) des organoïdes du corps gastrique et de l’antre aux moments indiqués après l’ensemencement unicellulaire. n = 5 patients par groupe et par période. * = différence statistiquement significative (p ≤ 0,05) au moment indiqué. n.s. = pas de différence statistiquement significative au moment indiqué. Comparaisons statistiques réalisées par ANOVA à 2 facteurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Morphologie des organoïdes dérivés du patient gastrique. (A) Images représentatives par projection z de différentes morphologies d’organoïdes gastriques à partir d’un « dôme » individuel / puits d’organoïdes dérivés du corps gastrique au jour 15 après l’ensemencement d’une cellule unique. Barre d’échelle = 200 μm. (B) Moyenne (±écart-type) du corps gastrique et de la sphéricité organoïde de l’antre (où une valeur de 1 = une sphère parfaite). n = 5 patients par groupe et par période. n.s. = aucune différence statistiquement significative à un moment donné. Comparaisons statistiques réalisées par ANOVA à 2 facteurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Passage d’organoïdes dérivés d’un patient gastrique. (A) Image représentative d’organoïdes prêts à être mis en circulation au jour 20 après l’ensemencement d’une cellule unique. (B) Image représentative des organoïdes en retard de passage au jour 25 après l’ensemencement unicellulaire. (C) Image représentative d’organoïdes fragmentés après réensemencement (Passage 1 - Jour 0). (D) Image représentative de la croissance des organoïdes sur une période de 5 jours après le réensemencement (Passage 1 - Jour 5). Toutes les images sont des projections z. Barres d’échelle = 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau supplémentaire 1 : Solutions et recettes de milieux. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Dans ce document, un protocole détaillé pour générer de manière fiable des organoïdes gastriques humains à partir de cellules uniques isolées à partir de biopsies d’épithélium bénin du corps gastrique et de l’antre est décrit. Les étapes critiques du protocole tournent autour de la synchronisation ainsi que de la manipulation de la matrice de la membrane basale. Pour préserver la viabilité, il est essentiel d’initier le protocole le plus tôt possible après l’acquisition du tissu de biopsie. L’objectif est de commencer à digérer le tissu de la biopsie dans les 30 minutes suivant la biopsie. La manipulation de la matrice de la membrane basale peut également être difficile. Lorsqu’il est décongelé sur de la glace, il reste liquide ; cependant, à des températures supérieures à 4 °C, il polymérise. Par conséquent, le transfert rapide de la matrice de la membrane basale de la glace pour le mélanger à des cellules individuelles ou à des fragments organoïdes pour le placage de « dômes » doit être effectué rapidement, car il commence à polymériser en une minute. Une fois qu’il a polymérisé dans un tube, il ne peut pas être aspiré dans un embout de pipette. Si cela se produit, le tube peut être placé sur de la glace jusqu’à ce que le Matrigel se dépolymérise à nouveau en liquide. Lors du pipetage doux de haut en bas pour mélanger des cellules individuelles ou des fragments organoïdes avec la matrice de la membrane basale, il est également crucial d’éviter de créer des bulles. Bien que les bulles dans un « dôme » de matrice de membrane basale ne semblent pas entraver la formation et la croissance des organoïdes, elles peuvent obstruer la visualisation. De plus, après avoir aliquoté la matrice de la membrane basale et le mélange cellulaire dans le(s) puits(s) d’une plaque de culture cellulaire, la plaque doit être inversée et placée dans un incubateur. Cette étape est essentielle pour permettre à la matrice de la membrane basale de polymériser en forme de « dôme » 3D et d’empêcher les cellules individuelles ou les fragments d’organoïdes de couler au fond de la plaque.
Grâce à ce protocole, les organoïdes gastriques peuvent être identifiés dans les 10 jours suivant l’ensemencement d’une seule cellule. L’expérience montre que très peu de nouveaux organoïdes gastriques se forment au-delà du jour 10 et, en fait, le nombre total d’organoïdes peut légèrement diminuer du jour 10 au jour 20. Cela est vrai pour les organoïdes générés à la fois par le corps gastrique et l’antre. Cependant, le nombre total d’organoïdes formés à partir de biopsies antrales gastriques est significativement plus élevé que lors de biopsies gastriques du corps. De plus, la croissance des organoïdes antraux dépasse largement celle des organoïdes corporels entre le 10e et le 20e jour après l’ensemencement d’une seule cellule. Cette différence peut être attribuée à des variations de sensibilité Wnt. Une étude récente a démontré que les AOP du corps gastrique présentent une meilleure croissance avec une activation Wnt plus faible, tandis que les PDO de l’antre gastrique se développent avec une activation Wnt plus élevée20. L’emplacement des biopsies gastriques utilisées pour générer des AOP gastriques n’est généralement pas spécifié dans la littérature. De telles différences devraient être prises en compte dans les études futures utilisant des PDO gastriques générées à partir de biopsies gastriques de différentes zones de l’estomac.
