Summary
Este trabalho apresenta um protocolo econômico e eficiente para o exame de leucócitos peroxidase positiva no sêmen. Com o auxílio de um sistema de análise seminal assistida por computador (CASA), a concentração de leucócitos positivos para peroxidase no sêmen pode ser obtida em um total de 60 min, melhorando efetivamente a eficiência do laboratório de andrologia e dos andrologistas.
Abstract
A leucocitospermia pode levar à diminuição da motilidade dos espermatozoides, aumento das anormalidades morfológicas dos espermatozoides, índice de fragmentação do DNA dos espermatozoides elevados, comprometimento da função acrossômica dos espermatozoides e até mesmo desenvolvimento embrionário afetado. É uma doença andrológica comum na prática clínica e uma das importantes causas de infertilidade masculina. Ao determinar se a inflamação do trato reprodutivo masculino existe, os andrologistas geralmente optam por examinar as células redondas ou a elastase plasmática seminal no sêmen como base de diagnóstico clínico. No entanto, o exame de células redondas é facilmente influenciado por células espermatogênicas descamadas e células epiteliais do trato reprodutivo, que não contribuem para reduzir o uso indiscriminado e desnecessário de antibióticos. Ao mesmo tempo, o processo de detecção da elastase é relativamente complicado, demorado e lento na comunicação de resultados, o que não é benéfico para o diagnóstico precoce e tratamento de doenças como infecções do trato genital masculino (ITMG). Aplicamos de forma inovadora o exame de leucócitos peroxidase positiva em sêmen assistido por um sistema de análise seminal assistida por computador (CASA) como critério diagnóstico para leucocitospermia, resolvendo com sucesso esses problemas. Este exame requer apenas a adição do fluido operacional composto por quatro reagentes na amostra, e o tempo total de reação à temperatura ambiente pode ser controlado dentro de 20-30 min. Com o esfregaço subsequente e o exame microscópico, a concentração de leucócitos positivos para peroxidase no sêmen pode ser obtida dentro de um total de 60 min, que pode ser usado para diagnosticar se a inflamação do trato reprodutor masculino existiu.
Introduction
A infertilidade emergiu como um problema de saúde pública global que afeta aproximadamente 15% dos casais em idade reprodutiva. Os fatores masculinos são responsáveis por cerca de 50% do total de casos de subfertilidade, e cerca de 20% a 30% podem ser atribuídos exclusivamente aos fatores masculinos 1,2,3. As infecções do trato genital masculino (ITMG) constituem uma das causas significativas de infertilidade masculina, sendo responsáveis por cerca de 15% dos casos 4,5.
A maioria dos indivíduos possui leucócitos no sêmen, constituindo 13% das células não espermáticas, sendo as proporções diferenciais neutrófilos 12%, macrófagos 0,9% e linfócitos 0,1%6,7. De acordo com o manual laboratorial da Organização Mundial da Saúde (OMS) para exame e processamento de sêmen humano (5ª ed.), a leucocitospermia é usualmente definida como a presença de leucócitos >1 ×10 6 células/mL no sêmen8. Essa condição pode ser causada por inúmeros fatores, como toxinas ambientais, abuso de substâncias, varicoceles, MGTIs, etc., todos potencialmente levando a um aumento anormal da concentração leucocitária no sêmen9. Os leucócitos podem elevar os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) no sêmen, causando peroxidação lipídica e danos oxidativos à proteína e ao DNA, o que resulta em diminuição da motilidade dos espermatozoides, aumento das anormalidades morfológicas dos espermatozoides, aumento do índice de fragmentação do DNA dos espermatozoides, comprometimento da função acrossomal dos espermatozoides e até mesmo impactos negativos no desenvolvimento embrionário10,11.
Atualmente, os andrologistas geralmente optam por examinar células redondas no sêmen ou elastase no plasma seminal ao identificar a inflamação do trato genital. No entanto, muitas vezes é desafiador distinguir as células espermatogênicas esfaceladas das células epiteliais do trato reprodutivo, que não contribuem para reduzir o uso indiscriminado e desnecessário de antibióticos6. Este último método de exame é relativamente complicado e demorado, com notificação lenta dos resultados, o que não é benéfico para o diagnóstico precoce e tratamento de doenças como os ITMG. A American Urological Association (AUA) sugere que uma maior diferenciação entre leucócitos e células esfaceladas do trato genital deve ser feita quando a concentração de células redondas na análise do sêmen for maior que 1 × 106 células/mL12. Alguns laboratórios de andrologia utilizam citometria de fluxo13 ou imunocitoquímica de antígenos leucocitários (por exemplo, CD45)14 para examinar leucócitos. Embora esses métodos sejam precisos, são caros e demorados, dificultando a implementação clínica em larga escala, especialmente em países em desenvolvimento.
