Summary
このビデオでは、in vitroでレーザーピンセットを用いた培養神経細胞の操作を説明します。
Abstract
この論文とビデオでは、我々はin vitroでの成人網膜神経細胞の再生細胞プロセスのターゲット設定を研究する我々の研究室で使用されるプロトコルについて説明します。網膜細胞培養を調製するための手順は、解剖、網膜の消化と粉砕し、特にレーザーピンセットで使用するために作った料理で分離された網膜細胞のメッキと終わりで始まり。これらの料理は、細胞の接着剤の半分と細胞の撥半分に分かれています。細胞の接着面は、私たちの細胞が増殖する際に基板を提供するサル- 1抗体、の層でコーティングされています。他の接着剤基材は、他の細胞型を使用することができる。細胞の撥側は、ポリ- HEMAの薄層で被覆されている。皿のポリ- HEMA側に播種した細胞は、レーザーピンセットでトラップ運ばれ、ペアを作成するにはSAL - 1側のセルに隣接して配置されています。任意のサイズの細胞群の形成は、この手法で可能なはずです。 "レーザーピンセット制御マイクロマニピュレーションは、"研究者は細胞が移動するかを選択できることを意味し、そして細胞間の所望の距離は、標準化することができる。レーザービームは、培養皿の透明な表面を通過するので、セルの選択と配置は、同封の、無菌環境で行われます。細胞は、ビデオタイムラプスによって監視し、必要な細胞生物学的なテクニックを使用することができます。この手法は、細胞間相互作用の調査を助けるかもしれない。
Protocol
文化の中で分離した細胞を操作するための光ピンセット
光ピンセットの捕捉力は光の運動量（; Ashkinら、1986。Ashkin、1991）から生成されます。これらの力は容易に懸濁液中の細胞をトラップが、それらは表面に付着する細胞を移動することはできません。したがって、細胞がトラップされている時点で培養皿への付着を減らすために、カバースリップは、撥のセルを持つポリ-2 -ヒドロキシエチルメタクリレート（ポリ- HEMA）（シグマケミカル社、セントルイス、MO）、毒性のない化合物で被覆されているプロパティは、以前に内皮細胞上の接着試験（フォークマンとモスコーナ、1978）に採用。ポリ- HEMAが培養皿の半分をカバーしながら、残りの半分は、細胞の成長をサポートしている基質でコーティングされています。当研究室では、サル- 1は培養サンショウウオ網膜細胞の基質として使用されます。サル- 1とポリ- HEMAコートディッシュを製造するための手順を以下に示します。
培養皿の作製
- 酸のクリーンcoverglasses（＃1 VWRサイエンティフィック社、メディア、PA）。このカバーガラスは、レーザーを集束させるために必要な高開口数の目的のために必要なだけ0.1mmのその厚さ、のために選ばれました。
- 細胞の撥領域を作成するには、室温で一晩95％エタノール1mlの20 mgのポリ- HEMA（シグマケミカル社、セントルイス、MO）を溶解する。好ましくは、このソリューションは、準備の1ヶ月以内に使用する必要があります。
- このようなボンネットのようなほこりのない環境で近くに垂直位置にcoverglassesを支える。
- 200μlのマイクロピペットのプラスチック製の先端からカバーガラスの上部付近にポリ- HEMAの解決方法の1つまたは2滴を置きます。ドロップは（各50 -100μlの約）カバーガラスの半分に制限する必要があります。急な傾斜は、ポリ- HEMAの薄いにもコーティングを提供し、底にカバーガラスの表面下に液体の流れを保証します。ポリ- HEMAコートしたcoverglassesは、室温で30-60分間フード内で乾燥することができます。
- エッジに近い微細な先端のペンでカバーガラスのポリHEMA側をマーク。
- 35mmの培養皿の底に1cmの穴を開けます。
- ポリ- HEMAコーティング面が皿の内側に向かって手前になるように、Sylgard 184（ダウコーニング社、ミッドランド、MI）と培養皿の底に接着剤ポリ- HEMAコートしたカバーガラスを。ポリ- HEMAコーティングの端が穴の中央を下に実行されることを確認します。料理は、ほこりのない環境で、室温で1〜3日間乾燥することができます。
- ポリ- HEMAコーティングのエッジに続くダイヤモンドペンでカバーガラスの外側の線に傷を付けない。その後、離れてそれを約2mmに直角に二つの交差する線に傷を付けない。交差点の二点は、参照または顕微鏡のステージ上で培養皿の同じ方向を再現するために使用する基準点として機能します。
- 一晩紫外光の下で料理を滅菌する。
