Summary
Deze video beschrijft de manipulatie van gekweekte neuronen met behulp van laser-pincet in vitro.
Abstract
In dit artikel en video, beschrijven we de protocollen die worden gebruikt in ons laboratorium aan de doelgerichtheid voorkeuren van regenereren van celprocessen van volwassen netvlies neuronen in vitro studie. Procedures voor het bereiden van het netvlies celculturen beginnen met de dissectie, de spijsvertering en fijnwrijven van het netvlies, en eindigen met de beplating van geïsoleerde cellen op het netvlies gerechten speciaal voor gebruik met laser-pincet. Deze gerechten zijn onderverdeeld in een cel lijm half en een cel afweermiddel half. De cel klevende kant is bedekt met een laag van Sal-1-antilichamen, die een substraat waarop onze cellen groeien. Andere lijm substraten gebruikt kunnen worden voor andere celtypes. De cel afweermiddel zijde is bedekt met een dunne laag van poly-HEMA. De cellen geplateerd op de poly-HEMA kant van de schaal worden gevangen met de laser pincet, vervoerd en vervolgens naast geplaatst om een cel op het Sal-1 kant om een paar te creëren. Vorming van celgroepen van elke omvang mogelijk moet zijn met deze techniek. "Laser-pincetten gecontroleerde micromanipulatie" betekent dat de onderzoeker kan kiezen welke cellen om te bewegen, en de gewenste afstand tussen de cellen kunnen worden gestandaardiseerd. Omdat de laserstraal gaat door transparante vlakken van de cultuur schotel, zijn cel selectie en plaatsing gebeurt in een gesloten, steriele omgeving. Cellen kunnen worden gecontroleerd door video time-lapse en gebruikt worden met elke cel vereiste biologische techniek. Deze techniek kan helpen onderzoeken van cel-cel interacties.
Protocol
Optische pincetten voor het manipuleren van geïsoleerde cellen in cultuur
Trapping krachten van een optisch pincet, zijn van de dynamiek van licht (Ashkin, 1991;. Ashkin et al., 1986). Hoewel deze krachten makkelijk vangen cellen in suspensie, zijn ze niet in staat om cellen die hechten aan een oppervlak bewegen. Daarom, om de hechting aan de cultuur schotel op het punt waar de cellen zijn opgesloten te verminderen, is het dekglaasje bedekt met poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) (Sigma Chemical Co, St Louis, MO), een niet-toxisch verbinding met cell afstotend eigenschappen die eerder ingezet voor hechting studies op endotheelcellen (Folkman en Moscona, 1978). Terwijl de poly-HEMA beslaat de helft van de cultuur schotel, is de andere helft bedekt met een substraat dat de celgroei ondersteunt. In ons laboratorium, is Sal-1 gebruikt als substraat voor het kweken van salamander retinale cellen. De procedure voor het vervaardigen van Sal-1 en poly-HEMA gecoate gerechten wordt hieronder beschreven:
Fabricage van de cultuur gerechten
- Schoon coverglasses (# 1 VWR Scientific Inc, Media, PA) in zuur. Dit dekglaasje werd geselecteerd voor zijn dikte van slechts 0,1 mm, noodzakelijk voor de hoge numerieke apertuur doelstellingen die nodig zijn voor het richten van de laser.
- Voor het maken van een cel afstotend, op 20 mg poly-HEMA (Sigma Chemical Co, St Louis, MO) 's nachts op te lossen in 1 ml van 95% ethanol bij kamertemperatuur. Bij voorkeur moet deze oplossing worden gebruikt binnen een maand van voorbereiding.
- Prop de coverglasses op een bijna verticale positie in een stofvrije omgeving, zoals een kap.
- Plaats een of twee druppels van poly-HEMA oplossing buurt van de top van het dekglaasje van het plastic uiteinde van een 200μl micropipet. De druppels (ongeveer 50-100μl elk) moet worden beperkt tot de helft van de dekglaasje. De steile helling zorgt ervoor dat de vloeistof naar beneden stroomt het oppervlak van het dekglaasje naar de bodem, waardoor een dunne gelijkmatige laag van poly-HEMA. Laat de poly-HEMA gecoat coverglasses te drogen in de kap voor 30-60 minuten bij kamertemperatuur.
- Markeer de poly-HEMA kant van het dekglaasje met een fijne tip pen dicht bij de rand.
- Boor een 1 cm gat in de bodem van een 35 mm cultuur schotel.
- Lijm de poly-HEMA gecoat dekglaasje aan de onderkant van de cultuur schotel met Sylgard 184 (Dow Corning Co, Midland, MI), zodat de poly-HEMA gecoate zijde gezicht naar de binnenkant van de schotel. Zorg ervoor dat de rand van de poly-HEMA coating loopt in het midden van het gat. Laat de vaat drogen voor 1-3 dagen bij kamertemperatuur in een stofvrije omgeving.
- Kras een lijn op de buitenkant van het dekglaasje met een diamant-tip pen naar aanleiding van de rand van de poly-HEMA coating. Dan, scratch twee kruisende lijnen haaks op het ongeveer 2 mm van elkaar. De twee snijpunten dienen als referentie of referentiepunten om te worden gebruikt voor het reproduceren van dezelfde oriëntatie van de cultuur schotel op de microscoop podium.