A peroxidase é amplamente distribuída em vários tipos de células e desempenha um papel crucial na resistência ao dano do estresse oxidativo. A mieloperoxidase (MPO) é um membro da subfamília das peroxidases que é geralmente expressa em células imunes. É mais altamente expressa nos grânulos azurofílicos dos neutrófilos15,16 e também é expressa em linfócitos17,18, monócitos e macrófagos19. A concentração de leucócitos, especialmente neutrófilos, no sêmen pode ser obtida pelo exame de células redondas positivas para peroxidase 7,20. Para tornar o processo de exame de leucócitos no sêmen econômico, conveniente e eficiente, reformulamos o método de exame. Assistida pelo sistema de análise seminal assistida por computador (CASA), a concentração de leucócitos pode ser obtida em 60 min. Esse novo método reduz os custos dos exames dos pacientes e o tempo de espera para a obtenção dos resultados, alivia a carga de trabalho dos técnicos de laboratório e encurta o período de espera para diagnóstico e tratamento do médico.
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Protocol
Este estudo foi revisado e aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Sun Yat-sen.
1. Preparação da solução de trabalho
- Reunir os seguintes reagentes essenciais para a preparação da solução de trabalho - solução de substrato de orto-toluidina, solução saturada de cloreto de amónio (NH4Cl), solução de sal dissódico de ácido etilenodiaminotetracético a 148 mmol/L (EDTANa 2) e solução de peróxido de hidrogénio a 6% (v/v). Coloque-os em uma bancada de laboratório à temperatura ambiente (RT) juntamente com as ferramentas necessárias, como pipetas de transferência (1000 μL, 200 μL, 10 μL) e racks de tubo de ensaio.
CUIDADO: Leia a ficha de dados de segurança (SDS) antes de manusear os reagentes acima mencionados. - Prepare um frasco de reagente marrom opaco para armazenar e proteger a solução de trabalho preparada da exposição à luz.
- Transfira os reagentes para o frasco de reagente marrom opaco de acordo com as proporções especificadas abaixo:
- Utilize a pipeta de transferência de 200 μL e ajuste a escala para 100 μL girando o botão. Em seguida, transfira 100 μL da solução NH4Cl para o frasco de reagente marrom opaco.
- Substitua a ponta da pipeta e transfira 100 μL da solução de EDTA de 148 mmol/L Na2para o frasco de reagente marrom opaco usando a pipeta de transferência de 200 μL mencionada acima. Em seguida, sopre suavemente por pipetagem e homogeneize completamente a solução.
- Utilize a pipeta de transferência de 1000 μL e ajuste a escala para 900 μL girando o botão. Em seguida, transfira 900 μL da solução do substrato orto-toluidina para o frasco de reagente marrom opaco, sopre suavemente por pipetagem e homogeneize completamente a solução.
- Utilize a pipeta de transferência de 10 μL e ajuste a escala para 5 μL girando o botão. Em seguida, transfira 5 μL da solução de peróxido de hidrogênio a 6% (v/v) para o frasco de reagente marrom opaco.
- Utilize a pipeta de transferência de 1000 μL e ajuste a escala para 1000 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta, sopre suavemente por pipetagem e homogeneize completamente a solução no frasco de reagente marrom opaco.
- Armazene a solução de trabalho pronta para utilização no frasco de reagente marrom opaco em RT, longe da luz. A solução de trabalho é reativa por 24 horas.
- Cada amostra de sémen requer 900 μL da solução de trabalho. Assegurar que a quantidade da solução de trabalho preparada diariamente corresponde ao número de amostras examinadas diariamente.
2. Preparação da amostra de sémen
- Antes de coletar a amostra de sêmen, certifique-se de que o paciente tenha se abstido da ejaculação por 2 a 7 dias, conforme exigido pelo manual laboratorial da Organização Mundial da Saúde (OMS) para examinar e processar o sêmen humano (5ª ed.) 8. A masturbação é o método preferido para a obtenção de amostras de sêmen. Para melhorar a precisão do exame, instrua o paciente a coletar todo o sêmen ejaculado.
- Ligue o suporte de temperatura constante e aqueça até 37 °C com antecedência para que a liquefação subsequente da amostra de sêmen possa prosseguir sem problemas.
- Após o recebimento da amostra de sêmen do paciente, registre meticulosamente informações detalhadas, incluindo código de identificação, tempo de coleta, duração da abstinência e outras informações pertinentes, na parede externa do recipiente à base de polímero.
- Coloque o recipiente à base de polímero que abriga a amostra de sêmen no suporte de temperatura constante pré-aquecido a 37 °C, o que é benéfico para a liquefação do sêmen.
