マウス表皮神経堤幹細胞（EPI - NCSC）文化

Summary

ここでは、マウス表皮神経堤幹細胞（EPI - NCSC）を分離する手法を示す。テクニックは、膨らみを分離し、組織培養にそれをplaceing、ミクロ解剖ウィスカの卵胞を伴います。 4日間 - EPI - NCSCは、3つの内の基層の上に膨らみの外植片からの移住を開始します。

Abstract

EPI - NCSCは大人の場所、毛包のバルジの胚神経堤の名残です。彼らは神経細胞、神経支持細胞、平滑筋細胞、骨/軟骨細胞とメラノサイトを含む分化した細胞型の広い配列を生成するために生理学的性質を持つ多能性幹細胞である。 EPI - NCSCは、有毛皮膚に容易にアクセス可能であり、幹細胞の純度の高い人口として単離することができる。このビデオでは、ウィスカの卵胞からマウスEPI - NCSC培養を調製するための詳細なプロトコルを提供します。成体マウスのウィスカーパッドが削除され、ウィスカの卵胞は、解剖される。卵胞は、バルジ領域の上下に縦方向にし、続いて横方向にカットされています。膨らみは、コラーゲンのカプセルから削除され、培養プレートに配置されます。 EPI - NCSCは3〜4日後にバルジの外植片からの移住を開始します。

Protocol

成体マウスのウィスカの卵胞からバルジの解剖

1. 我々は、10週間〜6ヵ月齢のマウスを使用してください。若いマウスでは、しばしば複数のセルをもたらす。 betadine（ヨウ素溶液）と約3分間過酸化水素（薬局から入手可能）の1:1混合物中にマウスと水没全体の動物を安楽死させる。
   
2. 潮吹き全体、特にマウス、顔領域、75％エタノールで、そして層流フードで解剖顕微鏡にマウスを運ぶ。
3. 慎重に毛の球根にカットし、HBSSでプールを避け、ウィスカーパッドを解剖。
4. 室温でのHBSSでウィスカの卵胞とプールを細かく分析。ピンセットで毛包に次のスキンを保持し、ストレートはさみで卵胞の周りにカットすることでこれを行います。毛の球根を負傷を避けるために深くカット。
5. ウィスカーパッドのウィスカの卵胞を持ち上げて、新鮮なHBSSで新しい皿に入れ。
6. ウィスカの卵胞がきれいになるまで、バッファのホヤとゆるいadipousと皮膚組織をフラッシュします。必要に応じて、ウィスカの卵胞に神経を切断し、こするとHBSSを繰り返しフラッシュすることによって付着組織を除去する。
7. 卵胞の隣にある皮膚の部分に保持するためのmicroforcepsを使用して、シャープにタングステン針を使用してSylgardコーティングされたガラスペトリ皿にきれいな毛のfollilceを固定。
8. マイクロブレードでlongitudicallyウィスカの卵胞をカット。この膨らみを傷つけるので、あまり深く切断は避けてください。なくなってまで、HBSSの繰り返しホヤで血を取り外します。血液の外観は、カットが十分な深さだったことを示しています。 longitudialカットが十分に長いではない場合、それが曲がっmicroscissorsと長くなるかもしれない。
9. 海綿静脈洞のレベルより上の横方向のカットとリングの洞内のレベルで続いて第二横カットを行い、肌に近い。
10. これで、カプセル内部の出っ張りが表示されます。
11. ピンセットでのコラーゲンのカプセルの端をつかんで、曲がったタングステン針で膨らみをロールアウト。これで、空のカプセルと分離された膨らみが表示されます。
12. プールは室温でHBSSで別々の培養プレートにふくらみを分離。他の組織がプールされたふくらみを汚染されていないことを確認します。

バルジ植の文化

1. 50μlのコラーゲンと隣同士に10μlの滅菌六パーセントのNaClを配置することによって、コラーゲンでコーティング35mmの培養プレートを。ダブル曲がったPasteyrのピペットでよく混和して、培養プレートの端に向かって押し込みます。クリーンデシケーター内で一晩インキュベートするが、乾燥させてください。使用前に、生理食塩水でプレートをすすぎます。
2. プレインキュベーションコラーゲンコート培養培地で約3時間とすすぎ培養プレート。培地は85％のα-改変MEM、10％ウシ胎児血清、5％の11日目ニワトリ胚抽出物で構成されています。
3. 再インキュベーション後、プレートから培地を除去し、できるだけ少ない培地でいくつかのふくらみを追加。過剰培地を削除します。
4. 10％酸素、5％CO ₂の加湿雰囲気で細胞インキュベーターで、1時間インキュベートする、ではなく、より長い。
5. 1時間後、静かに培養液の1.5 mlを加える。バルジの外植片は、コラーゲン基質に従ってください。毎日培養液の50％を交換してください。
6. 3内に - 4日間、高度回遊性細胞は、バルジの外植片から移住予定。それらの星状の形態、運動性、および細胞間接触の支配的な欠如を注意してください。今後数日にわたって、より多くの細胞が移住し、細胞が急速に増殖するでしょう移住予定。
7. シャープタングステン針とEPI - NCSCの移民の発症後3日間 - 膨らみ2を取り外します。バルジが長く残っている場合、それらは平坦化し、それが不可能な純粋なEPI - NCSCの文化を得るためにする傾向がある。
8. 重要 ：EPI - NCSCより数日後、時々明らかになる、と板状形態を持つ希少な細胞では、EPI - NCSC しない場合に少ない運動ですが、推定上の表皮幹細胞/前駆細胞。 EPI - NCSCと推定表皮幹細胞/前駆細胞を含むこれらの細胞で構成される文化、または混合培養では、破棄する必要があります。
9. ヒント：彼らが推定されるオートクリン/パラクリン増殖因子のシグナル伝達のために、高い細胞密度で急速に差別化する傾向があるので、長すぎる一次外植培地中でのために細胞を保持しない。

Discussion

それらの回遊能力のおかげで、EPI - NCSCは、in vitroで拡張できる幹細胞の高度に純粋な人口として単離することができる。大人の場所にある胚の残党として、EPI - NCSCは、将来の細胞置換療法、生物医学工学および/または再生医療のための潜在的に魅力的な候補です。我々は、彼らが望ましい形質を示す脊髄損傷のマウスモデルでEPI - NCSCをテストしている。我々が期待どおりに、ことを示したLongSAGE（www.ncbi.nlm.nih.gov /ジオ、シリーズ番号GSE4680）、胚の神経堤細胞とEPI - NCSCの共有による遺伝子発現プロファイリング近隣のものとは異なる類似の遺伝子発現パターンを介して表皮幹細胞と他の皮膚の常駐幹細胞/前駆細胞。