Summary
וידאו זה מדגים כיצד לגדול בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) על העכבר עובריים (MEF) תאים פיברובלסטים מזין. חלק 1 מתוך 3.
Abstract
וידאו זה מדגים כיצד לגדול בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) על העכבר עובריים (MEF) תאים פיברובלסטים מזין.
Protocol
פיצול תאים אנושיים גזע עובריים (hESCs) מצופה על fibroblasts העכבר עובריים (MEFs)
בדרך כלל צלחת hESC ומחוברות ניתן לפצל 1:06-1:10, בהתאם לקו hESC בפרט. צלחת לפצל יהפוך ומחוברות שוב 5-7 ימים לאחר פיצול.
- יומיים לפני פיצול, gelatinize צלחות באמצעות פתרון ג'לטין 0.1%. עבור צלחת 6-היטב, מוסיפים 2ml לתוך כל צלחת היטב דגירה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 רקמה תרבות חממה לילה.
- פלייט MEFs על gelatinized 6 צלחות גם יום לפני שאתה מתכנן לפצל את hESCs. (הערה: MEFs יכול להיות מצופה רבים כמו 3 ימים קודם לכן אם יש צורך לאחר ~ 3 ימים, MEFs להיות שטוח יותר ויותר להתפשט החוצה ולא ניתן לקיים hESCs כמו גם טרי MEFs יכול..) קח בקבוקון של g-מוקרן או mitomycin C שטופלו CF1 MEFs, המכיל 5-6 x 10 6 תאים, החל להפשיר חנקן נוזלי 2 דקות בתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. שטפי פעם עם תאים חמים תרבות מדיה MEF בצינור בז 50 מ"ל ו resuspend בכרך האחרון של מדיה ותרבות חם MEF. בשעה 5-6 x 10 6 תאים, זה מספיק כדי בצלחת שתיים או שלוש 6-גם הצלחות.
- בעוד MEFs מנקים, להוציא את צלחות gelatinized, להסיר כל פתרון מבארות ומוסיפים 2.5 מ"ל של מדיה MEF תרבות לכל טוב.
- הוסף 0.5 מ"ל של השעיה MEF לכל היטב כדי להשיג 3ml כמו נפח סופי היטב כל אחד. ודא MEFs מפוזרים באופן שווה וצלחות מקום בחזרה בחממה לילה להתיישב.
- ביום פיצול hESC, להכין טרי או להשתמש <2 בן שבוע פתרון סטרילי collagenase IV ב 1mg/ml. הסר את כל התקשורת מבארות hESC שברצונך לפצל, לשטוף פעם עם 2ml לכל היטב 1 חם × PBS, pH 7.4, ולהוסיף 1ml של תמיסת IV collagenase. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות. קחו את הצלחת 6-היטב hESC מתוך האינקובטור ולהוסיף 1ml של ES התקשורת (ללא bFGF) היטב כל אחד. באמצעות פתרון טוב לכל, עם טפטפת 1ml להתחנף לתקשורת המכה בתאי גזע מעל הצלחת. גם עבור כל זה ייקח בערך 5-10 חזרות. ואז, להעביר את hESCs מושעה לתוך צינור בז 50 מ"ל. האם זה עבור כל בארות להיות מפוצל לשלב הגליל האחד בז 50 מ"ל. גלולה hESCs בטמפרטורת החדר 200 גרם ב 5 דקות ולשטוף פעם אחת עם התקשורת ES חסר bFGF.
- בעוד hESCs מנקים, להוציא את צלחות MEF, להסיר את כל התקשורת מבארות ולשטוף פעם עם סטרילי, חם 1 × PBS, pH 7.4 מכן להוסיף 2.5 מ"ל של ES מדיה (בתוספת עכשיו עם 10 ng / ml bFGF) לכל כן.
- Resuspend hESCs pelleted בנפח מתאים של התקשורת ES, בתוספת 10ng/ml bFGF. (הערה:.. כאשר הם hESCs resuspended, הם צריכים להיות בגודל אחיד המושבה בערך ובצורה נפח resuspension תלוי יחס הפיצול) בזהירות פיפטה ההשעיה hESC למעלה ולמטה כמה פעמים לעשות במושבות קטנות יותר אחיד, אבל לא כל כך הרבה תאים בודדים או במושבות קטנות מאוד נוצרות. הוסף 0.5 מ"ל של השעיה hESC לכל היטב את הצלחות MEF להשיג 3 מ"ל נפח סופי היטב כל אחד. ראייה לבדוק כדי לוודא כי hESCs מופצים באופן שווה לפני הצבת לוחות בחזרה בחממה לילה להתיישב. לאחר ציפוי, זה יהיה בדרך כלל לוקח כמה ימים מושבות לקחת על הצורה האופיינית שלהם והמראה הגבול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
וידאו זה מדגים כיצד לגדול בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) על העכבר עובריים (MEF) תאים פיברובלסטים מזין. בשלב האחרון לפני ציפוי, כאשר הם hESCs resuspended, הם צריכים להיות בגודל אחיד המושבה בערך וצורה. בזהירות פיפטה ההשעיה hESC למעלה ולמטה כמה פעמים לעשות במושבות קטנות אחיד יותר, אבל לא כל כך הרבה תאים בודדים או במושבות קטנות מאוד הם מכתים generated.Immunofluorescence ו cytometry מיקרוסקופית או זרימה עבור סמנים hESC pluripotency, כגון אוקטובר, 4 ו SSEA-4, יש צורך לאשר אחזקת hESCs במצב מובחן במהלך התרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
האדם מחקרים בתאי גזע עובריים במעבדה Teitell נתמכים על ידי המכון לרפואה בקליפורניה הרגנרציה (CIRM) זרע מענק RS1-00313. אנו מודים לחברי המרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית ואת המחקר בתאי גזע ב-UCLA, במיוחד ד"ר Amander קלארק, ד"ר ג'רום זק, וחברי רחבה UCLA מכון מתקן נייד Core גזע על תמיכתם של מחקרים שלנו.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).
