Summary
Wir verwendeten Synchrotron-Tomographie an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in nicht-invasiv zu produzieren 3D-tomographischen Datensätze mit einer Pixel-Auflösung von 0.7μm. Mit Volume-Rendering-Software, ermöglicht dies die Rekonstruktion der internen Strukturen in ihrem natürlichen Zustand ohne Artefakte durch histologische Schnitte hergestellt.
Abstract
Wenig ist über die interne Organisation der vielen Mikro-Arthropoden mit Körpergrößen unter 1 mm bekannt. Die Gründe dafür sind die geringe Größe und die harte Nagelhaut ist es schwierig, Protokolle der klassischen Histologie Einsatz macht. Darüber hinaus zerstört histologische Schnitte der Probe und kann daher nicht für einzigartige Material verwendet werden. Daher ist eine zerstörungsfreie Methode wünschenswert, die in kleinen Proben ohne die Notwendigkeit der Einteilung anzeigen können.
Wir verwendeten Synchrotron-Tomographie an der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) in Grenoble (Frankreich) um nicht-invasiv zu produzieren 3D-tomographischen Datensätze mit einer Pixel-Auflösung von 0.7μm. Mit Volume-Rendering-Software, ermöglicht uns auf die interne Organisation in ihrem natürlichen Zustand ohne Artefakte durch histologische Schnitte hergestellt rekonstruieren. Diese Datum kann für quantitative Morphologie, Sehenswürdigkeiten oder für die Visualisierung von animierten Filmen eingesetzt werden, um die Struktur der verborgenen Körperteile zu verstehen und komplette Organsysteme oder Gewebe durch die Proben folgen.
Protocol
Tiere in dieser Studie verwendeten
Die Proben der parthenogenetischen Hornmilben mite Archegozetes longisetosus (Acari, Oribatida) wurden aus unserem Labor Kultur genommen. Die Kultur wächst auf einem Gips / Kohle mischen (9:1) in Plastikdosen, in ständiger Dunkelheit bei 20-23 ° C mit ca. 90% Luftfeuchtigkeit.
Probenvorbereitung
- Die Proben wurden aus der Kultur entnommen, gereinigt mit einem feinen Pinsel und in einen 06.03.01 Mischung aus 80% Ethanol, 35% Formaldehyd und 100% Essigsäure für 24 Stunden.
- Danach wurden die Proben in einer abgestuften Reihe von Ethanol 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% und 100% mit 3 Änderungen bei jeder Konzentration, und 10 min zwischen den Schritten dehydriert.
- Schließlich wurden die Proben in frischem 100% Ethanol über Nacht und kritischer Punkt in CO 2 getrocknet (CPD 020, Balzers) platziert. Getrocknete Proben wurden bis zur Spitze des Kunststoff-Stifte (, 3,0 mm im Durchmesser 1,2 cm lang) befestigt.
Synchrotron-Röntgen-Tomographie
X-ray-Tomographie wurde am Strahlrohr ID19 (ESRF, Grenoble, Frankreich, Experiment SC-2127) durchgeführt.
- Die Proben wurden in der Probe-Halterung montiert und justiert, um eine zentrale Stellung in den Strahl.
- Die Proben wurden mit einer Energie von 20,5 keV gemessen. Die Röntgenbilder wurden mit einer gekühlten CCD (ESRF Frelon Kamera) mit einem 14-Bit Dynamikbereich, 2048 × 2048 Pixeln und eine effektive Pixelgröße von 0,7 um aufgezeichnet. 1500 Projektionen wurden über die 180 ° Rotation Probe mit einer Belichtungszeit von 0,35 s für jede Projektion aufgezeichnet. Der Detektor-Probe-Abstand betrug 20 mm.
Mit einem gewissen Abstand zwischen Probe und Detektor ermöglicht eine differentielle Darstellung von Materialien mit geringer X-ray Schwächungskoeffizienten (Cloetens, et al. 1996), die aufgrund des geringen Kontrasts in Absorption Imaging produzieren (wobei die Probe direkt vor dem Detektor befinden würde ). Die meisten biologischen Fragen sind Phase-Objekte, von Materialien mit geringer Absorption und / oder nur geringe Unterschiede in der Ordnungszahl (Betz et al. 2007) zusammen. Allerdings erfordert Phase verbesserte Tomographie eine hohe räumliche Kohärenz einer homogenen Röntgenstrahl. Daher ist Synchrotronstrahlung besser als Desktop-Scanner für diese Art von Messungen geeignet.