- Aspirar a amostra de sémen para uma pipeta à base de polímero e observar o estado de liquefação a cada 5 minutos até que a amostra de sémen esteja totalmente liquefeito.
- Se a amostra de sémen não tiver sido totalmente liquefeita no prazo de 30 minutos, não realize ainda o exame; Continue a esperar por mais 30 min. Se o sémen ainda não estiver totalmente liquefeito após 60 minutos, adicionar um volume igual de solução tampão fosfato para uma diluição de 1:1 e agitar suavemente para promover a liquefação.
- Após agitação completa e homogeneização consistente, retenha a amostra de sêmen totalmente liquefeito para os procedimentos de exame subsequentes.
3. Coloração dos leucócitos peroxidase positiva e análise da amostra de sêmen original
- Antes da amostragem, utilize uma pipeta à base de polímero para soprar repetidamente por pipetagem e homogeneizar completamente a amostra de sêmen sob exame.
- Utilize a pipeta de transferência de 200 μL e ajuste a escala para 100 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta e, em seguida, transfira 100 μL da amostra de sémen para um tubo de centrifugação.
- Utilize a pipeta de transferência de 1000 μL e ajuste a escala para 900 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta e, em seguida, transfira 900 μL da solução de trabalho acima mencionada para o tubo da centrífuga.
- Sopre repetidamente por pipetagem e homogeneize completamente o reagente, que consiste na amostra de sêmen e na solução de trabalho, usando a pipeta de transferência de 1000 μL.
- Posicione o tubo da centrífuga em um rack de tubo de ensaio sobre um agitador bidimensional e submeta-o a agitação contínua a 200 rpm por 30 min no RT.
- Enquanto aguarda a reação de coloração, analise a amostra de sêmen utilizando o sistema CASA para determinar a concentração de espermatozoides na amostra de sêmen original no recipiente à base de polímero.
- Ligue o interruptor de alimentação do sistema CASA e clique duas vezes no ícone SCA SCOPE para abrir o software do aplicativo.
- Antes da amostragem, soprar repetidamente por pipetagem e homogeneizar completamente a amostra de sêmen original novamente com uma pipeta à base de polímero.
- Utilize a pipeta de transferência de 10 μL e ajuste a escala para 10 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta, pipetar 10 μL da amostra de sêmen original e colocá-la na câmara de contagem SCA. Aguarde 60 s para que a amostra de sêmen pare de derivar.
- Posicione a câmara de contagem da SCA no porta-amostras do sistema CASA e defina as informações do paciente na caixa de diálogo do software aplicativo para se preparar para o exame formal.
- Examine a amostra de sêmen original na câmara de contagem da SCA com o sistema CASA clicando no botão Iniciar e registre os dados necessários, como a concentração de espermatozoides.
4. Observação dos leucócitos e espermatozoides positivos para peroxidase
- Utilize a pipeta de transferência de 1000 μL e ajuste a escala para 1000 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta, depois sopre repetidamente por pipetagem e homogeneize completamente o reagente, que consiste em amostra de sêmen e solução de trabalho no tubo da centrífuga novamente no final do processo de reação de 30 minutos.
- Utilize a pipeta de transferência de 10 μL e ajuste a escala para 10 μL girando o botão. Substitua a ponta da pipeta, pipetar até 10 μL do reagente mencionado acima e colocá-lo na câmara de contagem de espermatozoides. Finalmente, cubra a câmara de contagem de espermatozoides com uma tampa de vidro dedicada.
- Coloque a câmara de contagem de espermatozoides no palco microscópico e ligue o interruptor de energia do microscópio óptico com duas oculares de 10x. Em seguida, aguarde 60 s para que a amostra de reagente pare de derivar.
- Troque o conversor microscópico para a lente objetiva de 10x durante o tempo de espera. Em seguida, ajuste o botão de ajuste grosso e o botão de ajuste fino em sequência. Finalmente, observe os espermatozoides e as células redondas sob um aumento de 10×10.
- Trocar o conversor microscópico para a objetiva de 40x após determinar o campo de visão a ser analisado e observar os espermatozoides e leucócitos marrom peroxidase positiva sob um aumento de 10 × 40.
- Utilize o sistema de contador eletrônico para contar pelo menos 200 espermatozoides e o número de leucócitos positivos para peroxidase marrom dentro dos campos correspondentes.
5. Cálculo da concentração de leucócitos peroxidase positiva
- Calcular a concentração de leucócitos positivos para peroxidase utilizando a seguinte fórmula:
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Representative Results
Ao implementar o procedimento supracitado, o reagente no tubo da centrífuga frequentemente manifesta aspecto subtranslúcido e opalescente (Figura 1). A detecção de uma cor obviamente marrom revela potencial degranulação de leucócitos, o que pode resultar em coloração líquida. Consequentemente, o processo de coloração pode falhar, tornando necessário recolorir ou coletar uma nova amostra de sêmen para novo teste21.
