Summary
本视频介绍了使用激光镊子在体外培养的神经元的操纵。
Abstract
在这个文件和视频，我们描述了在我们的实验室中使用的协议，成人视网膜神经细胞在体外再生的细胞过程的研究目标的喜好。视网膜细胞培养的准备程序开始的解剖，消化和视网膜trituration，并结束孤立的视网膜细胞，制成的菜肴，尤其是使用激光镊子电镀。这些菜都分为一个的细胞粘附半和细胞防护剂一半。细胞的粘着面涂上一层SAL - 1抗体，我们的细胞生长提供了一个基板。其他胶粘剂基材，可用于其他类型的细胞。细胞防护剂侧涂有一层薄薄的聚HEMA。镀上的菜的聚甲基丙烯酸羟乙酯方的细胞被困激光镊子，运输，然后放在相邻SAL - 1侧到一个单元格，以创建一对。任何规模的细胞群的形成，应尽可能使用这种技术。 “激光镊子控制显微”的手段，调查人员可以选择移动的细胞和细胞之间的距离可以标准化。由于激光束通过透明培养皿的表面，细胞的选择和安置在一个封闭的，无菌的环境。细胞可以通过视频监控时间推移和使用所需的任何细胞生物学技术。这种技术可以帮助细胞间的相互作用的调查。
Protocol
光镊操纵分离的细胞在培养
光镊捕获势力产生的光的势头（Ashkin，1991年;。Ashkin等，1986） 。虽然这些势力很容易陷阱细胞悬浮液中，他们无法将坚持到表面的细胞。 因此，减少粘附在培养皿中的细胞被困点，聚- 2 - hydroxyethylmethacrylate（聚甲基丙烯酸羟乙酯）（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州），与细胞的驱蚊剂无毒复合涂层的盖玻片以前受聘为内皮细胞粘附性研究（福克曼和莫斯科纳，1978年）的属性。虽然聚甲基丙烯酸羟乙酯覆盖培养皿的一半，另一半则是涂层与基板，支持细胞的生长 。 在我们的实验室，SAL - 1是作为培养蝾螈视网膜细胞的基质 。 编造SAL - 1和聚甲基丙烯酸羟乙酯涂菜下面介绍的步骤 ：
培养皿的制作
- 在酸性清洁coverglasses（＃1 VWR科学公司，媒体，PA）。这玻璃罩被选定为它的厚度仅0.1毫米，高数值孔径聚焦激光所需的目标所必需的。
- 为了创建一个细胞防护剂面积，溶于95％乙醇1毫升的20毫克的聚甲基丙烯酸羟乙酯（Sigma公司，圣路易斯，密苏里州），在室温下过夜。最好是，这种解决方案应在1个月的准备。
- 在无尘的环境中，如遮光罩，在不久的垂直位置，撑起coverglasses。
- 将一个或两个从一个200μL微量的塑料尖的玻璃罩上方附近的聚甲基丙烯酸羟乙酯溶液滴。滴（约50100μL每个），应限制在盖玻片的一半。陡坡确保底部玻璃罩表面的液体流下来，聚甲基丙烯酸羟乙酯，甚至提供了一个薄涂层。允许的聚甲基丙烯酸羟乙酯涂coverglasses干为30-60分钟，在室温下的引擎盖。
- 靠近边缘用细尖笔，马克聚甲基丙烯酸羟乙酯方的玻璃罩。
- 在35毫米培养皿的底部钻一个1厘米的洞。
- 粘聚甲基丙烯酸羟乙酯涂层的玻璃罩，聚甲基丙烯酸羟乙酯涂边向里面的菜面临Sylgard 184（道康宁有限公司，美联，心肌梗死）的培养皿底部。确保边缘的聚甲基丙烯酸羟乙酯涂料运行孔的中心。允许在一个无尘的环境中中在室温下1-3天的菜干。
- 从头开始对外面的玻璃罩与钻石尖笔以下的聚甲基丙烯酸羟乙酯涂料的边缘线。然后，从头两个直角交叉线相距约2毫米。交集的两个点作为参考基准点或显微镜舞台上再现的培养皿中的同一方向。
- 根据紫外线消毒隔夜的菜。
