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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Imagem de cálcio vivo de monocamadas organoides intestinais humanas infectadas por vírus usando indicadores de cálcio codificados geneticamente

Published: January 19, 2024 doi: 10.3791/66132
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research, Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine

Summary

Este protocolo descreve uma abordagem para a realização de imagens de cálcio em organoides intestinais humanos infectados por vírus e oferece uma abordagem para análise.

Abstract

A sinalização de cálcio é um regulador integral de quase todos os tecidos. Dentro do epitélio intestinal, o cálcio está envolvido na regulação da atividade secretora, dinâmica da actina, respostas inflamatórias, proliferação de células-tronco e muitas outras funções celulares não caracterizadas. Como tal, o mapeamento da dinâmica de sinalização do cálcio dentro do epitélio intestinal pode fornecer informações sobre os processos celulares homeostáticos e revelar respostas únicas a vários estímulos. Os organoides intestinais humanos (HIOs) são um modelo de alto rendimento, derivado do ser humano, para estudar o epitélio intestinal e, portanto, representam um sistema útil para investigar a dinâmica do cálcio. Este artigo descreve um protocolo para transduzir HIOs de forma estável com indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs), realizar microscopia de fluorescência ao vivo e analisar dados de imagem para caracterizar significativamente os sinais de cálcio. Como um exemplo representativo, HIOs 3-dimensionais foram transduzidos com lentivírus para expressar de forma estável GCaMP6s, um GECI citosólico baseado em proteína fluorescente verde. Os HIOs projetados foram então dispersos em uma suspensão de célula única e semeados como monocamadas. Após a diferenciação, as monocamadas de HIO foram infectadas com rotavírus e/ou tratadas com drogas conhecidas por estimular uma resposta de cálcio. Um microscópio de epifluorescência equipado com uma câmara de imagem viva umidificada e com temperatura controlada permitiu a obtenção de imagens de longo prazo de monocamadas infectadas ou tratadas com drogas. Após a aquisição de imagem, as imagens adquiridas foram analisadas usando o software de análise disponível gratuitamente, ImageJ. De modo geral, este trabalho estabelece um pipeline adaptável para caracterizar a sinalização celular em HIOs.

Introduction

O cálcio é um segundo mensageiro amplamente conservado que desempenha um papel crítico na regulação da fisiologia celular1. Dada a sua forte carga, tamanho pequeno e alta solubilidade em condições fisiológicas, o cálcio é um manipulador ideal da conformação proteica. Isso torna o cálcio um meio poderoso para transduzir sinais eletroquímicos em alterações enzimáticas, transcricionais ou pós-transcricionais. Os rígidos gradientes de concentração de cálcio através do retículo endoplasmático (RE) e membranas plasmáticas criam uma alta força motriz que permite mudanças rápidas na concentração citosólica de cálcio. Vários mecanismos, incluindo buffering e transporte ativo, mantêm firmemente esse gradiente. Embora necessária para as funções celulares normais, essa manutenção é energeticamente cara, tornando-a particularmente suscetível em estados de estresse 2.

Como tal, a desregulação do cálcio dentro do citosol é um sinal quase universal de muitos tipos de estresse celular. Distúrbios metabólicos, toxinas, patógenos, danos mecânicos e perturbações genéticas podem interromper a sinalização do cálcio. Independentemente do estímulo, em nível de células inteiras, elevações sustentadas e descontroladas do cálcio citosólico podem promover apoptose e, eventualmente, necrose 3,4. Alterações nos níveis citosólicos de cálcio de menor amplitude ou maior frequência, entretanto, têm efeitos variáveis2. Da mesma forma, os resultados das flutuações do cálcio podem diferir com base no microdomínio espacial em que ocorrem5. O monitoramento dos níveis de cálcio pode, portanto, oferecer informações sobre processos dinâmicos de sinalização, mas isso requer amostragem com resolução temporal e espacial relativamente alta.

Indicadores de cálcio codificados geneticamente (GECIs) são ferramentas poderosas para amostragem contínua em sistemas de células vivas6. Algumas das GECIs mais utilizadas são as proteínas fluorescentes responsivas ao cálcio baseadas em GFP, conhecidas como GCaMPs7. A GCaMP canônica é uma fusão de três domínios proteicos distintos: uma GFP circularmente permutada (cpGFP), calmodulina e M136. O domínio da calmodulina sofre uma mudança de conformação ao se ligar ao cálcio, permitindo sua interação com M13. A interação calmodulina-M13 induz uma mudança conformacional na cpGFP que aumenta sua emissão fluorescente após excitação. Como tal, um aumento na concentração de cálcio correlaciona-se com um aumento na intensidade de fluorescência do GCaMP. Esses sensores podem ser citosólicos ou direcionados para organelasespecíficas8.

Semelhante à maioria dos tecidos, o cálcio regula uma variedade de funções dentro do epitélio gastrointestinal. O epitélio intestinal é essencial para a absorção de nutrientes e fluidos, mas também deve formar uma barreira apertada e interface imunológica para evitar a invasão de patógenos ou insultos tóxicos. As vias dependentes de cálcio influenciam quase todas essas funções vitais 9,10,11. No entanto, a sinalização do cálcio dentro do epitélio intestinal permanece uma fronteira pouco explorada com potencial promissor como alvo terapêutico. Enquanto o monitoramento da dinâmica do cálcio no epitélio intestinal in vivo continua a apresentar desafios, os organoides intestinais humanos (HIOs) oferecem um sistema ex vivo adaptável para experimentação12. As HIOs são esferoides tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco intestinais humanas e, ao serem diferenciadas, recapitulam grande parte da diversidade celular do epitélio intestinal nativo12.

