Dissectie van larvale CNS in Drosophila melanogaster

Summary

In dit artikel zullen we laten zien hoe het centrale zenuwstelsel ontleden uit derde instar Drosophila larven.

Abstract

Het centrale zenuwstelsel (CZS) van Drosophila larven is complex en slecht begrepen. Een manier om het centraal zenuwstelsel te onderzoeken is om immunohistochemie gebruiken om de expressie van verschillende nieuwe en marker-eiwitten te onderzoeken. Kleuring van hele larven is niet praktisch, omdat de harde cuticula voorkomt dat antilichamen van binnendringen in het lichaam holte. Om vlekken deze weefsels is het noodzakelijk om het dier voorafgaand ontleden de vaststelling en vlekken. In dit artikel zullen we laten zien hoe je Drosophila larven ontleden zonder beschadiging van het centrale zenuwstelsel. Begin met het scheuren van de larve in de helft met een paar fijne tang, en draai vervolgens de nagelriem "inside-out" aan het centrale zenuwstelsel bloot te leggen. Als de dissectie wordt zorgvuldig uitgevoerde CNS zal gehecht blijven aan de nagelriem. We meestal houden het centraal zenuwstelsel aan de cuticula gedurende de fixatie en kleuring stappen, en alleen volledig verwijderen van het CZS van de cuticula net voor het monteren van de monsters op glasplaatjes. We tonen ook enkele representatieve afbeeldingen van een schaal voor het CNS bevlekt met Eva, een transcriptiefactor, uitgedrukt in een subset van neuronen in het CZS. Het artikel sluit af met een bespreking van enkele van de praktische toepassingen van deze techniek en de mogelijke problemen die zich kunnen voordoen.

Protocol

1. Ontleden 3 ^e instar larven, waardoor CNS aan de cuticula. Plaats in een 1.5 ml buis.
2. Fix in PBS (1x) met 2% formaldehyde gedurende 40 min met schommelen. ; Gebruik 250ul voor elke 5-10 ontleed CNS.
3. Verwijder de formaldehyde en in het kort drie keer wassen met PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST). Gebruik een fijn getrokken Pasteur pipet om het verlies van weefsel te voorkomen.
4. Blokkeer niet-specifieke eiwit binding sites en permeabilize celmembranen door het incuberen van weefsel 1-8 uur in PBST + 5% BSA, rocken bij 4 ° C.
5. Incubeer in primair antilichaam verdund in PBST + 5% BSA rocken bij 4 ° C gedurende de nacht. Optimale antilichaamverdunning zal variëren voor verschillende antilichamen.
6. Spoel 3x in PBST gevolgd door twee 30min wassen bij 4 ° C.
7. Incubeer in secundair antilichaam verdund in PBST + 5% BSA gedurende 1-3 uur rocken bij 4 ° C. Spoel 3x in PBST gevolgd door twee 30min wassen bij 4 ° C. Als de secundaire is geconjugeerd aan een lichtgevoelige stof, wikkel de buis in aluminiumfolie.
8. Ontleden weefsel verder (indien nodig) en op dia's.

Discussion

Deze video laat zien hoe ontleden de CNS uit derde instar Drosophila larven. Na de dissectie, kan het centrale zenuwstelsel worden gekleurd met behulp van een standaard protocol immunohistochemie. Op dit moment, veel is nog onbekend hoe de volwassen zenuwstelsel is en opgewekt als hoe het slaat en stuurt de gegevens. Studies van de zich ontwikkelende Drosophila larven CNS moeten versterken onze kennis van het zenuwstelsel bedrading en functie.

Drosophila larven vertonen een aantal stereotpyed gedrag, zoals een reactie op omgevingsfactoren. Hoe worden deze gedragingen geleerd en opgeslagen in het zenuwstelsel? Studies van het zenuwstelsel tijdens de larvale ontwikkeling zal helpen om deze vraag te beantwoorden.

In dit stadium van Drosophila ontwikkeling, is het organisme bereidt zich voor de grote morfologische veranderingen die optreden tijdens de verpopping ondergaan. Gedurende deze tijd, enorme verbouwing van het neuromusculaire systeem zich voordoet als de organsim overgangen van een kruipende worm tot een volwassen vlieg. Het zal interessant zijn om te bepalen hoe neuronen veranderen tijdens deze fase van ontwikkeling en als het hetzelfde type gedrag kan worden waargenomen in de neuronen van hogere dieren.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	fine tipped
9-well Watch glass
Plastic Petri dish