- Steriliseer de gerechten onder ultraviolet licht 's nachts.
- Om een cel-aanhanger de helft van de cultuur schotel, vacht van de niet poly-HEMA half met Sal-1, die een muis anti-salamander antilichaam opgewekt tegen het netvlies celmembranen (genereus verzorgd door dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine bevat te creëren , Atlanta, GA, zie MacLeish et al. (1983)).. De eerste, jas de Sal-1 zijde met ongeveer 100μl van 0,1 mg / ml steriel geit anti-muis IgG antilichaam (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis IN), zorg ervoor dat u de vloeistof spill-over op de poly-HEMA kant. Laat drie uur, vervolgens verwijderen. Was het hetzelfde gebied met de oplossing steriele Ringer's een of twee keer, plaats dan 100μl Sal-1 supernatant, zorg ervoor dat u de vloeistof morst in de poly-HEMA kant van de schotel. Het eerste antilichaam zorgt voor Sal-1 is gecoat bij een bekende concentratie.
- Incubeer de schotels met de Sal-1 's nachts.
- Verwijder de Sal-1 antilichaam-oplossing en spoel het gebied met steriele Ringer's oplossing. Introduceer 2 ml medium om de schotel vlak voor cel plating.
De samenstelling van de oplossing van de amfibie Ringer's, serum-vrij medium amfibie, en Ringer-oplossing voor enzymdigestie zijn te vinden in MacLeish en Townes-Anderson (1988) en Mandell et al.. (1993).
Voorbereiding van de celculturen
De cellen die worden gebruikt in deze video waren afkomstig van licht aangepast, voor volwassenen, in het water levende tijger-fase salamanders (Ambystoma tigrinum), het meten van 17-22 cm in de lengte (Charles Sullivan Inc, Nashville, TN), gehandhaafd op 5 ° C op een 12 h: 12 uur licht-donker cyclus. De protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Geneeskunde en Tandheelkunde in New Jersey in strikte overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health. De procedures voor het bereiden van het netvlies celculturen worden beschreven door Nachman-Clewner en Townes-Anderson (1996) en zijn als volgt:
- Onthoofden en merg van de dieren. Verwijder de ogen en ontleden de hoornvliezen en de iris. Het netvlies moet een beetje los te maken binnen de oogschelp. Door het plaatsen van een gebogen pincet onder het netvlies, schep het netvlies. Het is niet belangrijk als de lens is bevestigd aan het netvlies in dit stadium.
- Digest het netvlies in 14 U / ml papaïne (Worthington, Freehold, NJ) in oplossing salamander Ringer's voor 40 minuten.
- Voorafgaand aan gebruik moet de papaïne Ringer-oplossing borrelen met 95% O 2 / 5% CO 2-gas voor 30 minuten., Vervolgens gesteriliseerd door passage door een 0,22 micron filter (Millipore, Carrigtwohill, Ierland).
- Spoel de retina met oplossing steriele salamander Ringer's drie keer.
- Verwijder de lenzen uit de oplossing van de Ringer's, dan voorzichtig vermaal het retinaal weefsel met een 3 mm boring pipet aan op een celsuspensie opbrengst.
Laser pincet manipulatie van geïsoleerde neuronen
- Plaats de cultuur schotel op de microscoop podium, oriënteren de schotel door het af een merkteken op de schotel met een referentiepunt op het podium. Sla de coördinaten van de vaste punten in de computer.
- Plaat-cellen op beide Sal-1 en poly-HEMA helften van de schotel.
- Laat de cellen om zich te vestigen voor ongeveer 20 minuten, dat is lang genoeg voor cellen aan de klevende zijde van de schotel te hechten aan het antilichaam substraat.
- Selecteer een cel op het Sal-een klevende zijde van de schotel. Markeer de x-en y-coördinaten van het podium een positie dicht bij de cel. In ons geval, het punt was ongeveer 10μm van de primaire dendrieten van de geselecteerde cel. Save coördinaten in de computer.
- Selecteer een tweede neuron, in ons geval een fotoreceptor, op de poly-HEMA kant van de schotel en het gebruik van de laser pincet gereedschap om het te vangen. Trapping kan worden bereikt over een breed scala aan vermogen. Maar we stellen de kracht van de laser op 10% -20%, wat laag genoeg is om trapping vuil te voorkomen, samen met de cel, maar voldoende om de cel transport door het medium.
- Terwijl u de cel in de val, hoe lager de fase, zodat de cel is ruim boven het oppervlak van de cultuur schotel en boven alle aangesloten neuronen. Verplaats de stage onder computer controle om de cel te brengen naar de eerder opgeslagen x-en y-coördinaten op de Sal-1 kant. Het podium beweging werd vastgesteld op 8-20μm / s, maar een maximale snelheid moet empirisch worden bepaald. Bij aankomst op de plaats van bestemming punt op de Sal-1 zijde, verhogen het podium om de gevangen cel te brengen aan het oppervlak van de schotel. Cel plaatsing kan worden gemaakt met een nauwkeurigheid van enkele microns. Laat de cel te houden aan de Sal-een substraat.