Este protocolo descreve métodos abrangentes para projetar HIOs que expressam GECIs e, em seguida, preparar HIOs projetados como monocamadas para imagens de cálcio de células vivas. Ele oferece a infecção viral como um exemplo de manipulação patológica que interrompe a sinalização de cálcio e fornece uma abordagem analítica para quantificar essas alterações.

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Protocol

Todos os organoides intestinais humanos (HIOs) utilizados neste protocolo e os experimentos representativos foram derivados de tecido humano obtido e mantido pelo Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core. Todas as amostras foram coletadas de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Baylor College of Medicine.

1. Preparação de materiais e reagentes

  1. Para manutenção dos organoides, coletar placas de 24 poços tratadas com cultura celular, matriz de membrana basal (BMM), tubos cônicos de 15 mL e tubos cônicos de 1,5 mL.
    1. Para preparar meios completos sem fatores de crescimento (CMGF-), a 500 mL de DMEM F12 avançado adicionar 5 mL de 1M HEPES, 5 mL de 100x antibiótico-antimicótico, 5 mL de suplemento de glutamina 100x.
    2. Para preparar os meios contendo Wnt, R-spondina e Noggin (WRNE), misture partes iguais de meios condicionados com CMGF e Wnt, adicione meio condicionado com Noggin, 10% em volume, meio condicionado com R-espondina, 20% em volume, fator de crescimento epidérmico humano de 50 ng/mL, nicotinamida 10 mM, [Leu15]-Gastrina I 10 nM, A-83-01 nM, SB202190 de 10 μM, 1x suplemento B27, 1x suplemento de N2 e 1 mM de N-acetilcisteína.
  2. Para transdução lentiviral, preparar Soro Fetal Bovino (SFB), Tripsina-EDTA 0,05% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) 1x, CMGF- com 10% FBS, Estéril 1x PBS, Polibreno, 10 μM Y-27632, Lentivírus, WRNE Alto Wnt + 10 μM Y-27632
  3. Para gerar monocamadas organoides, preparar lâmina de cultura celular de 10 poços com fundo de vidro, FBS, Colágeno IV (1 mg/mL em (di)H2O desionizado), matriz de membrana basal, EDTA 0,5 mM em 1x PBS, EDTA 5 mM em 1x PBS, tampão de dissociação enzimática, CMGF- com 10% FBS, WRNE + 10 μM Y-27632.
  4. Para infecção viral de monocamadas organoides, preparar tripsina, estoque de rotavírus, CMGF-, agulha 25G, Sterile 1x PBS e meios de diferenciação livres de fenol vermelho.
    1. Para preparar o meio de diferenciação livre de vermelho fenólico, tomar 500 mL de meio de cultura de células livres de vermelho fenol, adicionar 5 mL de aminoácidos não essenciais 100x MEM, 5 mL de 100x L-Glutamina, 5 mL de piruvato de sódio 100 nM e 7,5 mL de HEPES 1M.
  5. Para coloração por imunofluorescência de organoides, preparar formaldeído a 4% (formaldeído a 16% diluído em 1x PBS), Triton X-100 (Triton X-100 a 0,1% em 1x PBS), albumina de soro bovino (albumina de soro bovino a 3% em 1x PBS), solução de NH4Cl (50 mM), DAPI (1 μg/mL de solução DAPI em 1x PBS).

2. Engenharia de organoides para expressar sensores de cálcio codificados geneticamente

NOTA: Este protocolo descreve os passos para transduzir um único poço de organoides intestinais humanos tridimensionais plaqueados em 30 μL de Matriz de Membrana Basal (BMM) em uma placa de 24 poços13. A maioria das linhas conterá cerca de 400.000 células por poço. Um segundo poço, não transduzido, deve ser incluído como controle. Mantenha todos os reagentes e suspensões celulares no gelo.

