Drosophila Melanogaster에서 애벌레 CNS의 해부

Summary

이 문서에서 우리는 세번째 instar Drosophila의 유충에서 중추 신경계를 해부하다하는 방법을 보여줍니다.

Abstract

Drosophila의 애벌레의 중추 신경계 (CNS)는 복잡하고 제대로 이해합니다. CNS 조사 방법 중 하나는 각종 소설 및 마커 단백질의 표현을 검토하는 immunohistochemistry를 사용하는 것입니다. 어려운 표피가 뱃속 내부 관통 항체를 방지하기 때문에 전체 애벌레의 스테 이닝 것은 허무합니다. 이러한 조직을 얼룩하기​​ 위해서는 고정과 얼룩하기​​ 전에 동물을 해부하다하는 것이 필요합니다. 이 문서에서 우리는 CNS를 손상하지 않고 Drosophila의 유충을 해부하다하는 방법을 보여줍니다. 좋은 포셉 한 쌍의로 절반 유충을 찢어로 시작, 다음 CNS를 노출하기 위해 표피 "내부 아웃"을 설정합니다. 해부가 신중하게 수행하면 CNS는 표피에 부착된 상태로 유지됩니다. 우리는 보통 고정 및 얼룩 단계에 걸쳐 표피에 부착된 CNS를 유지하고, 오직 완전히 유리 슬라이드에 샘플을 장착하기 직전 표피에서 CNS를 제거합니다. 우리는 또한 이브, CNS의 뉴런의 집합으로 표현 전사 인자 물들일 애벌레 CNS의 일부 대표 이미지를 보여줍니다. 이 문서는이 기술과 발생할 수있는 잠재적인 문제의 실질적인 사용의 몇 가지 논의로 마칩니다.

Protocol

1. 표피에 부착된 CNS를 떠나, 3 ^차 instar의 유충을 해부하다. 1.5 ML 튜브에 놓습니다.
2. 락을 40 분 2 % 포름 알데히드를 포함하는 PBS (1X)에서 수정. ; 모든 50-10 해부 CNS에 대한 250ul를 사용하십시오.
3. 포름 알데히드를 제거하고 짧게 3 번 씻어 PBS + 0.1 % 트리톤 X - 100 (PBST). 조직의 손실을 피하기 위해 가늘게 뽑아 파스퇴르 피펫을 사용합니다.
4. 비 - 특정 단백질 바인딩 사이트를 차단하고 PBST에서 조직 1-8 시간을 잠복기하여 세포 세포막을 permeabilize + 4 락을 5 % BSA, ° C.를
5. 4 ° C 하룻밤에 PBST + 5% BSA 락을에 희석 일차 항체에 품어. 최적의 항체 희석 다른 항체에 따라 다를 수 있습니다.
6. 4 두 30 분 세척 ° C. 다음 PBST로 3 배 린스
7. PBST로 희석 이차 항체에 품어 + 4 락을 1-3 시간에 대한 5 % BSA ° C.를 4 두 30 분 세척 ° C. 다음 PBST로 3 배 린스 보조가 빛을 민감한 화합물을 복합하는 경우, 알루미늄 호일에 튜브를 바꿈.
8. 추가 조직을 해부하다 (필요한 경우) 및 슬라이드에 탑재합니다.

Discussion

이 비디오는 세번째 instar Drosophila의 유충에서 CNS를 해부하다하는 방법을 보여줍니다. 절개 후, CNS는 표준 immunohistochemistry 프로토콜을 사용하여 얼룩하실 수 있습니다. 현재, 한결 성인 신경계가 그 상점 얼마나뿐만 아니라 생성되는 방법에 대해 알 수 있으며, 정보를 전송합니다. 개발 Drosophila 애벌레의 CNS의 연구 신경계 배선과 기능에 대한 지식을 강화해야합니다.

Drosophila의 애벌레는 환경 신호에 대한 응답으로 stereotpyed 행동의 번호를 나타냅니다. 어떻게 이런 행동은 배운 그리고 신경 계통에 저장됩니다? 애벌레 개발 중에 신경 계통의 연구는이 질문에 대답하는 데 도움이 될 것입니다.

Drosophila 개발이 단계에서는 유기체가 pupation 중에 발생하는 방대한 형태학의 변화를 받아야하는 준비하고 있습니다. 이 시간 동안, 신경근육학 시스템의 대규모 개조가 크롤 링 구더기에서 성인 플라이로 organsim 변환으로 발생합니다. 그것은 행동의 동일한 유형이 높​​은 동물의 뉴런에서 관찰 할 수있다면 신경이 개발이 단계에서 변경 방법을 결정 재미있을 것입니다.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	fine tipped
9-well Watch glass
Plastic Petri dish