- 網膜細胞膜（気前よくピーターMacLeish、医学のモアハウススクールが提供するに対して発生させたマウス抗サンショウウオの抗体を含む培養皿の細胞付着性半分、コートサル- 1と非ポリHEMA半分を、作成するには、アトランタ、ジョージア州、。）MacLeishら（1983）を参照してください。ポリ- HEMA側上で液体をこぼさないように注意しながら、約100μlの0.1 mg / mlの滅菌ヤギ抗マウスIgG抗体（ベーリンガーマンハイム社、インディアナポリス、インディアナ州）の、と最初に、コートサル- 1側を。三時間のために残し、それを取り外します。一度か二度、次に皿のポリ- HEMA側に液体をこぼさないように注意しながら、100μlのサル- 1上清を置く滅菌リンゲル液と同じ部分を洗う。第一抗体はサル- 1は、既知の濃度で塗布されることが保証されます。
- サル- 1晩で皿をインキュベートする。
- サル- 1抗体溶液を除去し、滅菌リンゲル液で領域を洗う。細胞播種直前に皿に2mlの培地をご紹介。
両生類リンゲル溶液、無血清培地両生類、および酵素消化のためのリンゲル液の組成はMacLeishとタウンズ - アンダーソン（1988）とマンデルらに記載されています。 （1993）。
細胞培養の準備
このビデオで使用されている細胞が由来した明順応、成人、水生相虎サンショウウオは（Ambystoma tigrinum）、長さが17〜22センチメートルを測定する（チャールズサリバン社、ナッシュビル、テネシー州）、5℃に維持Cを上12時間：12時間明暗サイクル。プロトコルは、動物実験によって承認され、国立衛生研究所からのガイドラインに厳密に従い、ニュージャージー医科歯科大学の委員会（IACUC）を使用していた。網膜細胞培養を調製するための手順は、Nachman - Clewnerとタウンズ - アンダーソン（1996）によって記述され、次のとおりですされています。
- 首を切ると髄動物。目を削除し、角膜と虹彩をばらばらにする。網膜は、アイカップの中でわずかにデタッチしてください。網膜の下に湾曲した鉗子を置くことによって、網膜をかき出す。レンズはこの段階で網膜に接続されている場合、それは重要ではありません。
- 40分のためのサンショウウオリンゲル溶液に14 U / mlのパパイン（ワーシントン、フリーホールド、ニュージャージー州）で網膜を消化。
- 使用前に、パパインリンゲル溶液を30分間95％O 2 / 5％CO 2ガスをバブリングしてください。、その後0.22ミクロンフィルター（ミリポア、Carrigtwohill、アイルランド）を通過させることによって滅菌。
- 無菌サンショウウオリンゲル液で3回網膜をすすぎます。
- リンゲル溶液からレンズをはずして、その後静かに細胞懸濁液を得るためにピペットを退屈さ3ミリメートルと網膜組織をひいて粉にする。
分離されたニューロンのレーザーピンセット操作
- ステージ上の基準点と皿にマークを合わせて料理を向ける、顕微鏡のステージ上に培養皿を置きます。コンピュータの基準点の座標を保存します。
- 料理のサル- 1とポリ- HEMA半分の両方の上に細胞をプレート。
- 細胞がディッシュの接着側の細胞が抗体を基板に接続するための十分な長さは約20分、のために解決することができます。
- 料理のサル- 1接着側のセルを選択します。 xとyのステージは、細胞に近い位置の座標をマーク。私たちのケースでは、ポイントは選択されたセルの一次樹状突起から約10μmのだ。コンピュータの座標を保存します。
- 皿のポリ- HEMA側の私たちの例では、第2ニューロン、感光体を、選択して、それをトラップするために、レーザーピンセットのツールを使用してください。トラッピングは、パワーレベルの広い範囲で達成することができます。しかし、我々はセルと一緒にトラッピング破片を防ぐのに十分な低さが、メディアを介して細胞を輸送するのに十分である、10％-20％で、レーザーのパワーを設定します。
- トラップ内のセルを保持しながら、細胞がウェル培養皿の表面上および接続されているすべてのニューロン上になるように段階を下げる。サル- 1側で以前に保存されたx座標およびy座標にセルを持って来るために、コンピュータの制御下にステージを移動します。ステージ移動は、8 -20μmの/ sの速度で設定されていましたが、最高速度は、経験的に決定されるべきである。サル- 1側の宛先ポイントに到着、皿の表面にトラップされた細胞を持ってステージを上げる。セルの配置は、数ミクロンの精度で行うことができます。細胞は、サル- 1基質に付着することができます。
- ペア形成の前と後のペアの両方の細胞のデジタル画像を得ることが有用な記録を提供します。
- インキュベーターで細胞のペアを維持する。サンショウウオの細胞の場合は、10時、加湿チャンバーに料理を置く℃に細胞は、ビデオの時間の経過によって監視し、必要な細胞生物学的なテクニックを使用することができます。
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Discussion