  1. Após 2-5 dias da última passagem, remova o meio WRNE de manutenção de dois poços de HIOs. Substitua por 300 μL de 0,05% de tripsina-EDTA por poço e pipete suavemente para cima e para baixo 5x para separar o BMM da placa. Colocar numa incubadora a 37 °C durante 4 min.
  2. Adicionar 500 μL de CMGF- + 10% FBS por poço. Pré-revestir uma ponta de pipeta de baixa ligação de 1 mL com FBS pipetando 1 mL de FBS para cima e para baixo 2x. O FBS pode ser reutilizado em várias pontas. Com a ponta pré-revestida, pipetar os HIOs para cima e para baixo 10x.
  3. Transfira o conteúdo de cada poço para seu próprio tubo de microcentrífuga pré-revestido de 1,5 mL. Enxaguar cada poço com mais 500 μL de CMGF- e adicionar a lavagem ao respectivo tubo.
  4. Centrifugar os tubos a 100 x g em uma centrífuga de balde oscilante por 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante e qualquer BMM residual.
  5. Ressuspender em 1 mL de PBS 1x. Divida cada tubo em dois tubos de microcentrífuga para 4 tubos totais. Centrifugar os tubos a 100 x g durante 5 minutos a 4 °C. Remover sobrenadante.
  6. Ressuspender cada tubo uma vez adicional em 1x PBS e centrifugar a 100 x g por 5 min a 4 °C.
  7. Preparar 400 μL de meio de transdução e meio controle (Tabela 1). Ressuspender 2 tubos em 200 μL do meio controle e 2 tubos em 200 μL do meio de transdução.
  8. Incubar em estufa de cultura celular a 37 °C durante 24 horas. Ressuspenda pipetando para cima e para baixo com uma ponta revestida periodicamente (por exemplo, 2 h pós-transdução (hpt), 12 hpt, 18 hpt) para incentivar a transdução uniforme.
  9. Após 24 h, tubos de centrifugação a 100 x g por 5 min a 4 °C. Remover sobrenadante.
  10. Ressuspenda o pellet em 500 μL de 1x PBS para lavar. Centrifugar a 100 x g durante 5 min a 4 °C. Remover sobrenadante.
  11. Usando uma ponta de pipeta gelada de 200 μL, ressuspenda cada um dos 4 pellets em 30 μL de BMM. Pipetar suavemente para cima e para baixo para dispersar uniformemente.
  12. Coloque o conteúdo de cada tubo em seu próprio poço em uma placa de 24 poços. Incubar durante 10 min a 37 °C para permitir que o BMM se solidifique antes de adicionar 500 μL de HighWnt WRNE + 10μM Y-27632.
  13. Permitir que os HIOs transduzidos cresçam por 1 semana, atualizando a mídia (HighWnt WRNE + 10 μM Y-27632) a cada dois dias. Após 1 semana, verificar a expressão do indicador fluorescente por microscopia. Se o sinal for forte, comece a seleção de drogas. Se o sinal for fraco, repita a transdução conforme descrito acima.
  14. Uma vez estabelecida a linha, verifique a função do indicador de fluorescência via tratamento agonista. O ADP 100nM é um agonista confiável para validação do GCaMP. Teste organoides 3D para validação inicial, conforme descrito abaixo.
    1. Após uma passagem, pranche um poço (ou múltiplo) de organoides em BMM em uma placa de fundo de imagem separada. Placa os organoides em cerca de 1/3 da densidade normal para evitar sobreposição excessiva durante a imagem. Não continue a passar por esses HIOs após o tratamento com agonistas, pois é difícil garantir a esterilidade.
    2. Aguarde 2-3 dias para que os HIOs se recuperem após a passagem. Antes da aquisição de imagens, mude o meio para o meio de diferenciação livre de fenol vermelho.
    3. Usando um microscópio fluorescente, montou uma corrida de 3 minutos com imagens adquiridas a cada 5 s usando excitação de 488 nm e um conjunto de filtros FITC/GFP. Após 30 s de imagem, adicione 100 nM ADP ou controle do veículo. Continue a criação de imagens até que o sinal retorne à linha de base próxima, ~2 min. Um aumento transitório de ~2 vezes na fluorescência do GCaMP com tratamento com ADP indica transdução bem-sucedida e função do biossensor. Para uma estimativa mais precisa da eficiência da transdução, repita o teste agonista com imagens usando monocamadas geradas através do processo descrito na parte 3.

3. Preparação de monocamadas HIO para imagens de fluorescência ao vivo

  1. Revestir todos os poços de uma lâmina de câmara inferior de imagem de 10 poços com Colágeno IV. Para isso, misture 34 μL de 1 mg/mL de Colágeno IV com 960 μL de água deionizada estéril. Adicionar 95 μL de solução de colágeno IV diluída a cada poço e incubar a 37 °C por 0,5-2 h.
  2. Remova o meio de manutenção WRNE de 4 poços de HIOs 3D. HIOs devem ser 5-7 dias a partir de sua última passagem.
    NOTA: 1 placa de 10 poços normalmente requer ~1,25 x 106 células. Isso normalmente requer 2-4 poços de HIOs 3D banhados em 30 μL de BMM cada, mas varia de acordo com a densidade.
  3. Adicionar 500 μL de 1x PBS + 0,5 mM EDTA por poço. Com uma ponta pré-revestida de 1 mL, pipete para cima e para baixo suavemente para desprender o BMM da placa. Transfira a suspensão para um tubo cônico pré-revestido de 15 mL, combinando como poços no mesmo tubo.
  4. Enxaguar cada poço com 500 μL adicionais de PBS + 0,5 mM EDTA. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante e o BMM residual.
  5. Usando uma ponta pré-revestida, ressuspenda o pellet restante em 3 mL de PBS + 5 mM EDTA (note que isso é 10x mais EDTA do que a primeira lavagem).
  6. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante e o BMM residual. Ressuspender o pellet em 2 mL de tampão de dissociação enzimática.
  7. Incubar em esferas a 37 °C/banho-maria durante 5 min. Adicione 3 mL de CMGF- + 10% FBS e pipetar suavemente para misturar.
  8. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Remova o sobrenadante. Adicionar 1 mL de CMGF-.
  9. Pipete vigorosamente para cima e para baixo com uma ponta pré-revestida 80x-100x para quebrar mecanicamente HIOs em células únicas. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C. Remover sobrenadante.
  10. Ressuspender em 1 mL de WRNE + 10 μM Y-27632. Obter uma contagem de células para a suspensão de 1 mL.
  11. Diluir a suspensão celular com WRNE + 10μM Y-27632 para atingir uma concentração de 1,25 x 105 células/100 μL (1,25 x 106 células/mL).
  12. Usando uma pipeta de 200 μL, remova a solução de colágeno da placa preparada na etapa 1, pois o colágeno já se instalou no fundo do poço. Evite tocar o fundo do poço com a ponta da pipeta.
  13. Usando uma ponteira de pipeta pré-revestida de 200 μL, adicionar 100 μL da solução celular da etapa 3.11 (1,25 x 105 células) por poço.
  14. Incubar durante 24 h numa estufa de cultura celular a 37 °C. Após 24 h, retirar o meio de cultura de todos os poços e substituí-lo por 100 μL de meio de diferenciação por poço.
    OBS: Neste ponto, as células devem estar aderidas à placa. Observe que a monocamada provavelmente não será confluente ou totalmente plana.
  15. Coloque a lâmina de volta na incubadora de cultura de células a 37 °C. Atualizar o meio de diferenciação a cada 24 h até que a monocamada seja confluente. Isso geralmente requer 3-5 dias de chapeamento. Após esse ponto, as monocamadas estão prontas para aplicações downstream.

