Summary
Questo video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) sulle cellule dei fibroblasti del mouse (MEF) le cellule di alimentazione. Parte 1 di 3.
Abstract
Questo video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) sulle cellule dei fibroblasti del mouse (MEF) le cellule di alimentazione.
Protocol
Dividere le cellule staminali embrionali umane (hESC) placcato al passaggio del mouse fibroblasti embrionali (MEF)
Di solito un piatto hESC confluenti possono essere divisi 1:06-1:10, a seconda della linea hESC particolare. Il piatto sarà diviso confluenti ancora 5-7 giorni dopo la divisione.
- Due giorni prima della scissione, gelatinizzare piatti utilizzando una soluzione 0,1% di gelatina. Per un 6-pozzetti, aggiungere 2 ml in ogni piatto e incubare a 37 ° C, 5% CO 2 colture di tessuti incubatore durante la notte.
- Piastra MEF sul gelatinizzato 6-pozzetti il giorno prima si pensa di dividere la hESC. (NOTA: MEF può essere placcato fino a 3 giorni prima, se necessario, dopo ~ 3 giorni, MEF si appiattiscono e più diffusa-out e non possono sostenere hESC e più fresca MEF può..) Prendere un flacone di g-irradiati o mitomicina C trattati CF1 MEF, contenente 5-6 x 10 6 cellule, da azoto liquido e scongelare per 2 minuti in un bagno d'acqua a 37 ° C. Lavare le cellule una volta con Media caldo Cultura MEF in un tubo da 50 ml falco e risospendere nel volume finale di Media caldo Cultura MEF. A 5-6 x 10 6 cellule, questo è sufficiente per due o tre piastre da 6 pozzetti.
- Mentre il MEF sono stati lavati, togliere i piatti gelatinizzati, rimuovere tutti soluzione dai pozzetti e aggiungere 2,5 ml di Media Cultura MEF per bene.
- Aggiungere 0,5 ml di sospensione MEF per bene per ottenere 3 ml come un volume finale di ogni bene. Assicurarsi MEF non è completamente disperso e piastre posto indietro nella notte per risolvere incubatrice.
- Il giorno della scissione hESC, preparare freschi o utilizzare <2 settimane di età soluzione sterile collagenasi IV a 1mg/ml. Rimuovere tutti i media dai pozzetti hESC si desidera dividere, lavare una volta con 2 ml per pozzetto di caldo 1 × PBS, pH 7,4, e aggiungere 1 ml di soluzione di collagenasi IV. Incubare a 37 ° C per 5-10 min. Prendere il 6-pozzetti hESC fuori dell'incubatore e aggiungere 1 ml di ES media (senza bFGF) in ciascun pozzetto. Utilizzando la soluzione in ogni pozzetto, con una pipetta 1 ml aspirare i media e far saltare le cellule staminali al largo della piastra. Per ogni bene ci vorranno circa 5 a 10 ripetizioni. Poi, il trasferimento hESC sospeso in un tubo da 50 ml falco. Fate questo per tutti i pozzi di essere per tagliare e unire in un unico tubo falcon da 50ml. Agglomerare le hESC a temperatura ambiente a 200 g per 5 minuti e lavare una volta con i media ES manca bFGF.
- Mentre i hESC vengono lavati, togliere i piatti MEF, rimuovere tutti i supporti dai pozzetti e lavare una volta con sterile, caldo 1 × PBS, pH 7,4 quindi aggiungere 2,5 ml di ES media (ora integrato con 10 ng / ml bFGF) per bene.
- Risospendere il pellet hESC in un volume adeguato di mezzi di ES, integrato con 10ng/ml bFGF. (NOTA:.. Quando le hESC sono risospesi, dovrebbero essere di dimensioni della colonia o meno uniforme e la forma, il volume risospensione dipende dal rapporto di splittaggio) pipetta con attenzione la sospensione hESC su e giù per un paio di volte a rendere le colonie più piccole e più uniformi, ma non così tanto che le singole cellule o colonie molto piccole sono generati. Aggiungere 0,5 ml di sospensione hESC per bene le piastre MEF per ottenere 3 ml come un volume finale di ogni bene. Controllare visivamente per assicurarsi che le hESC sono distribuiti in modo uniforme prima di mettere le piastre indietro nell'incubatore durante la notte per risolvere. Dopo la placcatura, di solito necessari alcuni giorni per le colonie ad assumere la loro forma caratteristica e l'aspetto di confine.
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Discussion
Questo video dimostra come far crescere cellule staminali embrionali umane (hESC) sulle cellule dei fibroblasti del mouse (MEF) le cellule di alimentazione. Nell'ultimo passaggio prima della placcatura, quando le hESC sono risospesi, dovrebbero essere di dimensioni della colonia o meno uniforme e la forma. Con attenzione pipetta la sospensione hESC su e giù per un paio di volte a fare le colonie più piccole e più uniformi, ma non così tanto che le singole cellule o colonie sono molto piccole macchie generated.Immunofluorescence e citometria a flusso o microscopia per i marcatori hESC pluripotenza, come Ott- 4 e SSE-4, sono necessari per confermare la manutenzione di hESC in uno stato indifferenziato durante cultura.
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Acknowledgments
Embrionali umane studi sulle cellule staminali in laboratorio Teitell sono supportati da una California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) sementi concedere RS1-00313. Ringraziamo i membri del Centro di Medicina Rigenerativa Broad e ricerca sulle cellule staminali presso la UCLA, in particolare il Dott. Amander Clark, il Dr. Jerome Zack, e membri del Fondo per la UCLA Stem Cell Institute Broad core per il loro sostegno dei nostri studi.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).
