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Summary
Como neurociência inquérito se torna mais sofisticada investigação, de estruturas cerebrais e circuitos exige melhores níveis de precisão e de alta resolução. Nós desenvolvemos um método para a preparação e implantação de um sistema de infusão crônica no cérebro utilizando uma microcânula borosilicato com um diâmetro da ponta de 50 microns.
Abstract
Protocolos experimentais usados para infusão crônica de agentes neuroactive dentro das regiões do cérebro, muitas vezes utilizam um sistema de bomba de mini-osmótica. Agentes são comumente entregues através de uma cânula de aço inoxidável com um diâmetro de 0,30 mm ou maior. Sistemas utilizando uma cânula deste calibre pode impor trauma para a área de interesse, resultando em danos arquitetônicos, comprometendo a integridade estrutural e funcionamento normal. Como neurociência inquérito se torna mais sofisticada investigação, de estruturas cerebrais e circuitos exige melhores níveis de precisão e de alta resolução. Nós desenvolvemos um método para a preparação e implantação de um sistema de infusão crônica no cérebro utilizando uma microcânula borosilicato com um diâmetro da ponta de 50 microns. Esta técnica reduz os danos ao meio ambiente local e diminui gliose reativa no local da infusão. A configuração do sistema microinfusion também é capaz de estar de acordo com a superfície do crânio do animal, impedindo a necessidade de grandes pedestais cranial, facilitando o fechamento da incisão no couro cabeludo e reduzindo o risco de infecção. Demonstramos entrega sustentado confiável de um corante tendo um peso representativo molecular utilizando um modelo in vitro e in vivo em ratos.
Protocol
Introdução
Infusão direta de neuroactive agentes permite que regiões específicas do cérebro a ser estudada, enquanto ultrapassando a barreira hemato-encefálica. As aplicações desta abordagem em neurociência são diversas e incluem a alteração do nível de atividade cerebral em sub-regiões distintas (Berretta et al, 2004;. Gliddon et al, 2005;.. Kim et al, 2000), investigando as ações dos agentes psicotrópicos ( Clinton et al, 2006;.. Di Benedetto et al, 2004), fornecendo modelos controlada de inflamação cerebral (Hauss-Wegrzyniak et al, 1998;. Marchalant et al, 2007;.. Rosi et al, 2004), estudando os mecanismos de vício (Kim et al, 2005;. Lockman et al, 2005;. Zhang et al, 2006.), e permitindo a administração a longo prazo de fatores tróficos (Naert et al, 2006;.. Radecki et al, 2005; Takahashi et al., 2006).
Métodos padronizados para entrega crônica de agentes, muitas vezes utilizam uma bomba mini-osmótica (por exemplo, Bombas Alzet osmótica, Cupertino, CA) carregado com um agente neuroactive, que é entregue dentro do cérebro através de uma cânula de aço inoxidável com um diâmetro que pode variar de 0,25 mm (Williams et al, 1987). a 0,5 mm, mas mais comumente é de aproximadamente 0,3 mm (Plastics One, Roanoke, VA; ver Fig. 6A). Enquanto cânulas de entrega deste tamanho pode ser adequado para muitas aplicações em que altos níveis de precisão não são necessários e trauma para o microambiente não é uma grande preocupação, essas cânulas são de qualidade inferior para a entrega de agentes para pequenas, sites delicada em que a cânula é comparável no tamanho (ou maior do que) a estrutura alvo em si, ou onde a função não deve ser comprometida por insulto traumático.
Aqui apresentada é um método para a preparação e implantação de um sistema de infusão crônica de agentes para entrega neuroactive dentro do cérebro utilizando um "microcânula" com um diâmetro da ponta muito reduzido. Esta técnica permite que pequenas subestruturas a ser alvo e reduz o trauma da área de interesse. O presente procedimento é, assim, ensinada como uma alternativa aos métodos convencionais para pesquisadores que desejam minimizar os inconvenientes para a região do cérebro sob investigação.
Materiais e métodos
Animais e design
Dezoito adultos (400-450 g) machos Sprague-Dawley foram usados para demonstrar o processo e testar a função do método atual. Doze animais foram implantados com sistemas microinfusion e contribuiu para uma avaliação do tempo de curso da função sustentada ao longo de 4 dias. Seis animais foram utilizados para comparar nível de trauma e gliose reativa 5 dias após o implante de qualquer um padrão de entrega 28 ga cânula (N = 3) ou uma microcânula (N = 3) ligado a uma solução salina preenchidos mini-bomba osmótica. Animais foram alojados em gaiolas de plástico claro, e mantidos sob uma luz de 12 horas / programação escuro, com comida e água fornecidas ad libitum. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Animal Care Hospital McLean Institucional e Comitê de Uso, em conformidade com as diretrizes aplicáveis federais e locais para o uso experimental de animais.