4. Infecção viral das monocamadas HIO

  1. Prepare o inóculo do vírus. Se necessário, a tripsina ativa o estoque de vírus. Para rotavírus, adicionar 10 μg/mL de tripsina de Worthington aos estoques de vírus e incubar a 37 °C por 1 h.
    1. Dilua o estoque de vírus ativado usando um dos dois métodos a seguir.
      1. Se almejar o número máximo de células infectadas usando apenas uma cepa viral, misture 50 μL do estoque viral ativado com 50 μL de CMGF-.
      2. Se comparar múltiplas cepas, prepare os inóculos para alcançar multiplicidades equivalentes de infecção (MOIs). Use a fórmula a seguir para determinar o volume de estoque de vírus por poço necessário para o MOI desejado. Adicione CMGF- ao volume de estoque de vírus calculado para atingir um volume final de 100 μL por poço.
        Equation 1
        NOTA: Uma única monocamada HIO banhada em um poço com um diâmetro de 5,46 mm (placa de 96 poços) contém cerca de 200.000 células. Devido à baixa eficiência da infecção em monocamadas, um alto MOI (100-1 milhão de partículas virais por célula) é preferível. O MOI ótimo deve ser determinado empiricamente.
    2. Infecte as monocamadas removendo suavemente o meio da monocamada HIO usando uma pipeta de 200 mL. Substitua por 100 mL de inóculo viral ou inóculo simulado.
      1. Como a maioria dos estoques de rotavírus é propagada em células MA104, use um lisado celular MA104 não infectado para o inóculo simulado. Use um volume equivalente ao volume de estoque de vírus usado para os poços infectados e adicione CMGF- para um volume final de 100 mL por poço.
      2. Para vírus que infectam células basolateralmente, como o rotavírus14, use uma agulha 25G para pontuar a monocamada. É mais fácil fazer uma única pontuação em todo o comprimento da monocamada, da base ao topo do poço. Pressione suavemente a agulha na monocamada em um ângulo com o bisel para cima, oposto à direção do movimento, e arraste-a por todo o comprimento da monocamada para criar uma cicatriz (Figura 2A).
    3. Incubar numa incubadora a 37 °C durante 2 h. Remova o vírus e simule o inóculo. Lave as monocamadas uma vez com 1x PBS.
    4. Adicionar 100 μL de meio de diferenciação livre de fenol vermelho. Coloque o slide em uma incubadora de 37 °C até que esteja pronto para a imagem. A janela de imagem ideal variará com base na cinética da infecção viral. Para rotavírus, comece a imagem em 6-8 h após a infecção.

5. Ca2+ Imagem de monocamadas infectadas

  1. Pré-aqueça a incubadora de topo de estágio a 37 °C. Executar CO2 umidificado a 0,02 L/min. Coloque a lâmina com as monocamadas infectadas na câmara da incubadora e sele a tampa.
  2. Usando iluminação de campo brilhante (BF) e uma objetiva de 20x, selecione as coordenadas X e Y dos campos de visão dentro da monocamada que será fotografada. É melhor selecionar pontos com a região marcada em vista, pois a maioria das células infectadas estará perto do arranhão.
  3. Otimize os parâmetros de imagem e adquira uma imagem usando excitação de 488 nm. Para minimizar a fototoxicidade, ajuste a fonte de luz para 50% de potência com um tempo de exposição de 50 ms. Os parâmetros de aquisição apropriados podem variar e devem ser otimizados através da aquisição múltipla de aquisições. Verifique se nenhum pixel está saturado. Ajuste o tempo de exposição e a potência da luz conforme necessário para garantir que toda a faixa dinâmica do sensor de cálcio fluorescente possa ser detectada.
  4. Se estiver usando outros fluoróforos (por exemplo, vírus marcados fluorescentemente), repita a otimização nesses canais. Configure o loop de imagem e adquira uma imagem de 488 nm em cada coordenada X, Y selecionada em um loop de 1 min. Imagine esse loop continuamente. Ao usar um vírus marcado fluorescentemente, adquira uma imagem no canal apropriado a cada 10º loop (ou seja, 1 imagem/10 min).
  5. Colete imagens por ~18 h. Se estiver usando vírus sem etiquetas fluorescentes, fixe monocamadas e realize coloração de imunofluorescência para identificar células infectadas. Execute isso depois de concluir a execução da imagem, conforme descrito abaixo.
    1. Remova o meio de imagem e substitua por 100 μL de formaldeído a 4% em PBS 1x. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min.
    2. Remova o fixador e tempere com 100 μL de 50mM NH4Cl por 10 min. Remova NH4Cl. Permeabilize as monocamadas com 100 μL de Triton X-100 a 0,1% em 1x PBS por 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 °C.
    3. Remova o tampão de permeabilização. Bloquear com 100 μL de albumina de soro bovino a 3% em PBS 1x por 1 h.
    4. Remova a solução de bloqueio. Adicionar anticorpos primários diluídos na concentração recomendada/otimizada em 1x PBS. Adicionar 100 μL de solução de anticorpos por poço.
    5. Incubar durante a noite a 4 °C com balanço suave. Remover anticorpos primários. Lave 3x com 1x PBS.
    6. Adicionar anticorpos secundários conjugados a fluorescência diluídos na concentração recomendada/otimizada em 1x PBS. Adicionar 100 μL por poço. Incubar durante 2 h à temperatura ambiente.
      NOTA: FPBase15 é um ótimo recurso para ajudar a selecionar secundários que evitarão sangria durante a multiplexação. A maioria dos secundários é eficaz em uma diluição de 1:1000 em 1x PBS.
    7. Remover anticorpos secundários. Fazer uma solução DAPI de 1 μg/mL em 1x PBS e adicionar 100 μL por poço. Incubar por 20 min. Lave 3x com 1x PBS.
    8. Mantenha as monocamadas fixas em 100 μL de 1x PBS para obtenção de imagens. Coloque a lâmina de volta no palco do microscópio, recarregue as coordenadas X e Y da imagem ao vivo e obtenha imagens de cada multiponto no canal que corresponde ao anticorpo secundário que foi usado para coloração. Faça referência às imagens da execução de imagens ao vivo para garantir que os mesmos pontos sejam capturados.

