Summary
このビデオでは、マウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダー細胞上でヒト胚性幹細胞（ヒトES）を成長させる方法を示しています。 3のパート1。
Abstract
このビデオでは、マウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダー細胞上でヒト胚性幹細胞（ヒトES）を成長させる方法を示しています。
Protocol
マウス胚性繊維芽細胞（MEF）上に播種した分割するヒト胚性幹細胞（ヒトES）
通常コンフルエントhESCのプレートは、特定のhESCのラインに応じて、1:10に1時06分を分割することができます。分割板が分割後に再度5〜7日間コンフルエントになります。
- 分割の前に2日間、0.1％ゼラチン溶液を用いてプレートをゼラチン状にする。 6ウェルプレートの場合は、一晩37℃、5％CO 2組織培養インキュベーターで各ウェルでインキュベートプレートに2ミリリットルを追加します。
- ゼラチン6ウェルプレート上にプレートMEFのあなたが分割でヒトES細胞を計画する前に、一日。 （注：MEFのは3日以前の必要に応じて、できるだけ多くのようにめっきすることができる〜3日後、MEFのは平坦とスプレッドアウトよりとMEFのできるヒトES細胞だけでなく、新鮮を維持できないとなる。。）G -照射またはマイトマイシンのバイアルテイクCは37℃の水浴中で2分間液体窒素と雪解けから、5-6 × 10 6個の細胞を含む、CF1 MEFSを扱う。 50ミリリットルファルコンチューブに暖かいMEFの培養培地で細胞を1回洗浄し、暖かいMEF培地の最終容量に再懸濁します。 5〜6 × 10 6個の細胞では、これは十分な板二、三、6ウェルプレートになります。
- MEFのが洗浄されている間、ゼラチン化プレートを取り出して、井戸からすべてのソリューションを削除し、ウェルあたりMEF培地の2.5 mlを加える。
- 各ウェルの最終容量として3ミリリットル達成するために、ウェルあたりMEFの懸濁液の0.5mlを追加。 MEFのは均等に分散して戻って解決するために一晩培養器内の場所の板されていることを確認します。
- ヒトES細胞の分裂の日に、1mg/mlで新鮮なまたは使用<2週齢の無菌コラゲナーゼIV溶液を調製。分割したいhESCの井戸からすべてのメディアを削除し、2ミリリットルあたりも暖かい1 × PBS、pH7.4で一回洗浄し、コラゲナーゼIV液を1ml加える。 37℃で5〜10分間インキュベートする。インキュベーターのうち6ウェルhESCのプレートを取ると、各ウェルにESメディア（bFGFを除く）の1mlを加える。各ウェル内の溶液を用いて、1mlのピペットを使用してメディアを吸い上げるとプレートの幹細胞を吹き飛ばす。各ウェルについて、これは約5〜10回の繰り返しがかかります。その後、50ミリリットルのファルコンチューブに懸ヒトES細胞を譲渡する。分割されるすべてのウェルに対して、この手順を実行一50ミリリットルファルコンチューブに結合する。ペレットは、5分間200グラムで、室温でヒトESおよびbFGFを欠くESメディアで1回洗う。
- ヒトES細胞を洗浄されている間、、MEFのプレートを取り出す井戸からすべてのメディアを削除し、1回洗浄滅菌、暖かい1 × PBS、pHを7.4にしてESメディア2.5mlの（現在は10 ng / mlのbFGFを添加）あたりを追加するうまく。
- 10ng/mlのbFGFを添加したESメディアの適切な量のペレットヒトES細胞を、懸濁します。 （注意：。。ヒトES細胞が再懸濁するとき、彼らはほぼ均一なコロニーの大きさや形があるはずの再懸濁のボリュームが分割比に依存する）ピペットはhESCのサスペンションを上下に数回コロニーは小さく、より均一にするため、しかし、そうでもない、単一の細胞または非常に小さなコロニーが生成されていること。各ウェルの最終容量として3mlを達成するためにMEFプレートにウェル当たりhESCの懸濁液0.5mlを追加します。視覚的にヒトES細胞を沈降一晩インキュベーターにバックプレートを配置する前に均等に分散されていることを確認してください。メッキした後、それは通常、コロニーが彼らの特徴的な形状と境界線の外観に反映するために数日かかります。
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Discussion
このビデオでは、マウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダー細胞上でヒト胚性幹細胞（ヒトES）を成長させる方法を示しています。メッキ前の最後のステップでは、ヒトES細胞が再懸濁するとき、彼らはほぼ均一なコロニーの大きさと形状でなければならない。慎重にコロニーが小さく、より均一にするため、上下に数回hESCの懸濁液をピペットではなく、あまり単一の細胞または非常に小さいコロニーのようなhESCの多能性マーカー年10月 - のためのgenerated.Immunofluorescence染色および顕微鏡またはフローサイトメトリーであることを4、SSEA - 4は、培養中の未分化状態のヒトES細胞の維持を確認するために必要です。
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Acknowledgments
Teitellラボでヒト胚性幹細胞研究は再生医療のためのカリフォルニア工科大学（CIRM）種子助成RS1 - 00313でサポートされています。我々は、UCLA、特に博士Amanderクラーク博士ジェロームザック、そして我々の研究の支援のためのUCLAのブロード研究所の幹細胞の中核施設のメンバーで、再生医療と幹細胞研究のブロードセンターのメンバーに感謝。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science . 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology . 19, 971-974 (2001).