Microinfusion montagem do sistema
A figura 1 ilustra os componentes e montagem do sistema microinfusion. Recomendamos a construção e implantação do sistema usando técnica estéril. Além disso, a fim de prevenir a introdução de ar no sistema, ele é montado ao mesmo tempo submerso dentro de um banho de solução salina. Para os testes atuais, mini-bombas osmóticas (POM) foram empregados (Alzet, modelo # 1002, Cupertino, CA) com uma duração de 14 dias, vazão de 0,25 mL / h, e uma capacidade de preenchimento de 98,6 mL. No entanto, uma vez que as taxas de fluxo em excesso pode dilúvio áreas menores de interesse no cérebro e causar danos estruturais, a taxa de fluxo para estes estudos foi reduzida para 0.125 mL / hr, revestindo a metade da MOP com parafina conforme as instruções do fabricante. Para avaliação de trauma local, MOPs foram preenchidas com solução salina estéril. Para avaliação da função sustentado dos sistemas de microinfusion, Fast Green (1% em solução salina, Fisher Scientific, Park Lane Pittsburgh, PA) foi escolhida como uma solução de teste devido a sua baixa toxicidade, sua capacidade de difundir no tecido cerebral viável, e porque tem um peso molecular (808,84) na extremidade superior do intervalo de "pequenas moléculas" (<1000) que são comumente de interesse para infusão crônica (por exemplo, muscimol, picrotoxina, fluoxetina, etc.)
Figura 1: Assemtagem do sistema microinfusion. (A) Os componentes do sistema que entraram em suas posições relativas para a montagem. Observe o flange do tubo modulater fluxo tem sido rompido. Recomenda-se o fio de alinhamento ser assegurado apenas antes da implantação (ver texto). (B) montado sistema microinfusion antes da fixação do fio de alinhamento e implantação.
Microcânula preparação
A microcânula pode ser formado através de um puxador de eletrodo padrão horizontal ou vertical (Stoelting Co., Wood Dale, IL), com configurações para a produção de um eletrodo de vidro com uma haste longa e suavemente afilado (Fig. 2A). Tubos de borossilicato é adequado para este fim (parte 1B100F-6, 1.0 mm, 6 in; Instrumentos de Precisão World, Inc., Sarasota, FL), já que tem um ponto de fusão relativamente baixo, permitindo que as flexão com o calor concentrado. A porção distal mais de uma microcânula retas podem ser cortados com tesouras de dissecação ou uma pausa controlada pode ser feita com micropinças (Instrumentos de Precisão World, Inc., Sarasota, FL) para dar o diâmetro da ponta final desejado (50 mm para as manifestações presentes ), e um micrômetro estágio do microscópio é útil para orientar e confirmar o diâmetro desejado. A ponta de corte pode ser brevemente aquecida, ou "fogo-polido", para remover bordas ásperas ou afiadas. A serpentina de aquecimento do extrator eletrodo ou um bico de Bunsen é então utilizado para impor um ângulo à direita para a microcânula, a uma distância predeterminada a partir da ponta da microcânula (Fig 2B), colocando o tubo de borossilicato dentro da serpentina de aquecimento (ou uma chama bunsen ) e aplicando força suave na porção distal com pinça como o tubo é aquecida. O comprimento predeterminado do microcânula distal ao ângulo direito imposta é decidido com base na profundidade da região do cérebro a ser alvo (por exemplo, 5 mm) e tendo em conta a espessura do crânio (~ 1 mm) e distância de trabalho acima do crânio ( por exemplo, 1-2 mm). Assim, a distância predeterminada a partir da ponta da microcânula para o ângulo direito impostas para as manifestações presentes foi 7-8 mm. Um lápis de diamante é então usada para cortar o tubo de borossilicato aproximadamente 8 mm proximal ao ângulo direito.