6. Quantificação das ondas de cálcio intercelulares

  1. Certifique-se de que Fiji é Just ImageJ (FIJI) está instalado com os seguintes plug-ins: Bio-Formats (deve ser pré-instalado em FIJI, mas não estará no ImageJ); Livro de receitas: Para instalar, no menu FIJI, vá para Ajuda > atualizações > Gerenciar sites de atualização. Confira o livro de receitas. Reinicie o FIJI.
  2. Divida o arquivo de dados da execução de imagens ao vivo em vários arquivos, separando cada coordenada X, Y. No Nikon NES Elements, selecione Arquivo > Importar/Exportar > Dividir Multipontos. Selecione uma pasta para exportação e um prefixo apropriado.
  3. Abra FIJI. Carregue um único arquivo a partir dos multipontos divididos. Se estiver usando uma imagem multicanal, divida os canais. Selecione a janela com as imagens do canal de 488 nm (GCaMP).
  4. Execute a função DeltaF Up para determinar a alteração em cada valor de pixel de um ponto de tempo para o próximo. Para fazer isso, selecione Livro de receitas > funções T > Delta F Up.
  5. Percorra a pilha até encontrar uma imagem com uma onda de cálcio. Com a onda de cálcio em exibição, defina um limite clicando em Imagem > Ajustar > Limite. Ajuste o limite inferior para minimizar a quantidade de sinal que não faz parte da onda que a faz passar do limite. Para imagens de 16 bits adquiridas usando os parâmetros descritos acima, comece com um limite inferior de 600 e ajuste conforme necessário.
  6. Execute o analisador de partículas para segmentar ondas clicando em Analisar > Analisar partículas. Defina o tamanho mínimo da onda em μm2 ajustando o intervalo. Ele é definido como 0-infinito na linha de base. Para imagens de células MA104 adquiridas usando uma objetiva de 20x, comece aumentando o limite inferior para 10.000 μm2 e ajuste conforme apropriado.
  7. Marque as caixas Exibir resultados e Limpar resultados. No menu suspenso "Mostrar", selecione Contornos e clique em OK. Isso deve resultar em 2 saídas: Uma janela, Resultados, listará cada onda detectada, a área da onda e seus valores de intensidade média, mínima e máxima (com base no delta F). A outra janela, intitulada Desenho de [nome do arquivo], incluirá uma nova pilha com os contornos de ondas segmentadas. Use isso para verificar a detecção de onda. Ajuste os valores de limite e o intervalo de tamanho, se necessário, e verifique novamente as chamadas de onda.
  8. Para processamento em lote, use o script de macro incluído (Arquivo de codificação suplementar 1). Para utilizar isso, siga as etapas descritas abaixo.
    1. Divida vários pontos em arquivos únicos, conforme descrito na etapa 6.2. Abra FIJI. Selecione Processo > Lote > Macro. Na caixa "entrada", forneça o mapa para a pasta que contém os arquivos multiponto divididos. Deixe a caixa "saída" vazia.
    2. Cole o script do Arquivo de Codificação Suplementar 1 na caixa. Ajuste o limite de intensidade e o limite de tamanho no script para refletir os parâmetros otimizados das etapas 6.5 e 6.6.
    3. Clique em Processar. Dependendo do número de multipontos e da velocidade de processamento do computador, pode levar 30 minutos ou mais para processar todas as imagens. Depois de concluídos, os dados serão gravados em um novo arquivo de planilha chamado "Renomear-me depois de escrever" na área de trabalho. O arquivo de saída deve conter, para cada multiponto, uma contagem de ondas e métricas de onda (área, intensidade média, intensidade mínima e máxima e densidade de intensidade).

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Representative Results

A Figura 1A mostra uma cúpula de BMM contendo organoides intestinais humanos tridimensionais que foram transduzidos para expressar GCaMP6s de forma estável. A Figura 1B mostra a mesma linha de organoide replaqueada como monocamada 24, 48 e 72 h pós-semeadura. Para validar a função das GCaMP6s, a monocamada foi imageada por microscopia de fluorescência a cada 2 s por 4 min, e 100 nM de ADP foram adicionados ao meio após ~20 s. O ADP provoca a liberação de cálcio do retículo endoplasmático, aumentando o cálcio citosólico. A intensidade de fluorescência detectada no canal de 488 nm a cada exposição é plotada na Figura 1C. O traçado mostra uma intensidade de fluorescência basal constante seguida por um rápido aumento após a adição de ADP e um retorno gradual em direção à linha de base. Um controle de veículo é incluído para verificar se a resposta é um verdadeiro evento de sinalização, e não meramente uma mudança na intensidade da fluorescência que pode surgir da adição de meios.

