Mit Laser-Pinzette zur Manipulation isolierter Neuronen In Vitro

Summary

Dieses Video beschreibt die Manipulation von kultivierten Neuronen mittels Laser-Pinzette in vitro.

Abstract

In diesem Papier und Video beschreiben wir die Protokolle in unserem Labor verwendet werden, um die Ausrichtung Präferenzen der regenerierenden Zellen Prozesse der erwachsenen Netzhautneuronen in-vitro-Studie. Verfahren zur Vorbereitung der retinalen Zellkulturen beginnen mit der Präparation, die Verdauung und Zerreiben der Netzhaut, und enden mit der Beschichtung von isolierten Zellen der Netzhaut auf Gerichte speziell für den Einsatz mit Laser-Pinzette gemacht. Diese Gerichte sind in eine Zelle Klebstoff Hälfte und eine Zelle repellant zwei Hälften geteilt. Die Zelle Klebeseite ist mit einer Schicht von Sal-1-Antikörper, die ein Substrat, auf denen unsere Zellen wachsen bieten beschichtet. Andere Klebstoff Substrate könnte auch für andere Zelltypen verwendet werden. Die Zelle repellant Seite ist mit einer dünnen Schicht aus Poly-HEMA beschichtet. Die Zellen auf der Poly-HEMA Seite der Schale überzogen sind mit dem Laser Pinzette gefangen, transportiert und dann neben der Sal-1-Seite in eine Zelle gelegt, um ein Paar zu schaffen. Formation von Zell-Gruppen jeder Größe sollte mit dieser Technik möglich. "Laser-Pinzette-gesteuerte Mikromanipulation" bedeutet, dass der Prüfer können wählen, welche Zellen sich zu bewegen, und den gewünschten Abstand zwischen den Zellen können standardisiert werden. Da der Laserstrahl geht durch transparente Oberflächen der Kulturschale, sind Zelle Auswahl und Platzierung in einem geschlossenen, sterilen Umgebung gemacht. Die Zellen können per Video im Zeitraffer überwacht werden und mit jedem zellbiologischen Technik erforderlich. Diese Technik kann helfen, Untersuchungen von Zell-Zell-Interaktionen.

Protocol

Optische Pinzetten zur Manipulation von isolierten Zellen in Kultur

Trapping Kräfte der optischen Pinzette aus der Dynamik des Lichts (.; Ashkin et al, 1986 Ashkin, 1991) generiert. Obwohl diese Kräfte leicht Trap Zellen in Suspension, sind sie nicht in der Lage, Zellen, die an einer Oberfläche haften zu bewegen. Daher die Haftung auf der Kulturschale zu dem Punkt, wo Zellen eingeschlossen zu reduzieren, wird das Deckgläschen mit Poly-2-Hydroxyethylmethacrylat (Poly-HEMA) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), eine ungiftige Verbindung mit Zell-abweisend beschichtet Eigenschaften bisher für die Haftung Studien auf Endothelzellen (Folkman und Moscona, 1978) beschäftigt. Während Poly-HEMA deckt die Hälfte der Kulturschale, die andere Hälfte mit einem Substrat, das Zellwachstum unterstützt beschichtet. In unserem Labor ist Sal-1 als Substrat für die Kultivierung Salamander Netzhautzellen verwendet. Das Verfahren zur Herstellung von Sal-1 und Poly-HEMA beschichtet Gerichte wird nachfolgend beschrieben:

Herstellung von Kulturschalen

1. Saubere Deckgläsern (# 1 VWR Scientific Inc., Media, PA) in Säure. Das Deckglas wurde für seine Dicke von nur 0,1 mm, die für die hohe numerische Apertur Ziele für die Fokussierung des Lasers erforderlichen ausgewählt.
2. So erstellen Sie eine Zelle repellant Gebiet, lösen 20 mg Poly-HEMA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 1 ml 95% igem Ethanol über Nacht bei Raumtemperatur. Vorzugsweise sollte diese Lösung innerhalb von 1 Monat Zubereitung verwendet werden.
3. Prop den Deckgläsern in einer fast senkrechten Position in einer staubfreien Umgebung wie eine Kapuze.
4. Legen Sie ein oder zwei Tropfen von Poly-HEMA-Lösung in der Nähe der Spitze des Deckglas aus dem Kunststoff Spitze eines 200 ul Mikropipette. Die Tropfen (ca. 50-100 &mgr; jedem) sollte auf eine Hälfte des Deckglas eingeschränkt werden. Die steilen Hang sorgt die Flüssigkeit auf der Oberfläche des Deckglas auf den Boden, eine dünne gleichmäßige Beschichtung von Poly-HEMA. Lassen Sie die Poly-HEMA beschichtet Deckgläsern in der Motorhaube für 30-60 Minuten bei Raumtemperatur trocknen.
5. Markieren Sie die Poly-HEMA Seite der Deckglas mit einem feinen Filzstift an die Kante.
6. Drill ein 1 cm großes Loch in den Boden einer 35 mm Kulturschale.
7. Kleben Sie die Poly-HEMA beschichtet Deckglas auf den Boden der Kulturschale mit Sylgard 184 (Dow Corning Co., Midland, MI), so dass die Poly-HEMA beschichteten Seite in Richtung der Innenseite der Schale Gesichter. Sicherstellen, dass die Kante des Poly-HEMA-Beschichtung läuft in der Mitte des Loches. Lassen Sie das Geschirr für 1-3 Tage bei Raumtemperatur in einer staubfreien Umgebung trocken.
8. Scratch eine Linie auf der Außenseite des Deckglas mit einer Diamant-Spitze Pen nach der Kante des Poly-HEMA-Beschichtung. Dann kratzen zwei sich kreuzenden Linien im rechten Winkel zu etwa 2mm auseinander. Die beiden Schnittpunkte dienen als Referenz-oder Bezugspunkte für die Wiedergabe der gleichen Ausrichtung der Kulturschale auf dem Mikroskoptisch verwendet werden.
9. Sterilisieren Sie die Speisen unter UV-Licht über Nacht.
10. Um eine Zelle haftenden Hälfte der Kulturschale, Mantel der nicht poly-HEMA Hälfte mit Sal-1, das eine Maus anti-Salamander Antikörper gegen retinale Zellmembranen (freundlicherweise von Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine vorgesehen angehoben enthält erstellen , Atlanta, GA, siehe MacLeish et al (1983)).. Zunächst beschichten Sal-1-Seite mit ca. 100 &mgr; von 0,1 mg / ml sterile Ziege anti-Maus IgG-Antikörper (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis IN), kümmert sich nicht um die Flüssigkeit über auf das Poly-HEMA Seite zu verschütten. Verlassen Sie für drei Stunden, dann entfernen Sie sie. Waschen Sie die gleiche Fläche mit steriler Ringer-Lösung ein-oder zweimal, dann Platz 100 &mgr; Sal-1 Überstand, kümmert sich nicht um die Flüssigkeit in den Poly-HEMA Seite der Schale zu verschütten. Der erste Antikörper sorgt für Sal-1 bei einer bekannten Konzentration beschichtet ist.
11. Inkubieren Sie die Gerichte mit der Sal-1 Nacht.
12. Entfernen Sie die Sal-1-Antikörper-Lösung und spülen Sie die Fläche mit sterilen Ringerlösung. Führen Sie 2 ml Medium, um die Schale kurz vor Zell-Beschichtung.

Die Zusammensetzung der Amphibien-Ringer-Lösung, Serum-freien Medium Amphibien und Ringer-Lösung für die Enzym-Verdauung sind in MacLeish und Townes-Anderson (1988) und Mandell et al. (1993).

Vorbereitung der Zellkulturen

Die Zellen in diesem Video verwendet wurden abgeleitet helladaptierte, Erwachsenen-, Wasser-Phase Tiger Salamander (Ambystoma tigrinum), Mess 17-22 cm in der Länge (Charles Sullivan Inc., Nashville, TN), bei 5 ° C gehalten auf einer 12 h: 12 h Hell-Dunkel-Zyklus. Die Protokolle wurden von der Institutional Animal Care genehmigt und Verwenden Committee (IACUC) an der University of Medicine and Dentistry of New Jersey in strikter Übereinstimmung mit den Richtlinien des National Institutes of Health. Das Verfahren zur Vorbereitung der retinalen Zellkulturen werden durch Nachman-Clewner und Townes-Anderson (1996) beschrieben und sind wie folgt:

1. Enthaupten und Mark der Tiere. Entfernen Sie die Augen und sezieren die Hornhaut und Iris. Die Netzhaut ist leicht zu lösen innerhalb der Augenmuschel. Durch die Platzierung einer gebogenen Pinzette unter der Netzhaut, aushöhlen der Netzhaut. Es ist nicht wichtig, wenn die Linse auf die Netzhaut an dieser Stelle angebracht.
2. Digest der Netzhaut in 14 U / ml Papain (Worthington, Freehold, NJ) in Salamander Ringer-Lösung für 40 Minuten.
3. Vor dem Gebrauch sollte das Papain Ringer-Lösung mit 95% O ₂ / 5% CO _2-Gas für 30 Minuten perlen., Dann durch den Durchgang durch einen 0,22-Mikron-Filter (Millipore, Carrigtwohill, Irland) sterilisiert.
4. Spülen Sie die Netzhaut mit einer sterilen Salamander Ringer-Lösung dreimal.
5. Entfernen Sie die Linsen aus der Ringer-Lösung, dann sanft verreiben der Retina mit einer 3 mm Bohrung Pipette auf eine Zellsuspension zu erhalten.