Figura 2: Preparação de microcânula. (A) Um puxador de eletrodo (Stoelting Co. Wood Dale, IL) é utilizado para produzir uma microcânula, com uma haste longa e afilada. (B) A serpentina de aquecimento podem ser reorientados para facilidade de uso, e os microcânula é colocado dentro da bobina, permitindo uma curva em ângulo reto a ser formado com a pinça como o tubo de vidro é aquecido.
Após o número desejado de microcânulas foi feito, recomendamos a esterilização com óxido de etileno ou usando um autoclave. A mais-mm distal 1-2 da microcânula pode ser colorido com um marcador cirúrgica estéril (ou tinta permanente antes da esterilização) para permitir a ponta microcânula para ser facilmente visualizados durante o procedimento cirúrgico.
Preparação MOP
MOPs foram preparadas de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o flange de plástico do tubo de aço inoxidável MOP ("fluxo de modulador") é o primeiro removidos com tesoura ou fórceps. Um pedaço de tubo de polietileno (plásticos One, Roanoke, VA, VT # C312; OD, 1,22 mm; ID: 0.72 mm) é ligado à área de tubos de aço inoxidável anteriormente ocupado pelo flange (~ 4 mm), inserindo o inox tubos de aço para o lúmen do tubo de polietileno e prendendo com um adesivo adequado ao redor da circunferência externa da conexão. LumaBond (myNeuroLab, Inc., St. Louis, MO) é particularmente útil como ele cura dentro de segundos após a exposição à luz concentrada (por exemplo, de uma lâmpada de fibra óptica). O comprimento da tubulação deve distância aproximada entre a base do crânio do animal e o aspecto mais rostral da escápula (por exemplo, aproximadamente 1,5-3,0 cm para ratos de laboratório). A bomba é preenchido conforme as instruções e os tubos Alzet aço inoxidável, com o comprimento da tubulação de polietileno anexado ao seu fim, é inserida a bomba cheia. Um pequeno volume de solução da bomba será forçado do lado de fora da interface bomba de tubo (e deve ser dabbed de distância) e também na região proximal do tubo de polietileno. A bomba cheia de tubos ligados é, então, incubadas em salina estéril por 12 horas a 37 ° C. Se a bomba está funcionando corretamente, após este período de incubação, o líquido será visto ter viajado alguns milímetros dentro do tubo de polietileno.
Construir íons do sistema microinfusion
A bomba com o seu tubo anexado é imerso em um prato de 10 centímetros de Petri contendo solução salina estéril, e os restantes de ar dentro do tubo de polietileno é removido com uma seringa preenchida com a mesma solução contida no bomba e que foi equipado com tubos de pequeno diâmetro que pode ser inserido dentro do tubo de polietileno. Solução pode assim ser injetado no tubo de polietileno para substituir o ar. Da mesma forma, a microcânula é imerso no banho de solução salina e ar é removido por injeção com uma solução. Isso é facilmente alcançada com uma solução cheia de segunda seringa com tubo flexível (por exemplo, silicone) que se encaixa sobre a extremidade (proximal) grande parte da microcânula.
A extremidade proximal do tubo de borossilicato é então inserido no tubo de polietileno. Note que isso pode exigir dilatação do tubo de polietileno por pressionar firmemente as pontas fechado de micropinças para o lúmen, assim, a queima da abertura para fácil inserção do tubo de borossilicato. O sistema de infusão de ar-livre é então removido do banho de solução salina e colocado em uma superfície estéril e secar delicadamente com gaze ou um cotonete. A conexão de tubos de polietileno-microcânula é presa com uma camada circunferencial de adesivo (por exemplo, LumaBond).
Se o sistema foi montado corretamente, e se o MOP continua a funcionar como deveria, durante a etapa final deste processo de uma gota de solução geralmente aparecem na ponta da microcânula como o mecanismo osmótico dentro da bomba continua durante a preparação. MOP taxa de fluxo pode ser diminuída proporcionalmente, revestindo a superfície apropriada com parafina conforme as instruções do fabricante. Para as manifestações presentes, 50% de cada MOP foi revestido por breves instantes, dunking-lo em parafina derretida e permitir que ele esfriar, reduzindo assim a vazão pela metade, para 0,125 mL / hr. O sistema microinfusion concluída é então imerso em solução salina estéril e armazenado a 37 ° C até a implantação.