A pontuação de uma monocamada HIO aumenta a eficiência da infecção por rotavírus. Embora as técnicas de pontuação variem, é mais fácil obter infecção consistente usando um único escore ao longo do comprimento da monocamada, como mostrado na Figura 2A. Quando se utilizam cepas recombinantes de rotavírus que expressam proteínas fluorescentes, a infecção pode ser verificada durante imagens ao vivo (Figura 2B). Ao usar uma cepa que não expressa um marcador, a infecção pode ser detectada por imunofluorescência após exames de imagem. Dada a motilidade das células em monocamadas HIO, muitas vezes é difícil rastrear uma única célula infectada ao longo do tempo. Em vez disso, use a coloração de ponto de extremidade como um método para verificar a infecção e confirmar se a multiplicidade de infecção é combinada entre os campos de visão (Figura 2C).

As ondas de cálcio intercelulares nas HIOs podem ser observadas qualitativamente, como ilustrado na Figura 3A. No entanto, a determinação da frequência das ondas de cálcio em um determinado campo de visão requer análise quantitativa. As etapas de sucesso da segmentação, descritas na etapa 6 do protocolo acima, estão ilustradas na Figura 3A. A figura mostra a imagem bruta (Figura 3Ai), a imagem após as intensidades de pixel do quadro anterior terem sido subtraídas (Figura 3Aii), depois a onda de cálcio segmentada (Figura 3Aiii).

Uma vez que as ondas de cálcio tenham sido segmentadas e quantificadas para cada campo de visão ao longo da execução da imagem, é frequentemente informativo comparar a frequência das ondas em monocamadas expostas a várias condições. O gráfico de tiras da Figura 3B mostra o número total de ondas de cálcio por campo de visão em monocamadas simuladas e inoculadas com rotavírus. Este exemplo inclui duas cepas de RV: uma cepa de rotavírus humano (Ito HRV) e uma cepa recombinante de rotavírus símio SA11 que expressa mRuby (SA11-mRuby). O controle simulado é tomado como a frequência basal da onda de cálcio, as monocamadas infectadas por rotavírus não tratadas servem como controles positivos, e as monocamadas infectadas por rotavírus e tratadas são as condições experimentais. Monocamadas simuladas e infectadas por RV tratadas com drogas, incluindo o inibidor do receptor de ADP, BPTU, podem então ser comparadas a ambas as condições de controle por ANOVA de uma via. Os dados sugerem que a BTB efetivamente diminui a frequência das ondas de cálcio intercelulares.

Figure 1
Figura 1: Validação da expressão de GCaMP6s em organoides intestinais jejunais humanos. (A) Após a transdução do lentivírus, as HIOs que expressam GCaMP foram submetidas à seleção e múltiplas passagens, mostradas aqui aos 7 dias desde a passagem mais recente. Após estimulação com o laser de 488 nm, a expressão de GCaMP6s é evidente nos HIOs transduzidos plaqueados em matriz de membrana basal de 15 μL como esferoides (Ai) tridimensionais. Exposições de 50 ms foram adquiridas a 50% de potência do laser usando uma objetiva de 20x e, em seguida, costuradas para visualizar toda a cúpula da matriz da membrana basal. Processo semelhante foi realizado utilizando exposições de campo claro (Aii) de 4 ms. Na imagem de campo claro, os HIOs escuros no centro da cúpula são uma indicação de que as culturas estão prontas para a passagem. (B) Os HIOs foram digeridos enzimaticamente em uma suspensão unicelular e, em seguida, replaqueados a uma densidade de 150.000 células por poço (5mm de diâmetro) de uma placa de fundo de imagem pré-revestida com colágeno IV. Em 72 h pós-semeadura, a monocamada estava confluente e pronta para aplicações downstream. Para validar a função do GCaMP, as imagens foram adquiridas usando o conjunto de filtros de 488 nm com exposições de 50 ms a 50% de potência do laser a cada 2 s por 4 min. (C) Os traços mostrados aqui representam a intensidade de fluorescência de campo inteiro normalizada para a primeira aquisição ao longo da imagem. Por volta dos 20 s (seta), após a décima exposição, 100 nM de adenosina difosfato (ADP) foi adicionado para provocar uma espícula de cálcio citosólico (vermelho). A adição de um volume igual de 1x PBS não provocou uma resposta significativa (azul). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Pontuação de uma monocamada HIO para facilitar a infecção do VD. (A) A figura ilustra uma técnica adequada para marcar uma monocamada usando uma agulha 25G. (B) Uma monocamada HIO foi infectada com uma cepa recombinante de RV que expressa a proteína fluorescente mRuby (magenta, seta), permitindo a identificação de células infectadas. Alternativamente, ao usar uma cepa natural de RV, as células infectadas podem ser identificadas por imunofluorescência. (C) As imagens mostradas são de 4 diferentes monocamadas de HIO após fixação, coloração DAPI (azul) e marcação de anticorpos do antígeno de rotavírus (magenta). Ambas as técnicas ilustram a infecção preferencial do VD próxima à porção pontuada da monocamada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Segmentação e quantificação das ondas de cálcio intercelulares induzidas por VR. As exposições de 488 nm de HIOs infectadas por RV expressando GCaMP6s foram adquiridas a cada 1 min por 16 h usando o protocolo. (A) A figura ilustra o processo de segmentação da onda de cálcio intercelular. Primeiro, os valores de pixel da aquisição anterior (t-1) são subtraídos de cada imagem bruta (Ai) para quantificar a mudança na intensidade da fluorescência (Aii). Um limite baseado em um aumento mínimo de intensidade otimizado experimentalmente em relação ao quadro anterior é então aplicado. As imagens são então filtradas para uma área mínima de sinal contíguo para selecionar ondas de cálcio intercelulares (Aiii) e excluir sinais de cálcio de célula única. Este processamento permite a quantificação das ondas de cálcio em cada campo de visão. Neste experimento, monocamadas foram infectadas simuladamente, infectadas com a cepa ITO de rotavírus humano (HRV), ou infectadas com uma cepa recombinante de rotavírus símio que codifica mRuby no segmento gênico 7, a jusante da proteína não-estrutural 3 (SA11-mRuby). As monocamadas infectadas foram tratadas com o inibidor do receptor de ADP BPTU ou não tratadas. As monocamadas foram então imageadas em 8 posições diferentes, e as ondas de cálcio em cada campo de visão foram quantificadas usando o pipeline descrito neste protocolo. Os pontos no gráfico de tiras indicam o número de ondas de cálcio detectadas em cada posição sobrepostas a um gráfico de barras marcando a média e o DS. A ANOVA de uma via seguida pelos testes de Dunnett mostra que, enquanto qualquer cepa de VR aumenta a frequência de ondas de cálcio intercelulares acima daquela do grupo não infectado, o tratamento com BTB impede o aumento mediado por RV na frequência da onda de cálcio. **p<0,01, ***p<0,001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Reagente Transdução Controle
Y-27632 (estoque de 1 mM) 4 μL 4 μL
Polibreno (estoque de 1 mg/μL) 2 μL 2 μL
Lentivirus variável*
HighWnt-WRNE *ver notas até 400 μL até 400 μL