Un autre aspect crucial de ce protocole est l’établissement d’un nombre standardisé de cellules individuelles à ensemencer par « dôme » / puits pour générer de manière fiable des AOP gastriques. Alors qu’une étude antérieure a rapporté un nombre standardisé de glandes gastriques à ensemencer pour la génération de PDO, aucune étude antérieure utilisant une méthode de digestion à cellule unique n’a mentionné le nombre de cellules ensemencées ou si le nombre était cohérent entre les différentes lignées PDO. Si l’on ne normalise pas le nombre de cellules ensemencées, on peut avoir un nombre très variable de cellules souches ensemencées par « dôme » ou puits. Étant donné que les cellules souches sont la principale source de formation d’organoïdes gastriques, cela pourrait entraîner des taux variables de formation et de croissance d’organoïdes. Par conséquent, l’utilisation d’un nombre non normalisé de cellules uniques pourrait confondre les interprétations des comparaisons de formation ou de croissance entre différentes lignées gastriques PDO. Ici, il est démontré que la standardisation du nombre de cellules ensemencées à 105 cellules par « dôme » / puits génère de manière fiable des AOP gastriques à partir de biopsies du corps et des régions antrales de l’estomac.
Ce protocole a été optimisé pour l’utilisation de tissus de biopsie gastrique frais. Par conséquent, le succès de ce protocole peut varier lors de l’utilisation de tissus congelés ou conservés par d’autres moyens. De plus, il n’y a pas de données sur la durée pendant laquelle les biopsies fraîches maintiennent la viabilité, car le tissu de la biopsie est traité dès que possible après le retrait de l’estomac d’un patient. On peut supposer que plus le tissu frais reste longtemps avant d’être traité, moins il y aura de cellules viables isolées.
Le passage des PDO gastriques par fragmentation, tel que décrit dans ce protocole, fournit une méthode facile pour le passage de routine. Bien que les AOP gastriques aient été passées avec succès jusqu’à 4 fois à l’aide de cette technique, il n’y a eu aucune tentative pour déterminer combien de fois elles peuvent être passées tout en maintenant une croissance et une viabilité stables. Certains rapports indiquent que la croissance des organoïdes gastriques peut ralentir après 5 passages ou plus 21,22, tandis que d’autres ont observé une croissance fiable jusqu’à 10 passages23.
Le milieu organoïde gastrique utilisé dans ce protocole contient du Wnt-3A, de la caboche et de la R-spondine dérivés de milieux conditionnés de cellules L-WRN. Pour produire les milieux conditionnés, un protocole décrit par Miyoshi et Stappenbeck est utilisé16. Alternativement, Wnt-3A, la caboche et la R-spondine peuvent être achetées séparément en tant que protéines recombinantes. L’achat des composants individuels séparément est idéal pour éviter les effets de lot potentiels qui peuvent survenir lors de l’utilisation de fluides conditionnés à partir de cellules L-WRN. Cependant, l’achat des protéines recombinantes est coûteux et peut être prohibitif pour les chercheurs qui travaillent fréquemment avec des organoïdes.
Compte tenu de l’utilisation croissante des AOP gastriques dans diverses applications, il est opportun et nécessaire d’établir des approches normalisées pour générer des AOP gastriques bénignes. Le protocole décrit ici offre une méthode fiable pour les investigations futures utilisant des PDO gastriques. D’après notre expérience, ce protocole a permis de générer avec succès des organoïdes à partir de biopsies de muqueuse gastrique bénigne dans plus de 90 % des cas.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas de divulgations pertinentes.
Acknowledgments
Médecine génomique de l’Université de Pennsylvanie T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), programme Men & BRCA au Basser Center for BRCA (KHB, BWK), bourse de la Fondation de la famille DeGregorio (BWK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
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