Laser Pinzette Manipulation von isolierten Neuronen

1. Legen Sie die Kulturschale auf dem Mikroskoptisch, Ausrichtung der Schüssel durch Ausrichtung einer Marke auf dem Teller mit einem Bezugspunkt auf der Bühne. Speichern Sie die Koordinaten der Bezugspunkte in den Computer ein.
2. Platte Zellen auf beiden Sal-1 und Poly-HEMA Hälften der Schale.
3. Lassen Sie die Zellen für ca. 20 Minuten zu regeln, die lang genug ist für die Zellen auf die haftende Seite der Schale an den Antikörper Substrat befestigen.
4. Wählen Sie eine Zelle auf der Sal-1 haftende Seite der Schale. Markieren Sie die x-und y-Koordinaten der Bühne einer Position nahe der Zelle. In unserem Fall war der Punkt, etwa 10 um von der primären Dendriten der ausgewählten Zelle. Speichern Koordinaten in den Computer ein.
5. Wählen Sie ein zweites Neuron, in unserem Fall einen Photorezeptor, auf der Poly-HEMA Seite der Schale und die Laserpinzette Werkzeug, um es trap. Trapping kann über eine breite Palette von Leistungen erreicht werden. Allerdings setzen wir die Leistung des Lasers bei 10% -20%, die niedrig genug, um Trapping Schutt zusammen mit der Zelle zu vermeiden ist, aber ausreicht, um die Zelle durch das Medium zu transportieren.
6. Halten Sie die Zelle, in die Falle, senken Sie die Bühne, so dass die Zelle liegt deutlich über der Oberfläche der Kulturschale und vor allen angeschlossenen Neuronen. Bewegen Sie die Bühne unter Computer-Kontrolle der Zelle, um die zuvor gespeicherten x-und y-Koordinaten zu bringen auf die Sal-1-Seite. Die Bühne Bewegung war in 8-20 um / s eingestellt, aber Höchstgeschwindigkeit sollte empirisch ermittelt werden. Bei der Ankunft am Zielpunkt auf der Sal-1-Seite, heben die Bühne, um die eingeschlossenen Zellen an der Oberfläche der Schale zu bringen. Zell-Platzierung können mit einer Genauigkeit von wenigen Mikrometern hergestellt werden. Lassen Sie die Zelle, die Sal-1 Substrat haften.
7. Beziehen digitalisierten Bilder der beiden Zellen in das Paar vor und nach der Paarbildung ist ein nützliches aufzeichnen.
8. Pflegen Sie die Zelle paarweise in einem Inkubator. Für Salamander-Zellen, die Schalen in einer feuchten Kammer bei 10 ° C. Die Zellen können per Video Zeitraffer überwacht werden und mit jedem zellbiologischen Technik erforderlich.

Discussion

Licht hat an Dynamik, und wenn ein Lichtstrahl gebrochen wird, wie es durch eine Zelle durchläuft, eine Kraft ist erforderlich, um die Richtung des Impulses zu ändern. Wegen des Gesetzes von der Erhaltung des Impulses, muss eine Kraft in die entgegengesetzte Richtung, die ihrerseits wieder reagieren auf eine Zelle. Ashkin (1991) zeigten, dass die Kraft, die durch einen Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv fokussiert generiert wird eine Zelle zur Mitte des Fokus zu verschieben. Auch wenn ein Laserstrahl erzeugt nur ein paar Pikonewton von Gewalt, wird diese Kraft ausreichend, um eine Zelle durch Medium zu ziehen. Eine Nah-Infrarot-Wellenlänge, die schlecht durch Wasser absorbiert wird, wird verwendet, um eine Beschädigung der Zelle (Liu et al 1995) zu vermeiden. Der Laser-Pinzette Arbeitsplatz in unserem Labor eingesetzt (Cell Robotics Inc., Albuquerque NM) nutzt einen 1 W, continuous wave-Diodenlaser von 980 nm Wellenlänge. Das Laserlicht wird auf die Zellen über ein 40x Öl-Immersion Plan neofluor Objektiv hoher numerischer Apertur (NA1.3) (Carl Zeiss Inc.), die den Strahl fokussiert auf die gleiche Bildebene als das Mikroskop übertragen.