Tabela 1: Meio de transdução de lentivírus. Preparar o meio de transdução e o meio de controle combinando os reagentes nos volumes indicados na segunda e terceira colunas, respectivamente. Visar uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10 unidades de transdução de lentivírus por célula. Para LV embalado internamente, isso geralmente requer ~25-50 μL de LV concentrado. O título da maioria dos LV embalados comercialmente será fornecido com o Certificado de Análise.

Arquivo de codificação suplementar 1: Script de macro ImageJ para permitir a quantificação de ondas de cálcio por processamento em lote. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Alterações nos níveis citosólicos de Ca2+ podem ser causa e efeito de patologias do epitélio 10,16,17. O aumento do cálcio citosólico pode direcionar diretamente a secreção via ativação do canal de cloreto cálcio-dependente TMEM16A18,19. A ativação do TMEM16A em resposta ao Ca2+ permite o efluxo apical de cloreto, estabelecendo um gradiente osmótico que promove a secreção de fluidos20,21. Além disso, aumentos de Ca2+ dentro das células enteroendócrinas desencadeiam a liberação de serotonina, que estimula neurônios sensoriais aferentes que podem modular a atividade dentro do sistema nervoso entérico22. Os sinais de Ca2+ também podem modular as tight junctions para influenciar a função de barreira23,24 e regular a proliferação em células-tronco intestinais25. Assim, a desregulação do Ca2+ pode ter efeitos amplos e de longo alcance.

Muitos vírus manipulam Ca2+ citosólico para criar um ambiente celular propício à replicação26. O rotavírus é um excelente exemplo disso dentro do epitélio intestinal27. A proteína não-estrutural 4 do rotavírus (NSP4) é um canal condutor de Ca2+ que permite o efluxo de Ca2+ do retículo endoplasmático para o citosol28,29. Isso estimula a autofagia e auxilia a montagem do capsídeo externo 30,31,32. A infecção por rotavírus também induz a liberação de ADP, desencadeando ondas intercelulares de Ca2+ que contribuem para a patogênese17. Outros vírus entéricos, incluindo calicivírus e enterovírus, codificam viroporinas condutoras de Ca2+ que desencadeiam desregulação semelhante de Ca2+ dentro das células infectadas33,34.

A imagem de células vivas Ca2+ de organoides intestinais humanos oferece uma plataforma versátil para estudar a sinalização induzida por vírus dentro do epitélio. No entanto, a força das conclusões tiradas dos dados de imagem depende, inextricavelmente, da saúde e da qualidade das HIOs, dos parâmetros de imagem apropriados e de uma abordagem analítica sólida.

A transdução lentiviral eficiente é muitas vezes o passo limitante ao estabelecer novas linhagens HIO, mas lentivírus de alto título e transduções múltiplas ajudam a garantir expressão suficiente de transgenes. É importante ressaltar que isso terá que ser equilibrado com o potencial de estresse celular significativo na transdução. Isso na maioria das vezes é temporário e diminui após a seleção e várias passagens. No entanto, é fundamental que os HIOs projetados para expressar GECIs apresentem crescimento e proliferação normais antes de iniciar os experimentos. Da mesma forma, dispersar HIOs tridimensionais e reformá-los como monocamadas induz estresse celular. É uma boa prática permitir três ou mais dias para que as monocamadas se adaptem após o revestimento. O revestimento das placas com colágeno IV é fundamental para a integridade da monocamada 35,36. Aliquotar colágeno IV e armazenar a -80 °C entre os usos ajuda a garantir a aderência da monocamada. Determinar a densidade de semeadura ideal para cada linha HIO também pode ajudar a melhorar a consistência. Finalmente, incluir os controles adequados, e compará-los entre experimentos, é indispensável para garantir que qualquer observação represente uma resposta à variável em questão, em vez de um confundidor técnico.

Embora a pontuação de uma monocamada possa causar danos celulares indesejados, aumenta muito a infecção por RV de HIOs 2D. A Figura 2 ilustra isso, pois quase todas as células infectadas estão diretamente adjacentes ao risco. Evidências experimentais sugerem que o VR infecta mais eficientemente a superfície basolateral das células epiteliais intestinais37. Assim, prevê-se que a pontuação de uma monocamada aumenta a infectividade pela exposição da superfície basolateral. A infecção eficiente da monocamada também pode ser obtida pelo plaqueamento de HIOs em membranas de policarbonato suspensas em poços contendo meio de cultura, que permitem o acesso à superfície basolateral. No entanto, a distância relativamente longa entre a placa e a membrana de policarbonato, a própria membrana de policarbonato e a superfície plástica na base do poço as tornam inadequadas para imagens de epifluorescência. Assim, o método de pontuação descrito neste protocolo continua sendo a abordagem favorecida. Dado que a pontuação em si pode levar a perturbações de sinalização, a inclusão do controle pontuado não infectado é fundamental para a interpretação. Para vírus, como o norovírus humano, que infectam eficientemente através da membrana apical, não é necessário pontuar a monocamada38.