Implantação de sistema de microinfusion
O sistema é implantado microinfusion usando métodos padrão estereotáxica, como descrito anteriormente (Cooley, 1990). Após a preparação do campo cirúrgico, de um orifício é perfurado para a entrada da microcânula. Se desejar, parafusos crânio também pode ser posicionado para estabilizar o composto de colagem utilizados para garantir a microcânula. O composto utilizado neste laboratório (Geribond, Den-Mat Inc., Santa Maria, CA) não requer ancoragem adicional, no entanto, a superfície do crânio deve ser preparado por limpeza com um cotonete acetonedampened. Um 1-2 mm de diâmetro "gancho" é feita na extremidade distal do fio de alinhamento (ver Fig. 1.), Permitindo que circundam a curva na tubulação de borosilicato. Em seguida, é segura (utilizando LumaBond), em uma orientação ao longo do mesmo eixo como a porção distal da microcânula (que está a ser avançado para o cérebro, ver fig. 3B). O sistema de infusão é, então, montado sobre o transportador estereotáxica (Fig. 3), de fixação do fio de alinhamento para o titular. Sutura estéril é usada para amarrar a bomba de infusão para o topo do manipulador estereotáxica, portanto, suspender-lo e evitar a perda de orientação durante o procedimento devido ao peso (e torque) da bomba (Fig. 3B). A microcânula pode ser posicionado na orientação desejada (por exemplo, precisamente vertical), utilizando uma pinça para dobre o fio de alinhamento distal ao clamp transportadora. A ponta microcânula é posicionado sobre um ponto de referência (por exemplo, bregma ou lambda) e, em seguida, manobrou até o ponto de entrada no cérebro. As coordenadas utilizadas para os animais nesses experimentos foram: 0,2 milímetros bregma, 3,2 mm lateral e 5,0 mm abaixo ventral dura com a cabeça do animal em posição crânio-flat.
Após a microcânula é avançado até à profundidade desejada dentro do cérebro, o sistema é fixo na posição com um composto de pedestal (por exemplo, Geribond). O pedestal pode ser esculpido perto da superfície do crânio para facilitar o fechamento da ferida. Após o composto pedestal curou (~ 2 min), o fio de alinhamento é cortado rente ao pedestal usando roda de corte da broca. Uma pequena quantidade de composto pode ser usado para cobrir e alisar a barb restante do fio cortado. O MOP é inserido por via subcutânea, posicionado entre escápulas do animal. Finalmente, a ferida é lavaged com solução salina estéril, ea incisão fechada com sutura ou grampos de sutura (Fig. 3, painel D).
croinfusion sistema está posicionado para a colocação e fixação dentro de um animal. (D) O design do sistema permite microinfusion fechamento fácil da incisão sobre um pedestal de baixo perfil, reduzindo o risco de infecção e minimizar o desconforto para o animal. "Width =" 511 "height =" 381 "/>
Figura 3: Implantação de sistema de microinfusion. (A) Posicionamento do sistema microinfusion em instrumento estereotáxico. (B) O MOP é preso usando suturas cirúrgicas para evitar o seu peso de perturbar a orientação da microcânula. A microcânula é posicionado para a entrada verticais precisos para o cérebro usando o fio de alinhamento. (C) Um sistema microinfusion é posicionada para a colocação e fixação dentro de um animal. (D) O design do sistema permite microinfusion fechamento fácil da incisão sobre um pedestal de baixo perfil, reduzindo o risco de infecção e minimizar o desconforto ao animal.
Elaboração e implantação de sistema de infusão padrão
O procedimento para a preparação do sistema de infusão padrão é idêntico ao do sistema microinfusion exceto a microcânula é substituída por uma "bomba osmótica conector cânula" com um diâmetro de 300 mm (28 ga; Plásticos One, Roanoke, VA, # 3300PM / SPC, ver Fig. 5). Implantação do sistema padrão também é idêntico ao do sistema microinfusion, incluindo a ligação de um fio de alinhamento para permitir posicionamento vertical precisa da cânula de entrada no cérebro.