- 要创建一个贴壁细胞在培养皿中的一半，非SAL - 1的聚甲基丙烯酸羟乙酯的半大衣，其中包含一个鼠抗蝾螈抗体对视网膜细胞膜（彼得麦克利什，莫尔豪斯医学院博士慷慨提供的提出美国佐治亚州亚特兰大;看到麦克利什等人（1983））。首先，大衣约100微升0.1毫克/毫升无菌的羊抗鼠IgG抗体（Boehringer Mannheim公司公司，印第安纳波利斯IN）SAL - 1侧，同时注意不要溅出液体到聚甲基丙烯酸羟乙酯方。离开了三个小时，然后将其删除。同一地区无菌林格氏液洗一次或两次，然后将100μLSAL - 1上清，注意不要溅入的液体聚甲基丙烯酸羟乙酯方的菜。第一抗体确保SAL - 1是在已知浓度的涂层。
- 与SAL - 1过夜孵育的菜肴。
- 删除SAL - 1抗体的解决方案，并用无菌林格氏液冲洗区域。引进2毫升培养基细胞电镀前菜。
麦克利什和汤斯 - 安德森（1988年）和曼德尔等人发现的两栖类林格氏液，两栖类无血清培养基，和林格酶消化解决方案的组成。 （1993年）。
细胞培养制备
在这个视频中使用的细胞来自光适应，成人，水产相虎蝾螈（Ambystoma tigrinum），测量长度在17-22厘米（查尔斯沙利文公司，田纳西州纳什维尔），保持在5 °对C 12 H：12小时明暗周期。协议机构的动物护理和使用委员会（IACUC）在新泽西医学和牙科大学从美国国立卫生研究院的指导方针，严格按照批准。视网膜细胞培养的准备程序Nachman Clewner和汤斯 - 安德森（1996）描述如下：
- 斩首和髓的动物。删除的眼睛和解剖的角膜和虹膜。视网膜分离略有眼罩内。视网膜下方放置一个弯钳，舀出的视网膜。如果镜头是在这个阶段，视网膜，它并不重要。
- 40分钟，在14 U / ml的木瓜蛋白酶（沃辛顿，永久业权，新泽西州）在蝾螈林格氏液精华的视网膜。
- 木瓜林格氏液在使用之前，应与95％O 2 / 5％CO 2气体30分钟冒泡，然后通过消毒用0.22微米的过滤器（Millipore公司，Carrigtwohill，爱尔兰）。
- 无菌娃娃鱼林格氏液三次冲洗的视网膜。
- 从林格氏液中取出镜片，然后轻轻地磨碎用3毫米的视网膜组织孔吸管产生细胞悬液。
激光光镊操纵分离出神经元
- 培养皿放在显微镜阶段，方向对准在舞台上的参考点的菜一个标记的菜。保存在计算机中的基准点的坐标。
- 板块细胞上都SAL - 1和聚甲基丙烯酸羟乙酯的半菜。
- 允许细胞定居约20分钟，这是足够长的菜壁细胞抗体基板的重视。
- SAL - 1附着的菜端上选择一个单元格。标记x和y座标台坐标位置接近细胞。这一点在我们的例子中，是从选定的单元格主树突约为10微米。保存在计算机中的坐标。
- 选择第二个神经元，聚甲基丙烯酸羟乙酯端上的菜，在我们的情况下，感光，并使用激光镊子工具陷阱。可以补漏取得了广泛的功率水平。然而，我们的激光功率设置在10％-20％，这是足够低，以避免与细胞中捕获的碎片，但足够的运输通过介质的细胞。
- 当陷阱细胞，较低的阶段，使细胞远高于培养皿的表面和任何连接的神经元以上。在计算机控制下的移动舞台，带来SAL - 1端的细胞以前保存的X和Y坐标。在8 -20μm的/ s的阶段运动，但最高速度应该是凭经验确定。在抵达目标点上的SAL - 1侧，提高阶段，把被困的细胞表面的菜。单元布局，可与几微米的精度。使细胞坚持SAL - 1基板。
- 在之前和之后对形成对两个单元格的数字化图像的获取提供了有益的记录。
- 保持在孵化器中的细胞对。蝾螈的细胞，在湿盒放置的菜在10 ° C。细胞可以监测视频时间的推移和使用所需的任何细胞生物学技术。
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Discussion
光有气势，当光线折射，因为它通过细胞传递，一种力量是需要改变方向的势头。反过来，由于动量守恒定律，在相反方向的力量，必须在反应上一个单元格。 Ashkin（1991）表明，显微镜物镜聚焦的激光束产生的力将走向一个细胞，社会关注的焦点。尽管激光束产生只有几piconewtons武力，这股力量足以渡过难关中的单元格。甚少被水吸收的近红外波长是用于细胞（刘等，1995），以避免损坏。在我们的实验室中使用的激光镊子工作站（细胞机器人公司，新墨西哥州阿尔布开克），使用1瓦，980纳米波长的连续波激光二极管。激光光通过一个40X油浸计划neofluor高数值孔径的物镜（NA1.3）（卡尔蔡司公司）集中在同一焦平面显微镜的光束传送到细胞。