Laser-Pinzette-gesteuerte Mikromanipulation präsentiert eine Reihe von Vorteilen gegenüber Studien zufällig plattierten Zellen. Zum Beispiel können Zellen in einem gewünschten Abstand voneinander, die standardisiert werden für alle manipulierten Zellen platziert werden können. Darüber hinaus geht der Laserstrahl durch das transparente Oberfläche der Kulturschale und damit Zell-Manipulation ist in einem geschlossenen, sterilen Umgebung gemacht. Die sehr kleine Kräfte, die durch den Laser erzeugte Stellen eine Grenze, was eingefangen werden können. Nach unserer Erfahrung sind Adhäsions-und Zell Form die wichtigsten Faktoren, die erfolgreiche Trapping. Im Allgemeinen, trap wir isolierten Zellen von 10-15 um im Durchmesser und transportieren sie Distanzen von einigen Millimetern über der Kulturschale zu ihrem Bestimmungsort. Es ist möglich, größere Zellen als diese zu bewegen, z. B., Müller Glia-Zellen, die 20-40 um in der Länge und sind die größten Zellen in unseren Kulturen.

Da Trapping-Zellen ist eine Herausforderung, wenn die Zellen auf den Glasboden der Kulturschale und aneinander haften, die Entwicklung einer Zelle abweisenden Oberfläche auf dem Deckglas mit Poly-HEMA sich von unschätzbarem Wert für unseren Erfolg in Manipulation von Zellen. Trotzdem die Zellen auf der Poly-HEMA Oberfläche wurde schließlich klebriger und schwer in Kulturen mehr als 1-2 Stunden alt zu manipulieren. In älteren Kulturen, die gängige Praxis in unserem Labor zu versuchen, holen die Zellen mit dem Laser unter Verwendung der maximalen Leistungsstufe wurde, schalten Sie das Gerät nach unten zu transportieren.

Die Leichtigkeit, mit der kleinen Objekten in der Laser-gefangen werden kann, bedeutet, dass Schmutz in die Falle, aus Entfernungen auch außerhalb der Zelle gezogen werden. Dies erwies sich als ein Problem während der Überfüllung unserer Zellen. Dies kann in den meisten Fällen durch Umklappen der Leistung des Lasers auf das mögliche Mindestmaß, dass die Zelle in der Falle halten kann vermieden werden. Die Geschwindigkeit, mit der Zellen in der Falle transportiert werden kann, ist von der Viskosität des Mediums begrenzt. Wir in der Regel die Geschwindigkeit auf etwa 8-20 mu m / Sekunde, was gefunden, in einem sicheren Bereich für den Transport war.

Die Möglichkeit, dass der Laser nachteilige Auswirkungen auf die Zellen in der Falle gehalten hat, muss in Betracht gezogen werden. In unserer Netzhaut Kulturen begegnen wir dunkle Objekte wie Pigmentzellen, die zerstört werden, wenn in den Laserstrahl erfasst werden. Es ist deshalb festzustellen, können diese Zellen nicht untersucht mittels Laser-Pinzette werden. Doch in früheren Studien über Netzhautneuronen und Photorezeptoren in unserem Labor durchgeführt, fanden wir keinen Unterschied in neuritischen Wachstum und die Fähigkeit, Verbindungen zwischen Pinzette manipulierten Zellen und nicht-manipulierten Zellen bilden (Townes-Anderson et al 1998; Clarke et al 2008 ).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
25mm circle No.1 coverglass	VWR international	48380 080
poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA)	Sigma-Aldrich	P-3932	Dissolve in 95% ethanol
Goat anti-mouse IgG antibody	Chemicon International	AP181	1mg in 1ml, dilute 10x for use
Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody	generously provided by Dr. Peter MacLeish		Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA
3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets	Corning	7078A-5
Cell culture dishes 35mm x 10mm	Corning	430165
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Dow Corning
Optical tweezers-microtool or laser tweezers	Cell Robotics Inc.
1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength	Cell Robotics Inc.
Axiovert 100 inverted light microscope	Carl Zeiss, Inc.
40x oil immersion plan neofluor objective lens	Carl Zeiss, Inc.		Numerical aperture (N.A. 1.3)
Black and white CCD camera	Sony Corporation
Computer and joystick with software	Cell Robotics Inc.		for controlling a motorized stage