Histologia e Análise
Para examinar a capacidade do sistema de microinfusion para possibilitar a entrega sustentado da Verde Fast, grupos de três animais foram sacrificados em 12 horas, um dia, dois dias, e quatro dias após a cirurgia. Os indivíduos foram profundamente anestesiados com pentobarbital sódico (120 mg / kg, ip) e perfundidos transcardially com 200 mL de 0,1 M tampão fosfato salino (PBS), seguido por 400 mL de paraformaldeído 4% em tampão fosfato 0,1 M. Soluções de perfusão foram mantidos a 4 ° C, com um pH de 7,4 e perfundidos a uma taxa de 50 mL por minuto, usando uma bomba peristáltica. A fim de remover as cânulas sem danificar o tecido pós-morte, o animal perfundidos foi fixado em uma moldura estereotáxica, o pedestal foi fixado com cola a um fio rígido anexado ao grampo braço manipulador, eo crânio foi cuidadosamente removido ao redor do pedestal usando uma rebarba dental. O pedestal ea cânula subjacentes foram removidos, assim, ao longo da mesma trajetória em que a cânula era avançado para a colocação. Cérebros foram removidos da calota craniana e imersos por 12 horas no fixador mesmo.
Para avaliação da perfusão sustentado da Verde Fast, secções com uma espessura de 200 mM foram cortados com uma Vibratome (myNeuroLab, St. Louis, MO) e montado em lâminas de vidro molhado. Secções representativas foram fotografadas usando um scanner Canon CanoScan LiDE 600F. Para avaliação de trauma local e gliose reativa, seções 70μm Vibratome foram os primeiros wet-montados e fotografados imaculada para evitar a distorção do tecido que pode ocorrer com os processos histológicos, tais como secagem, manchas e desidratação. Estas mesmas seções foram, então, deixa-se secar em seus slides gelatina-revestido de vidro, e eles foram coradas com hematoxilina e eosina (H & E), desidratados com álcoois graduados, e cubra-escorregou com Permount.
70 seções adjacentes mM foram submetidos a procedimento padrão de imunofluorescência para detectar glial fibrilar proteína ácida (GFAP), que é expressa por astrócitos durante o processo de gliose reativa em resposta ao trauma (Ding et al, 2000;.. Ma et al, 1991). Brevemente, de livre flutuação cortes foram lavados com PBS e bloqueados com 10% de soro normal de burro (NDS) e 3% de soro albumina bovina em 0,1 M PBS com 0,3% Triton X-100 (PBS / Triton) por uma hora e, em seguida, incubadas em coelho de anticorpos anti-GFAP (1:500; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) em PBS / Triton com NDS 1% por 12 horas a 4 ° C. Os cortes foram então lavados com PBS e incubadas com Alexa Fluor ® 594 anticorpos burro-antirabbit secundário (1:500; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) em PBS com 5% NDS durante uma hora a temperatura ambiente. Os cortes foram cuidadosamente lavados novamente com PBS e contrastado com NeuroTrace ® verde fluorescente mancha Nissl (1:500 em PBS por 5 minutos; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Depois de um enxágüe final com PBS, os cortes foram montados em gelatina-revestido com lâminas e lamínulas Slow-Fade (Molecular Probes). Todas as fotomicrografias foram obtidas utilizando um microscópio Zeiss com Axioskop AxioVision software (Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY).
Resultados
Testes in vitro
Antes da avaliação em animais, três sistemas microinfusion foram preparados colocando seus Fast Green-cheia em MOPs em um compartimento (15 ml tubo cônico) e colocando sua microcânulas em um segundo compartimento (1 ml Epp Endorf tubo), ambos contendo salina estéril a 37 ° C. Cada sistema demonstrou fluxo contínuo de tinta com mais de 12 horas de observação. A Figura 4 ilustra a função de um sistema típico ao longo de 3 horas.
Figura 4: Na demonstração in vitro da função do sistema microinfusion. (A) Fluxo de corante Verde Fast é facilmente vista desimpedida da microcânula, no início de um período de teste in vitro. (B) Como o fluxo continua, a solução torna-se saturado reservatório (B) e, finalmente, opacas, com coloração (C).
Avaliação do sistema in vivo microinfusion
Após a perfusão, as microcânulas removidos e suas conexões foram cuidadosamente inspecionados, e todos foram encontrados para ser inteiramente intactas. Assim, não ocorreu nenhuma quebra do vidro de borosilicato dentro do tecido, nem havia qualquer defeito nas conexões dos componentes do sistema. A 10. L de solução salina seringa Hamilton com um pequeno pedaço de tubo de silicone conectado à sua agulha foi usado para aplicar o fluxo suave para a extremidade cortada do tubo de polietileno ligado à microcânula. Todos os doze do microcânulas permitido fluxo contínuo e não parecem ser obstruído. Além disso, após a remoção de cada MOP dos animais, o volume da solução remanescente foi medida e encontrada para ser apropriado para a taxa de fluxo de MOP (0,125 mL / h) ea quantidade de tempo que foi autorizado a funcionar.