Datenanalyse
- Die daraus resultierende 2D-Röntgenbilder wurden um 3D Voxeldaten (8-Bit-Graustufen-Werte) mit einer gefilterten Rückprojektion Algorithmus (Cloetens, et al., 1997) transformiert
- Die Voxel-Daten wurden mit der Software VGStudio Max 1.2.1 analysiert. (Volume Graphics, Heidelberg, Deutschland).
- Grey-Werte aus dem Hintergrund wurden aus dem Histogramm für 3D-Visualisierung entfernt.
- Vordefinierte Kamera-Pfade wurden verwendet, um Dreh-Animationen und animierte Schnittebenen zu erzeugen.
- Eine benutzerdefinierte Kamera-Pfad erzeugt wurde, um das Verdauungssystem des A. folgen longisetosus.
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Discussion
In dieser Präsentation, konzentrierten wir uns auf die 3D-Visualisierung der inneren Anatomie eines chelicerate Mikro-Arthropoden. Die Synchrotron-Röntgen-Messungen erlauben eine Pixel-Auflösung von bis zu 0.3μm, abhängig von der Größe der Stichprobe. Hier haben wir Daten mit 0.7μm Pixel-Auflösung dargestellt. Generell kann Synchrotron-Tomographie sinnvoll sein, für die Analyse von kleinen biologischen Materialien (oder Gewebe) mit niedrigem Röntgendämpfung. Die Pixel-Auflösung erreicht fast die von herkömmlichen Lichtmikroskopie. Die Technik kann für jede Art von Material, für die die interne Organisation von Interesse ist und was darf nicht durch Schneiden zerstört werden angewendet werden. Histologische Schnitte, hat jedoch den Vorteil, dass Gewebe differenziert kann gefärbt werden, was nicht mit Röntgen-Tomographie möglich. Aber hier, verschiedene Grau-Werte zu Geweben mit unterschiedlichen Röntgendämpfung entsprechen, und der Grauwert-Verteilung können mit Hilfe quantitativer Phase-Tomographie werden (holotomography;. Cloetens et al, 1999; Heethoff & Cloetens, 2008). Die Technik der Synchrotron-Röntgen-Tomographie ist außerordentlich wertvoll wegen den folgenden Gründen:
- Probenvorbereitung ist einfach und beschränkt sich auf Fixierung und Trocknung, keine histologischen Schnitte notwendig
- die Methode ist nicht-invasiv: die interne Organisation der Probe kann in natürlichen Zustand beobachtet werden
- die daraus resultierende Datensatz kann in beliebiger Orientierung, die sich von histologischen Schnitte, wo die Abschnitte zu einer Orientierung fixiert sind, ist analysiert werden.
Wir schlagen vor, unter Berücksichtigung dieser Technik, wenn die internen Strukturen in natürlichen Zustand der kleinen Proben oder Proben, die nicht zerstört werden (zB Fossilien in Bernstein oder Typ-Proben) muss analysiert werden sollen. Natürlich ist diese Technik nicht auf das biologische Materialien beschränkt, aber hier ist es der größte Vorteil durch die Möglichkeit der Analyse von Materialien mit Röntgenstrahlen, die niedrige Röntgendämpfung haben.
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Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Paavo Bergmann, Michael Laumann und Sebastian Schmelzle für ihre Hilfe bei der ESRF. Diese Arbeit wurde von der European Synchrotron Radiation Facility-Projekt SC-2127 durch die Zuteilung von Strahlzeit unterstützt.
References
- Betz, O., Wegst, U., Weide, D., Heethoff, M., Helfen, L., Lee, W. -K., Cloetens, P. Imaging applications of synchrotron X-ray phase-contrast microtomography in biological morphology and biomaterial science. I. General aspects of the technique and its advantages in the analysis of millimetre-sized arthropod structure. J. Microscopy. 22, 51-71 (2007).
- Cloetens, P., Barrett, R., Baruchel, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Phase objects in synchrotron radiation hard X-ray imaging. J. Phys. D: Appl. Phys. 29, 133-146 (1996).
- Cloetens, P., Pateyron-Salome, M., Buffiere, J. Y., Peix, G., Baruchel, J., Peyrin, V., Schlenker, M. Observation in microstructure and damage in materials by phase sensitive radiography and tomography. J. Apll. Phys. 81, 5878-5886 (1997).
- Clotens, P., Ludwig, W., Baruchel, J., van Dyck, D., van Landyut, J., Guigay, J. P., Schlenker, M. Holotomography: quantitative phase tomography with micrometer resolution using hard synchrotron radiation X-rays. Appl. Phys. Lett. 75, 2912-2914 (1999).
- Heethoff, M., Cloetens, P. A Comparison of aynchrotron X-ray phase contrast tomography and holotomography for non-invasive investigations of the internal anatomy of mites. Soil Organisms. , (2008).