Como acontece com qualquer sistema de imagem ao vivo, a fototoxicidade pode facilmente confundir experimentos utilizando monocamadas HIO. Ao longo de um experimento de imagem, é importante monitorar vacuolização inesperada, blebbing da membrana ou outros indicadores morfológicos de estresse39. Se algum desses sinais for detectado, a duração, frequência ou poder de excitação devem ser reduzidos. Aumentar a relação sinal-ruído geralmente vem às custas da saúde celular a longo prazo, portanto, otimizar empiricamente os parâmetros é crucial. O fotoclareamento, como indicado por uma diminuição na intensidade basal da fluorescência ao longo do tempo, é um prenúncio de estresse celular e deve ser evitado.

A visualidade dos dados de imagem pode levar os investigadores a privilegiar análises qualitativas em detrimento das quantitativas. No entanto, como em qualquer modalidade, conclusões reprodutíveis requerem quantificação. A análise quantitativa de imagens contém muito mais complexidade do que pode ser abordada em um único manuscrito, mas vale a pena destacar alguns pontos-chave. Primeiro, a quantificação consistente requer aquisição consistente. Um pipeline de análise desenvolvido para um determinado conjunto de parâmetros de aquisição pode não ser eficaz para imagens adquiridas em diferentes frequências, tempos de exposição, potências do laser ou comprimentos de onda. Em segundo lugar, a multiplicidade de infecções tem uma influência descomunal na frequência de sinais de cálcio induzidos por vírus. Como tal, é importante avaliar o número de células infectadas por campo de visão e garantir a consistência entre as condições de tratamento. Como alternativa, normalizar a frequência do sinal para o número de células infectadas por campo de visão pode ajudar a reduzir o erro. Finalmente, enquanto o indicador de cálcio baseado em mNG (NEMO) recentemente desenvolvido oferece uma abordagem promissora para determinar as concentrações absolutas de Ca2+ em células40, a maioria dos biossensores transmite apenas informações relativas sobre sistemas biológicos. Assim, a subtração em segundo plano, a normalização e a comparação com um controle são críticas.

Embora este protocolo se concentre na imagem de cálcio durante a infecção viral, a abordagem geral é prontamente adaptável. A infecção viral pode ser facilmente substituída por uma condição de tratamento alternativa, e há uma ladainha cada vez maior de biossensores para monitorar muitas vias e processos celulares diferentes. Com qualquer adaptação de protocolo, os pesquisadores devem manter a análise em primeiro lugar, projetando experimentos com resultados claros e quantificáveis.

Em geral, a imagem ao vivo fornece resolução temporal incomparável, melhorando a caracterização de processos altamente dinâmicos. A incorporação de organoides em experimentos de imagem ao vivo permite a observação desses processos em um modelo fiel ao tecido, fisiologicamente relevante. Esperamos que o protocolo aqui descrito facilite o planejamento e a otimização experimental, capacitando os pesquisadores a descobrir novos aspectos da sinalização celular e tecidual.

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Disclosures

Os autores não têm interesses financeiros concorrentes a divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por subsídios R01DK115507 e R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) do National Institutes of Health (NIH). O apoio aos estagiários foi fornecido pelos F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) e F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Gostaríamos de agradecer ao Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core por fornecer o meio de manutenção de organoides.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Advanced DMEM F12 Gibco 12634028
[Leu15]-Gastrin I Sigma-Aldrich G9145
0.05% Trypsin EDTA  Gibco  25300054
0.05% Trypsin EDTA  Gibco  25300054
1.5mL microcentrifuge tubes Fisherbrand 5408137
15mL conical tubes Thermofisher Scientific 0553859A
16% formaldehyde Thermofisher Scientific 28906
1M HEPES Gibco 15630080
1M HEPES Gibco 15630080
1X PBS Corning  21-040-CV
25 gauge needle Thermofisher Scientific 1482113D
A-83-01 Tocris 2939
ADP Sigma-Aldrich  A2754
Advanced DMEM F12 Gibco 12634028
Antibiotic-antimycocytic  Gibco 15240062
Antibiotic-antimycotic  Gibco 15240062
B27 Supplement Gibco 17504-044
Bovine serum albumin FisherScientific  BP1600100
CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments Greiner 543979
Collagen IV Sigma Aldrich C5533
DAPI Thermofisher Scientific D1306
EDTA Corning 46-034-CI
Fetal bovine serum  Corning  35010CV
Fetal bovine serum  Corning  35010CV
Fluorobrite Gibco A1896701
GlutaMAX  Gibco  35050079
GlutaMAX  Gibco  35050079
Human epidermal growth factor ProteinTech HZ-1326
Lentivirus VectorBuilder (variable)
Matrigel BD Biosceicen 356231/CB40230C
N2 Supplement Gibco 17502-048
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
NH4Cl Sigma-Aldrich  A9434
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates Thermofisher Scientific 142475
Polybrene MilliporeSigma TR1003G
SB202190 Sigma-Aldrich S70767
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151100
TrypLE Express Enzyme, no phenol red Thermofisher Scientific 12604013
Trypsin Worthington Biochemical NC9811754
Y-27632 Tocris 1254

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References

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