Summary
Корковая динамика кровотока могут быть изучены в естественных условиях при визуализации флуоресцентных красителей декстрана вводят в хвостовую вену грызунов с 2-фотонной микроскопии. Это видео показывает, как изображение кровотока динамика в коре головного мозга мышей через застекленные окна черепных подготовки.
Abstract
Способность изображения мозговой сосудистой (из крупных сосудов в капилляры) и записывать динамику кровотока в интактном мозге жизни грызунов мощная техника. Использование в естественных условиях 2-фотонной микроскопии через черепную окна можно изображений флуоресцентных красителей вводят внутривенно. Это позволяет, чтобы изображение коры сосудистую, а также для получения измерений кровотока. Эта методика была разработана Дэвидом Кляйнфельд и Винфрид Денк. Метод может быть использован для изучения динамики кровотока во время или после ишемии головного мозга, при нейродегенеративных расстройствах, при опухолях головного мозга, или в нормальной физиологии мозга. Например, он был использован для изучения того, как инсульт вызывает сдвиги в крови направления потока и изменения в красных кровяных телец скорости или потока внутри и вокруг инфаркта. Здесь показано, как использовать 2-фотонной микроскопии для изображения динамики кровотока в коре головного мозга жизни мышей использованием флуоресцентных красителей вводят в хвостовую вену.
Protocol
Хвостовую вену инъекции флуоресцентных красителей декстраны
- Для того, чтобы изображение мозговой сосудистой сети, животные должны быть введены внутривенно с флуоресцентным красителем. Мы используем декстран-сопряженных красители, потому что часть декстран предотвращает краситель пересечь барьер мозга крови и утечки из кровеносных сосудов.
- Мыши анестезировали изофлуран (4% для индукции, 1,5-2% в течение инъекции).
- Хвост дезинфицируют 70% спиртом.
- С 26 иглы, 75-100 мкл 5% объем / объем раствора родамина декстран растворенный в физиологическом растворе вводится через хвостовую вену, на полпути вдоль вала хвоста.
- Животные могут быть отображены сразу же после инъекции вены хвоста, пока краситель выделяется с мочой, которые становятся розовыми, если используется краситель родамин около 2 часов.
Визуализация кровотока с помощью двух-фотонной микроскопии (общая продолжительность 30-60 мин за сеанс, в зависимости от количества судов отображаемого)
- После инъекции флуоресцентного красителя декстран, мышь под наркозом с изофлуран (4% для индукции, 1-1,5% для работы с изображениями).
- Мышь прочно прикреплены использованием титана бар столик микроскопа, который содержит термо-регулируемых грелку держать животное тепло. Некоторые глазная мазь применяется сохранить глаза влажными.
- Покровного стекла черепной окно очищается 70% спиртом.
- Окна расположены параллельно фокальной плоскости и в центре поля зрения под 4X цели.
- Лучше всего, чтобы сфотографировать поверхность сосудов головного мозга с помощью цифрового фотоаппарата. Эта картина будет использоваться в качестве образа ссылки в следующих изображений сессий, чтобы найти отображаемого региона неоднократно изо дня в день.
- 4X цель заменяется на погружение в воду 40X цели, не двигаясь стадии. Цифровое изображение поля зрения берется снова. Координат на этапе манипулятора установлены на нулевом уровне.
- Мы используем ScanImage как приобретение программного обеспечения изображения. Это было написано в MatLab Томом Pologruto и Бернардо Сабатини в лаборатории Карел Свобода (Pologruto и соавт., 2003). Теперь мы переходим на все другое оборудование: лазерная, измеритель мощности, фото мультипликаторы трубы, усилители и т.д.
- Области окна, подходящие для включения в образ кратко отсканированы при малом увеличении найти лучших регионов. Как только они определили, низкий стек увеличение выбранной области изображения, чтобы берется, и его XY координаты комментариями.
- Для записи динамику кровотока в мелких сосудах или капилляры мы используем линии сканирования по крайней мере 40 мкм судна интересов. Эти одиночные "зачисток" прочное одну секунду делается с использованием в качестве маленькой мощности лазера в качестве возможной и координаты и угол сканирования записаны.
- После визуализации сессия закончилась, животное перемещается в теплой камере, где он может оправиться от наркоза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Корковая динамика кровотока могут быть изучены в естественных условиях при визуализации флуоресцентных красителей декстрана вводят в хвостовую вену грызунов с двухфотонной микроскопии. Это видео показали метод для того, как изображение кровотока динамика в коре головного мозга мышей через застекленные окна черепных подготовки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescein isothio-cyanate-dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | FD500S | mol wt 500,000 |
| Rhodamine B isothio-cyanate-dextran | Reagent | Sigma-Aldrich | R9379 | mol wt ~70,000 |
References
- Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proc Nat Acad Sci. 95, 15741-15746 (1998).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed. Eng. Online. 17, 2-13 (2003).
- Zhang, S., Murphy, T. H. Imaging the impact of cortical microcirculation on synaptic structure and sensory-evoked hemodynamic responses in vivo. 5, (2007).
- Nishimura, N., Schaffer, C. B., Friedman, B., Lyden, P. D., Kleinfeld, D. Penetrating arterioles are a bottleneck in the perfusion of neocortex. Proc Nat Acad Sci. 104, 365-370 (2007).