激光镊子控制显微提出了对随机镀细胞研究的优势。例如，细胞可以放置在所需的距离，从另一个可用于所有操纵细胞的标准化。此外，激光束穿过透明培养皿的表面，因此，细胞操纵是在一个封闭的，无菌的环境中进行。由激光产生的力量很小的地方就可以捕获了一个极限。在我们的经验，粘附和细胞形状是最重要的因素，限制成功诱捕。在一般情况下，我们分离出的细胞直径10 -15μm的陷阱，和他们运到他们的目的地整个培养皿中的几个毫米的距离。移动比这更大的细胞，它是可能的，例如，穆勒胶质细胞，这是在长度为20 - 40微米，是在我们的文化中最大的细胞。
由于诱捕细胞是一个挑战，当细胞玻璃培养皿的底部，彼此的坚持，发展防护剂细胞表面上使用聚甲基丙烯酸羟乙酯的玻璃罩我们在操纵细胞的成功证明了非常宝贵的。即便如此，聚甲基丙烯酸羟乙酯表面上的细胞，最终成为粘性和难以操纵超过1-2个小时的文化。在老年文化，在我们的实验室常见的做法是试图拿起激光使用的最大功率设置的单元格，然后打开电源，运输。
小物件，可以缓解被困在激光意味着碎片可以拉入陷阱，从细胞外的距离。事实证明，这是一个问题，在我们的细胞诱捕。这可避免在大多数情况下，通过降低激光功率最低的可能，可容纳细胞内的陷阱。在陷阱中哪些细胞可运送速度是有限的介质的粘度。我们通常在8-20微米左右/秒，这被认为是对交通运输的安全范围内设置的速度。
激光陷阱举行的细胞产生不利影响的可能性，必须加以考虑。 ，在我们的视网膜文化中，我们遇到如在激光束捕获时被破坏的色素细胞的黑色物体。因此，显然，这些细胞不能利用激光镊子研究。然而，在就在我们的实验室进行的视网膜神经细胞和光感受器以往的研究中，我们没有发现神经炎增长和能力，形成镊子操控细胞和非操纵细胞之间的连接的差异（汤斯 - 安德森等人1998; Clarke等2008 ）。
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Acknowledgments
研究是由美国国立卫生研究院资助EY012031和EY0182175和FM柯比基金会的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR international | 48380 080 | |
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | |
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning | 7078A-5 | |
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning | 430165 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc. | ||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc. | ||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss, Inc. | Numerical aperture (N.A. 1.3) | |
| Black and white CCD camera | Sony Corporation | ||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
