Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

Summary

במאמר זה אנו מדגימים כיצד לנתח את מערכת העצבים המרכזית של הזחלים third תסיסנית instar.

Abstract

מערכת העצבים המרכזית (CNS) של זחלי תסיסנית הוא מורכב הבינו היטב. אחת הדרכים לחקור את מערכת העצבים המרכזית היא להשתמש אימונוהיסטוכימיה לבחון את הביטוי של רומן שונים וחלבונים הסמן. הכתמה של הזחלים כל מעשי משום לציפורן קשה מונע נוגדנים לחדור בתוך חלל הגוף. על מנת כתם אלה רקמות יש צורך לנתח את הבהמה לפני תיקון ו מכתים. במאמר זה אנו מדגימים כיצד לנתח הזחלים תסיסנית מבלי לפגוע במערכת העצבים המרכזית. בגין על ידי קורעת את הזחל במחצית עם זוג מלקחיים בסדר, ולאחר מכן להפעיל את הקוטיקולה "מבפנים החוצה" כדי לחשוף את מערכת העצבים המרכזית. אם הניתוח מבוצע בזהירות CNS תישאר מחוברת לציפורן. אנחנו בדרך כלל לשמור על מערכת העצבים המרכזית מחוברת לציפורן בכל הצעדים קיבעון ו מכתים, ורק להסיר לחלוטין את מערכת העצבים המרכזית של לציפורן ממש לפני הרכבה דגימות בשקופיות זכוכית. אנחנו גם להראות כמה תמונות של נציג CNS הזחל מוכתם וחוה, גורם שעתוק לידי ביטוי משנה של נוירונים במערכת העצבים המרכזית. המאמר מסתיים בדיון על כמה שימושים מעשיים של טכניקה זו ועל הקשיים הפוטנציאליים שעלולים להתעורר.

Protocol

1. מנתחים 3 ^rd הזחלים instar, עוזב CNS מחוברת לציפורן. מקום צינור 1.5 מ"ל.
2. תקן של PBS (1x) המכיל פורמאלדהיד 2% עבור 40 דקות עם נדנדה. ; השתמש 250ul לכל CNS גזור 5-10.
3. הסר פורמאלדהיד בקצרה לשטוף 3 פעמים עם PBS 0.1% + טריטון X-100 (PBST). השתמש משך דק פיפטה פסטר כדי למנוע אובדן של רקמות.
4. בלוק הלא ספציפית אתרי חלבון מחייב permeabilize קרום התא על ידי דוגרים 1-8 שעות רקמות PBST BSA + 5%, מתנדנד על 4 ° C.
5. מדגירים את הנוגדן העיקרי מדולל PBST + 5% BSA נדנדה ב 4 ° C למשך הלילה. דילול נוגדן אופטימלית ישתנו עבור נוגדנים שונים.
6. לשטוף 3x ב PBST ואחריו שני שוטף 30 דקות ב 4 ° C.
7. דגירה של נוגדנים משני מדולל PBST BSA + 5% עבור שעות 1-3 נדנדה ב 4 ° C. לשטוף 3x ב PBST ואחריו שני שוטף 30 דקות ב 4 ° C. אם משני הוא מצומדות למתחם רגיש לאור, לעטוף את צינור בנייר אלומיניום.
8. לנתח רקמות נוספות (במידת הצורך) ואת הר בשקופיות.

Discussion

וידאו זה מדגים כיצד לנתח את מערכת העצבים המרכזית של הזחלים third תסיסנית instar. לאחר דיסקציה, CNS יכול להיות מוכתם באמצעות פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה סטנדרטי. נכון לעכשיו, עדיין לא ידוע הרבה על איך מערכת העצבים הבוגרת מופק וכן כיצד הוא מאחסן ומעביר מידע. מחקרים של מערכת העצבים המרכזית תסיסנית בפיתוח הזחל צריך לשפר את הידע שלנו על חיווט למערכת העצבים לתפקד.

הזחלים תסיסנית התערוכה מספר התנהגויות stereotpyed, כגון בתגובה לאותות סביבתיים. כיצד התנהגויות אלה למדו מאוחסן במערכת העצבים? מחקרים של מערכת העצבים במהלך התפתחות הזחל יעזור לענות על שאלה זו.

בשלב זה תסיסנית פיתוח, האורגניזם הוא מתכונן לעבור שינויים מורפולוגיים המכריע המתרחשים במהלך התגלמות. במהלך תקופה זו, שיפוץ מסיבי של מערכת neuromuscular מתרחשת כאשר המעברים organsim מן תולעת זוחלת לתוך לטוס מבוגר. יהיה מעניין כדי לקבוע כיצד נוירונים לשנות בשלב זה של פיתוח, אם אותו סוג של התנהגות ניתן לראות את הנוירונים של בעלי חיים גבוהה יותר.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	fine tipped
9-well Watch glass
Plastic Petri dish