光は勢いがあり、それがセルを通過する光線が屈折されるとき、力が運動量の方向を変更する必要があります。のため運動量保存の法則から、反対方向の力は、順番に、セルに戻って反応する必要があります。 Ashkin（1991）顕微鏡対物レンズで集光レーザービームによって発生する力がフォーカスの中心に向かってセルを移動することを示した。レーザービームは、力のほんの数ピコニュートンを生成するにもかかわらず、この力は、媒体を介して細胞を引くのに十分です。難水溶によって吸収される近赤外波長は、細胞（Liuら1995）への損傷を回避するために使用されます。我々の研究室で使用されているレーザーピンセットのワークステーションは、（セルロボティクス株式会社、アルバカーキ）1 W、980nm波長の連続波のダイオードレーザーを使用しています。レーザー光は顕微鏡と同じ焦点面に光を当て、高開口数の40倍の油浸計画neofluorの対物レンズ（NA1.3）（カールツァイス社）を介して細胞に伝達される。
レーザーピンセット制御マイクロマニピュレーションは、ランダムに播種した細胞の研究に比べて多くの利点を示す。例えば、細胞は、すべて操作された細胞のために標準化することができますお互いから所望の距離に配置することができます。さらに、レーザービームは、培養皿の透明な表面を通過し、従って、細胞操作は、密閉、無菌環境で行われます。レーザーによって生成される非常に小さな力がトラップすることができるかを制限します。我々の経験では、接着と細胞の形状は、成功したトラップを制限する最も重要な要素です。一般的に、我々は直径10 -15μmのの単離細胞をトラップし、彼らの目的地までの培養皿で数mmの距離を輸送。これらのより大きなセルを移動することが可能である、例えば、長さ20 -40μmのものと私たちの文化の最大の細胞であるミュラーグリア細胞、。
トラッピング細胞はポリ- HEMAを使用してカバーガラス上で細胞撥面を開発し、細胞が培養皿のガラスの底に、お互いへの付着の挑戦ですので、操作する細胞における当社の成功にとって非常に貴重証明した。そうであっても、ポリ- HEMA表面上の細胞は最終的には以上の1-2時間の古い文化の中で操作する粘着性と困難になった。古い文化では、私たちの研究室における一般的な方法は、それを輸送するために電力を下げて、最大電力設定を使用してレーザーで細胞をピックアップしようとすることでした。
小さなオブジェクトはレーザーの中に閉じ込めすることができる容易さは、破片がよく、細胞外の距離からのトラップが引っ張り込むことを意味します。これは我々の細胞の捕捉時の問題であることが判明した。これは、トラップ内のセルを保持できる可能性が最小限にレーザーのパワーを下げることにより、ほとんどの場合で回避することができます。細胞がトラップで転送できる速度は、培地の粘度によって制限されます。我々は通常、輸送に安全な範囲内であることが判明した約80〜20ミクロン/秒の速度を設定します。
レーザートラップで開催された細胞に有害な影響を持っている可能性を考慮する必要があります。私たちの網膜の文化では、我々はレーザービームでキャプチャするときに破壊される色素細胞などの暗いオブジェクトに遭遇する。明らかに、それゆえ、これらの細胞は、レーザーピンセットを用いて研究することはできません。クラークら2008;しかし、網膜神経細胞と光受容体に関する以前の研究で我々の研究室で行われた、我々は、ピンセット、操作された細胞と非操作された細胞（タウンズ- Andersonら1998年の間の接続を形成する神経突起の成長と能力に差は認められなかった）。
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Acknowledgments
研究は、NIHの助成金EY012031とEY0182175とFMカービー財団によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR international | 48380 080 | |
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | |
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning | 7078A-5 | |
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning | 430165 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc. | ||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc. | ||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss, Inc. | Numerical aperture (N.A. 1.3) | |
| Black and white CCD camera | Sony Corporation | ||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