- Het verkrijgen van gedigitaliseerde beelden van beide cellen in het paar voor en na paar vorming biedt een handig overzicht.
- Handhaaf de cel paren in een couveuse. Voor de salamander cellen, plaats de gerechten in een vochtige kamer bij 10 ° C. Cellen kunnen worden gevolgd door video-time lapse en gebruikt worden met elke cel vereiste biologische techniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Licht heeft momentum, en wanneer een lichtstraal wordt gebroken als het door een cel, een kracht nodig om de richting van het momentum te veranderen. Omwille van de wet van behoud van impuls, moet er een kracht in tegengestelde richting op zijn beurt weer reageren op een cel. Ashkin (1991) toonde aan dat de kracht die door een laserstraal gericht door een microscoop objectief zal een cel te verplaatsen naar het midden van de focus. Hoewel een laserstraal genereert slechts een paar picoNewtons van kracht, deze kracht is voldoende om een cel te trekken door middel van medium. Een bijna-infrarode golflengte, dat slecht wordt geabsorbeerd door water wordt gebruikt om schade aan de cel (Liu et al. 1995) te vermijden. De laser-pincet werkstation gebruikt worden in ons laboratorium (Cell Robotics Inc, Albuquerque NM) maakt gebruik van een 1 W, continuous wave diode laser van 980nm golflengte. Het laserlicht wordt overgebracht naar de cellen via een 40x olie-immersie van plan neofluor objectief van hoge numerieke apertuur (NA1.3) (Carl Zeiss Inc), die de bundel richt zich op dezelfde focal plane als de microscoop.
Laser-pincet-gecontroleerde micromanipulatie presenteert een aantal voordelen ten opzichte van studies op willekeurig vergulde cellen. Bijvoorbeeld, kunnen cellen worden geplaatst op een gewenste afstand van elkaar die kunnen worden gestandaardiseerd voor alle gemanipuleerde cellen. Daarnaast is de laserstraal gaat door het transparante oppervlak van de cultuur schotel en daarom celmanipulatie wordt gedaan in een gesloten, steriele omgeving. De zeer kleine krachten die ontstaan door de laser plaatst een limiet op wat kan worden gevangen. In onze ervaring, adhesie en cel vorm zijn de belangrijkste factoren die een succesvolle trapping. In het algemeen hebben we val geïsoleerde cellen van 10-15μm in diameter en het vervoer hen een afstand van enkele millimeters over de cultuur van schotel naar hun bestemming. Het is mogelijk om te bewegen grotere cellen dan deze, bijvoorbeeld, Muller gliacellen, die zijn 20-40μm in lengte en zijn de grootste cellen in onze cultuur.
Omdat trapping cellen is een uitdaging wanneer de cellen zich te houden aan de glazen bodem van de schotel en cultuur met elkaar, het ontwikkelen van een cel-afstotend oppervlak op het dekglaasje met behulp van poly-HEMA bleek van onschatbare waarde voor ons succes in het manipuleren van cellen. Toch, de cellen op de poly-HEMA oppervlak werd uiteindelijk kleveriger en moeilijk te manipuleren in culturen meer dan 1-2 uur oud is. In oudere culturen, de gangbare praktijk in ons lab was om te proberen te pikken van de cellen met de laser met behulp van het maximale vermogen instelling, zet dan de stroom naar beneden om het te vervoeren.
Het gemak waarmee kleine objecten kunnen worden gevangen in de laser houdt in dat vuil kan worden getrokken in de val van de afstanden en buiten de cel. Dit bleek een probleem tijdens het vangen van onze cellen. Dit kan worden vermeden in de meeste gevallen door het draaien van de kracht van de laser tot het minimum mogelijk dat de cel kan houden in de val. De snelheid waarmee cellen kunnen worden vervoerd in de val wordt beperkt door de viscositeit van het medium. We normaal gesproken de snelheid van ongeveer 80 tot 20 micrometer / seconde, die bleek te zijn in een veilig bereik voor transport.
De mogelijkheid dat de laser nadelige effecten op de cellen die in de val heeft, moet worden overwogen. In ons netvlies culturen, stuiten we op donkere objecten zoals pigment cellen die worden vernietigd wanneer gevangen in de laserstraal. Het is duidelijk, daarom kunnen deze cellen niet worden bestudeerd met behulp van laser pincet. Echter, in eerdere studies op het netvlies neuronen en fotoreceptoren die in ons laboratorium zijn uitgevoerd, vonden we geen verschil in neuritische groei en het vermogen om verbindingen tussen pincet-gemanipuleerde cellen en niet-gemanipuleerde cellen vormen (Townes-Anderson et al., 1998; Clarke et al. 2008 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Onderzoek werd gesteund door NIH Grants EY012031 en EY0182175 en de FM Kirby Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR international | 48380 080 | |
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | |
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning | 7078A-5 | |
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning | 430165 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc. | ||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc. | ||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss, Inc. | Numerical aperture (N.A. 1.3) | |
| Black and white CCD camera | Sony Corporation | ||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
