Desde que me MEFs Matrigel: hESCs pases en la presencia de MEFs

Summary

Este video muestra la forma de crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en células embrionarias de ratón fibroblastos de alimentación (MEF).

Abstract

Este video muestra la forma de crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en células embrionarias de ratón fibroblastos de alimentación (MEF).

Protocol

Dividir las células madre embrionarias humanas (hESCs) chapada en fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs)

Por lo general, una placa de células madre confluentes se puede dividir 01:06-1:10, dependiendo de la línea de células madre en particular. La placa de división, confluyen de nuevo 5-7 días después de partir.

1. Dos días antes de partir, gelatinizar las placas con una solución de gelatina al 0,1%. Para una placa de 6 pocillos, agregar 2 ml en cada pocillo de la placa y se incuba en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora de cultivo de tejido durante la noche.
2. Placa MEFs en gelatinizado placas de 6 pocillos el día antes de planificar sobre la división del hESCs. (NOTA: MEFs se puede platear hasta 3 días antes, si es necesario después de ~ 3 días, MEFs se vuelven más planos y más dispersa y no se puede sostener hESCs así como más fresco MEFs puede..) Tome un frasco de g-irradiados o mitomicina C tratados CF1 MEFs, que contiene 6.5 x 10 ⁶ células, a partir de nitrógeno líquido y descongelación durante 2 minutos en un baño de agua a 37 ° C. Lave las células una vez con los medios de comunicación cálida MEF Cultura en un tubo de 50 ml de halcón y resuspender en el volumen final de calentar el medio de MEF Cultura. En 5.6 x 10 ⁶ células, esto es suficiente para la placa de dos o tres placas de 6 pocillos.
3. Mientras que el MEFs se están lavando, sacar las placas gelatinizada, eliminar toda la solución de los pozos y añadir 2,5 ml de medios de cultivo MEF por pozo.
4. Añadir 0,5 ml de suspensión por el MEF, así como para lograr 3 ml un volumen final en cada pocillo. Asegúrese de que MEFs son distribuidas uniformemente y coloque los platos de nuevo en la noche a la mañana para resolver la incubadora.
5. El día de la división de células madre, preparar dulce o uso <2 semanas de edad estéril solución de colagenasa IV a 1mg/ml. Quite todos los medios de comunicación de los pozos de células madre que desea dividir, lavar una vez con 2 ml por pocillo de agua tibia 1 × PBS, pH 7,4, y añadir 1 ml de solución de colagenasa IV. Se incuba a 37 ° C durante 5-10 minutos. Tome la placa de células madre 6-y fuera de la incubadora y añadir 1 ml de ES medios de comunicación (sin bFGF) a cada pocillo. Usando la solución en cada pozo, con una pipeta de 1 ml aspirar los medios de comunicación y de golpe las células madre fuera de la placa. Para cada bien esta será de unos 5 a 10 repeticiones. Entonces, la transferencia de la hESCs suspendido en un tubo de 50 ml de halcón. Hacer esto para todos los pozos que se divide y se combinan en un tubo Falcon de 50ml. Se precipitan los hESCs a temperatura ambiente a 200 g por 5 min y lavar una vez con los medios de comunicación carecen ES bFGF.
6. Mientras que el hESCs se están lavando, sacar las placas MEF, quite todos los medios de comunicación de los pocillos y lavar una vez con agua estéril, tibia 1 × PBS, pH 7,4, a continuación, añadir 2,5 ml de ES medios de comunicación (ahora complementado con 10 ng / ml bFGF) por así.
7. Resuspender el hESCs granulado en un volumen adecuado de los medios de ES, complementado con 10ng/ml bFGF. (NOTA:.. Cuando el hESCs se resuspenden, deben ser de tamaño de las colonias más o menos uniforme y la forma, el volumen de resuspensión depende de la relación de división) con cuidado la pipeta la suspensión células madre hacia arriba y abajo varias veces para que las colonias más pequeñas y más uniformes, pero no tanto que las células individuales o colonias muy pequeñas se generan. Añadir 0,5 ml de suspensión de células madre por así a las placas MEF para lograr 3 ml en un volumen final en cada pocillo. Compruebe visualmente para asegurarse de que la hESCs se distribuyen uniformemente antes de colocar las placas de nuevo en la incubadora durante la noche a un acuerdo. Después de la siembra, por lo general se toman unos días de colonias a tomar su forma característica y apariencia de los bordes.

Discussion

Este video muestra la forma de crecer células madre embrionarias humanas (hESCs) en células embrionarias de ratón fibroblastos de alimentación (MEF). En el último paso antes de chapado, cuando la hESCs se resuspenden, deben ser de tamaño de las colonias más o menos uniforme y forma. Pipeta cuidadosamente la suspensión de células madre hacia arriba y abajo varias veces para que las colonias más pequeñas y más uniforme, pero no tanto que las células individuales o colonias muy pequeñas manchas generated.Immunofluorescence y citometría de flujo o microscopía de marcadores de células madre pluripotencia, tales como Oct- 4 y 4-SSEA, son necesarios para confirmar el mantenimiento de hESCs en estado indiferenciado en cultivo.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Knockout Serum Replacer (KSR)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828-028
DMEM/F12	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330-057
Non-essential Amino Acids	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140-050
GlutaMax	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	35050-061
DMEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11995-065
FBS	Reagent	Clontech Laboratories	631107
L-glutamine	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030-081
BME	Reagent	Fisher Scientific	BP176-100
bFGF	Reagent	R&D Systems	233-FB-025
Collagenase IV	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	17104-019
Dispase	Reagent	Stem Cell Technologies	17105-041
Penicillin / Streptomycin	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Gelatin	Reagent	Chemicon International	ES-006-B
Matrigel	Reagent	BD Biosciences	354277
Oct-4 antibody	Reagent	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-9081
anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3	Reagent	R&D Systems	FAB1435P
FITCI-conjugated antirabbit IgG	Reagent	Jackson ImmunoResearch	715-095-152