Na entrega vivo
Avaliação dos cortes coronais de tecido infundido com Green Rápido demonstrou pouca variabilidade na distribuição entre os animais dentro dos grupos, em qualquer ponto determinado momento (12 horas, um dia, dois dias, e 4 dias). A Figura 5 ilustra áreas representativas de difusão Verde rápido nesses momentos mostrando um aumento progressivo na infiltração de corante ao longo de quatro dias. Note-se que experimentos anteriores com maiores concentrações de Verde Fast (por exemplo, 5-15%) resultou em rápida opacificação do parênquima, ocultando assim a avaliação precisa da função do sistema microinfusion ao longo do tempo. Enquanto toda a extensão da difusão de corante a 1% pode ser difícil determinar com precisão na inspeção bruta, áreas de infiltração foram facilmente perceptível na ampliação 2.5X, e são indicados com linhas tracejadas na Figura 5.
Figura 5: Em demonstation vivo de microinfusion sustentado do Verde Fast. (A) Doze horas após a colocação de um sistema intrastriatal microinfusion Fast Green-carregado, a tintura é visto difusão no parênquima que circunda o local microcânula. Observações em um dia (B), 2 dias (C), e 4 dias (D) indicam a continuidade da prestação solução Verde rápida com áreas cada vez maiores de infiltração de corante. O limite exterior da difusão foi observado sob microscopia de baixa potência e é indicado aqui com linhas tracejadas. Escala de bar, 2 mm.
Avaliação do trauma e gliose reativa
Observação bruta de recém-cortada, cortes de tecidos corados mostraram que o sistema microinfusion resultou em uma redução no trauma localizada no local da entrega. A cânula padrão foi invariavelmente visto para romper e deslocar uma maior área de tecido (Fig. 6B e C), o que é melhor apreciado com maior poder com H & E (Fig. 6D & E). Além disso, o sangue era visto freqüentemente acumulados no local da infusão padrão (Fig. 6D), sugerindo um maior grau de comprometimento da vasculatura e implicando diminuição da integridade da barreira hemato-encefálica.
O sistema microinfusion também resultou em grande redução gliose reativa como demonstrado pela diminuição da imunorreatividade para GFAP nos arredores de infusão através de uma microcânula (Fig. 6G) quando comparado com um padrão de cânula (Fig. 6F). Enquanto microcânula induzida coloração GFAP foi elevada acima dos níveis normais (Fig. 6H), a escalada impressionante na gliose reativa com a colocação de cânula padrão e infusão (6F) não foi visto quando o sistema foi empregado microinfusion.
Ivery cânula após 5 dias de infusão de soro fisiológico. (A) A microcânula puxou a partir de tubos de borosilicato com diâmetro da ponta de 50. M permite o fluxo livre irrestrito da maioria dos agentes neuroactive, ainda é menor do que um 6X padrão de entrega cânula (28 ga, 0,30 mm). (B, C) não corado, montagens de seções molhado coronal (espessura, 70. M) ilustrando maior dano tecidual local (setas) causados por um padrão cânula (B) quando comparado com uma microcânula (C). (D, E) fotomicrografias Superior poder de H & E cortes corados mostrado na B e C, respectivamente. A cânula padrão causou mais extensa lesão traumática, como ilustrado na D, tendo deslocado uma área maior de tecido e causando maior insulto à vasculatura como demonstrado pela coleta de sangue dentro da cavidade da lesão (seta). A lesão causada pela microcânula, no entanto, é consideravelmente menor e menos prejudicial para o tecido no local da infusão. (F, G, H) imunofluorescência contra GFAP demonstra dramaticamente aumento do número de astrócitos GFAP + ao redor da lesão da cânula padrão (F) quando comparado ao da microcânula (G) e striatum, normal unlesioned (H). Barras de escala: A & B, 1 mm; D - H, 250 m. "/>.