Os leucócitos peroxidase positivos apresentaram tonalidade marrom, contrastando com as células redondas comuns não coradas (Figura 2, lâmina ordinária). Posteriormente, cada espermatozoide e leucócito marrom sob o campo microscópio atual foi contado antes de mudar para um campo inteiramente novo para observação e contagem contínuas. Para garantir a precisão ideal, é necessário contar um mínimo de 200 espermatozoides e os leucócitos presentes no campo de visão correspondente.
Figura 1: Solução reagente. O reagente que completa o processo de reação é um líquido opalescente subtranslúcido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Observação ao microscópio óptico (lâmina comum). (A) leucócitos positivos para peroxidase e (B) células redondas comuns observadas ao microscópio óptico com aumento de 10 x 40. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
A orto-toluidina e o peróxido de hidrogênio têm propriedades fotossensíveis e podem se decompor quando expostos à luz. Para garantir a eficácia dos reagentes de teste, recomenda-se que o fluido de trabalho preparado seja armazenado em um local escuro.
As amostras de sêmen naturalmente exibem características heterogêneas. No processo de preparação de amostras de sêmen, julgar corretamente o estado de liquefação do sêmen e homogeneizar completamente as amostras de sêmen antes de cada amostragem são cruciais para melhorar a confiabilidade dos resultados dos testes. As amostras de sêmen liquefazem completamente dentro de 15 min. Homogeneização mecânica ou digestão enzimática devem ser consideradas se não tiverem se liquefeito completamente após 60 min. Amostras de sêmen mais homogêneas podem ser obtidas agitando-se suavemente o recipiente da amostra continuamente durante o processo de liquefação usando um agitador bidimensional8.
O método de exame apresentado neste trabalho possui as vantagens de simplicidade, rapidez e custo-efetividade. No entanto, pode não ser vantajosa em determinadas circunstâncias: a peroxidase é armazenada em grânulos azurofílicos que serão secretados para o espaço intercelular através de degranulação ou citopense após ativação21,22. Consequentemente, os neutrófilos podem não manchar e não podem ser identificados. Nesses casos, torna-se necessário repetir o processo de coloração ou mesmo exigir que o paciente forneça uma nova amostra de sêmen para reexame. Para minimizar essa situação, recomenda-se utilizar amostras de sêmen fresco sempre que possível, com tempo mínimo de colocação e um processo de homogeneização suave. Esse método só pode identificar doenças ativas ou infecções e não pode identificar doenças em estágios mais avançados, como as infecções crônicas16. Além disso, outros tipos de leucócitos com menor conteúdo de peroxidase, como linfócitos, macrófagos e monócitos, apresentam dificuldades na coloração por esse método; portanto, a obtenção de resultados confiáveis pode ser obtida empregando-se a coloração imunoistoquímica do antígeno leucocitário (por exemplo, CD45).
Como exigido pela 5ª edição do manual da OMS, a coloração tradicional positiva para mieloperoxidase (teste de Endtz) requer a contagem microscópica de pelo menos 200 leucócitos positivos para peroxidase em uma placa de contagem de células sanguíneas para calcular sua concentração8. Comparado ao tradicional teste manual de Endtz, este protocolo introduz os dados de concentração de espermatozoides obtidos pela detecção CASA, combinando métodos manuais e automáticos. Para calcular a concentração de leucócitos peroxidase positiva, pelo menos 200 espermatozoides e leucócitos no campo de visão correspondente foram contados ao microscópio. Como a concentração de espermatozoides no sêmen é muito maior do que a de leucócitos, foi necessário menos tempo para contar 200 espermatozoides em comparação com contar 200 leucócitos positivos para peroxidase.
Pacientes com oligospermia grave, criptozoospermia e azoospermia frequentemente enfrentam desafios na contagem de um número suficiente de espermatozoides. Nesses casos, a concentração de leucócitos peroxidase positiva pode ser calculada diretamente usando uma placa de contagem de células sanguíneas, conforme descrito no manual da placa. Além disso, para pacientes que não necessitam de CASA ou laboratórios sem equipamento CASA, uma placa de contagem de células sanguíneas também pode ser utilizada para determinar a concentração de leucócitos peroxidase positiva.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores são gratos ao Laboratório de Andrologia do Centro de Medicina Reprodutiva, o Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Sun Yat-sen, por fornecer as instalações para este estudo. Nenhum financiamento foi envolvido na elaboração deste artigo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
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