Figura 6: trauma localizada causada por uma microcânula em comparação com uma cânula de entrega padrão após 5 dias de infusão de soro fisiológico. (A) A microcânula puxou a partir de tubos de borosilicato com diâmetro de 50 mm ponta permite o fluxo livre irrestrito da maioria dos agentes neuroactive, ainda é menor do que um 6X padrão de entrega cânula (28 ga, 0,30 mm). (B, C) não corado, montagens de seções molhado coronal (espessura, 70 mm), ilustrando um maior dano tecidual local (setas) causados por uma cânula padrão (B) quando comparado com uma microcânula (C). (D, E) fotomicrografias Superior poder de H & E cortes corados mostrado na B e C, respectivamente. A cânula padrão causou mais extensa lesão traumática, como ilustrado na D, tendo deslocado uma área maior de tecido e causando maior insulto à vasculatura como demonstrado pela coleta de sangue dentro da cavidade da lesão (seta). A lesão causada pela microcânula, no entanto, é consideravelmente menor e menos prejudicial para o tecido no local da infusão. (F, G, H) imunofluorescência contra GFAP demonstra dramaticamente aumento do número de astrócitos GFAP + ao redor da lesão da cânula padrão (F) quando comparado ao da microcânula (G) e striatum, normal unlesioned (H). Barras de escala: A & B, 1 mm; D - H, 250 mM.
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Discussion
Vários estudos têm demonstrado que, diminuindo o tamanho da cânula de entrega para infusões intracerebrais, trauma tecidual e insulto à barreira hemato-encefálica são reduzidos (Perry et al., 1993), a inflamação é diminuído eo atenuada imuno-resposta (Finsen et al gliose., 1991), e reativa é diminuída (Nikkhah et al., 1994). Apresentamos aqui um método para a entrega crônica de agentes neuroactive dentro do cérebro através de uma microcânula, com um diâmetro que é reduzida de 6 vezes comparado ao de cânulas de entrega convencionalmente utilizados. Temos demonstrado que este sistema oferece uma solução confiável representante ao longo do tempo e do nível de trauma localizado e gliose reativa é drasticamente reduzido. Esses estudos avaliaram uma cânula de entrega com um diâmetro da ponta final de 50 m, no entanto, diâmetros menores dica pode ser utilizada. A virtude principal de sistemas microinfusion tal é a sua capacidade de fornecer agentes para muito pequeno, metas discretas, enquanto incorrer trauma mínimo nas imediações da infusão.
As microcânulas utilizados na construção do sistema de infusão que descrevemos podem ser facilmente personalizados construídos com comprimentos e diâmetros predeterminados ponta. O sistema é microinfusion concebidos de acordo com a superfície do crânio do animal, permitindo segura, a fixação de baixo perfil e excluindo a necessidade de um grande pedestal craniana. A ferida cirúrgica pode, portanto, ser facilmente suturada sobre o pedestal microinfusion simplificada, reduzindo tanto o desconforto ao animal e ao risco de infecção. Além disso, assegurar que o sistema do crânio requer menos área de superfície do crânio e, portanto, procedimentos adicionais ou subsequente pode ser realizada sem a interferência de um grande pedestal.
Deve-se, no entanto, ter em conta certas considerações técnicas quando se emprega a metodologia descrita aqui. Um elevado nível de habilidade é necessária, eo processo de produção e implantação é menos eficiente do que o tempo pode ser para sistemas de infusão padrão. Por outro lado, isso pode ser superado, ou pelo menos contrabalançadas, pelo tempo (e animais) poupada pela prática de alta precisão técnica. Outra dificuldade é que enquanto a microcânula pode ser personalizado com praticamente qualquer diâmetro, uma microcânula com um lúmen pequeno pode tornar-se obstruída, seja por componentes do infusato ou por tecido encontrados durante a implantação (por exemplo, o sangue do tecido cerebral). Este risco é reduzido, mantendo a ponta microcânula umedecido (por exemplo, usando uma água ou solução salina saturada de algodão para evitar a secagem de solutos infusato) durante o processo de implantação e realizando limpa ", sem sangue" da cirurgia.
Recomendamos que o pesquisador estabelecer um diâmetro da ponta microcânula que é apropriado para a composição particular e / ou viscosidade da solução que será carregado no MOP. Isso é facilmente conseguido através de um sistema de teste in vitro semelhante à descrita no protocolo (Fig. 4), ou simplesmente mergulhar o sistema montado em um banho de 37 ° C salina e monitoramento da composição do banho e / ou medir o volume do conteúdo MOP ao longo do tempo. A desvantagem é que a microcânula é relativamente frágil, especialmente se o seu diâmetro da ponta é muito pequeno (por exemplo, ~ 10-50 microns). Acidentalmente quebrar a microcânula durante a cirurgia geralmente requer que todo o sistema ser substituído, como a reparação ou reconstrução de que a unidade iria prolongar o tempo de cirurgia consideravelmente. Cientistas especializados em técnicas como e quem método prática exigentes raramente quebra experiência, no entanto.
Na conclusão do experimento, o sistema microinfusion pode ser inspecionado para garantir que a microcânula não foi danificado e que ela manteve-se patente. O volume da bomba mini-osmótica também pode ser medido para assegurar que a quantidade adequada de agente neuroactive foi entregue; não recomendamos a reciclagem ou a reutilização das bombas, no entanto. Embora os métodos presentes foram demonstrados em ratos adultos, o uso de um sistema que reduz o trauma e requer menos área de superfície do crânio para a fixação pode ser considerado preferível em relação aos métodos convencionais para experimentos com animais pequenos, como camundongos ou ratos jovens.
Embora o presente método requer um nível um pouco mais avançado de proficiência e habilidade pelo experimentador, ele oferece para aumentar a precisão, talvez, por uma ordem de magnitude, e para minimizar confunde experimental associado com trauma na região de interesse. Em nosso laboratório, descobrimos que isso se traduz em efeitos mais confiável e robusto da intervenção experimental.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Mini-osmotic pumps (MOPs) | Tool |  ALZET |
model #1002 | |
| Electrode puller | Tool | Stoelting Co. | ||
| Borosilicate tubing | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-6 | |
| Microforceps | Surgery | World Precision Instruments, Inc. | ||
| Polyethylene tubing | Surgery | Plastics One | #C312 VT | |
| LumaBond | Reagent | myNeuroLab, Inc |
References
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Neurociência questão 13 a bomba osmótica mini infusão crônica microcânula fast verdeErratum
Formal Correction: Erratum: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents.
Posted by JoVE Editors on 04/01/2012.
Citeable Link.
A correction was made to: Construction and Implantation of a Microinfusion System for Sustained Delivery of Neuroactive Agents. A key reference was excluded and a revised abstract was republished.
Additional Reference:
22. Cunningham, M.G., Ames, H.M., Donalds, R.A., & Benes, F.M. Construction and implantation of a microinfusion system for sustained delivery of neuroactive agents. Journal of Neuroscience Methods 167, 213-220, doi:10.1016/j.jneumeth.2007.08.016 (2008).
Revised Abstract:
Sustained delivery of neuroactive agents is widely used in neuroscience, but poses many technical challenges. It is necessary to deliver the agent with high precision while minimizing localized trauma and inflammation. Also, the ability to customize the system to accommodate animals of different species and sizes is desirable. This video presentation demonstrates the construction of an infusion system that can be fitted to any particular research animal. The delivery microcannula diameter is approximately 10-fold smaller than most infusion cannulas presently used. This translates into enhanced accuracy and reduced trauma to the brain region under study. The delivery cannula can also be sculpted to fit the contour of the surface of the animal's skull, thereby allowing closure of the scalp incision neatly over the infusion system, precluding the need for a skull-mounted pedestal, reducing risk of infection, and ensuring a greater level of comfort to the animal. The system is assembled in an air-free environment and requires the researcher to fashion glass micropipettes with a heat source. These construction methods require special skills that are best acquired, if not in person, using video instruction. (This article is based on work first reported in J Neurosci Methods. 2008 Jan 30;167(2):213-20. Epub 2007 Aug 28.).
Original Abstract:
Experimental protocols used for chronic infusion of neuroactive agents within regions of the brain often utilize a mini-osmotic pump system. Agents are commonly delivered via a stainless steel cannula with a diameter of 0.30 mm or greater. Systems utilizing a cannula of this caliber may impose trauma to the area of interest resulting in architectural damage, thereby compromising structural integrity and normal functioning. As neuroscience inquiry becomes more sophisticated, investigation of brain structures and circuitry requires improved levels of accuracy and higher resolution. We have developed a method for the preparation and implantation of a chronic infusion system within the brain utilizing a borosilicate microcannula with a tip diameter of 50 microns. This technique reduces damage to the local environment and diminishes reactive gliosis at the site of infusion. The configuration of the microinfusion system is also able to conform to the surface of the animal's skull, precluding the need for large cranial pedestals, thus facilitating closure of the scalp incision and reducing the risk of infection. We demonstrate reliable sustained delivery of a dye having a representative molecular weight using an in vitro model and in vivo studies in rats.
