Summary
וידאו זה מתאר את המניפולציה של נוירונים בתרבית באמצעות לייזר פינצטה במבחנה.
Abstract
במאמר זה ווידאו, אנו מתארים את הפרוטוקולים המשמשים במעבדה שלנו ללמוד את העדפות המיקוד של תהליכי התחדשות התא של הנוירונים ברשתית מבוגר במבחנה. נהלים להכנת תרביות תאים ברשתית להתחיל עם לעיכול נתיחה, טחינה דקה של הרשתית, ולסיים עם ציפוי של תאים ברשתית מבודדת על הכלים שנעשו במיוחד לשימוש עם פינצטה לייזר. מאכלים אלה מחולקים חצי תא דבק וחצי דוחה התא. הצד דבק התא מצופה בשכבה של סאל-1 נוגדנים, המספקים המצע שעליו גדלים התאים שלנו. מצעים דבק אחר יוכל לשמש עבור סוגי תאים אחרים. הצד דוחה התא מצופה בשכבה דקה של פולי-המה. התאים מצופה בצד מרובה המה המנה לכודים עם פינצטה לייזר, מועבר ואז להציב סמוך לתא בצד סאל-1 כדי ליצור זוג. כינונה של קבוצות תאים בכל גודל צריך להיות אפשרי עם טכניקה זו. "לייזר פינצטה שבשליטת המיקרומניפולציה" אומר החוקר יכול לבחור אילו תאים להעביר את המרחק הרצוי בין תאים יכול להיות סטנדרטית. כיוון את קרן הלייזר עוברת משטחים שקופים של המנה תרבות, בחירת מיקום התא נעשים בסביבה, סגורה סטרילית. תאים יכול להיות פיקוח על ידי וידאו זמן לשגות בשימוש עם טכניקה כל תא ביולוגי הנדרש. טכניקה זו עשויה לסייע בחקירות של תאים תאים אינטראקציות.
Protocol
פינצטה אופטית עבור מניפולציה בתאים מבודדים בתרבות
כוחות השמנה של פינצטה אופטית מופקות מן המומנטום של אור (Ashkin, 1991;. Ashkin et al, 1986). למרות הכוחות האלה בקלות למלכודת תאים ההשעיה, הם אינם מסוגלים לנוע התאים להיצמד למשטח. לכן, כדי להפחית הידבקות התבשיל תרבות בנקודה שבה תאים לכודים, coverslip מצופה פולי-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-המה) מתחם (סיגמא כימית ושות', סנט לואיס, מיזורי), רעילים עם תא דוחה מאפייני המועסקים קודם לכן לתאי אנדותל (מוסקונה פולקמן ו, 1978) ללימודי הידבקות. בעוד מרובה המה מכסה מחצית המנה תרבות, החצי השני מצופה המצע התומך צמיחת תאים. במעבדה שלנו, סאל-1 משמש המצע של סלמנדרה culturing תאים ברשתית. הליך בודה סאל-1 ו-Poly-המה הכלים מצופה מתואר להלן:
ייצור של מאכלים תרבות
- Coverglasses נקי (# 1 VWR מדעי Inc, מדיה, PA) בחומצה. Coverglass זה נבחר עובי של 0.1mm פשוט, הכרחי עבור מטרות גבוהות הצמצם המספרי הנדרש למיקוד הלייזר.
- כדי ליצור אזור דוחה התא, להמיס 20 מ"ג מרובה המה (סיגמא כימית ושות', סנט לואיס, מיזורי) ב 1ml של אתנול 95% במשך הלילה בטמפרטורת החדר. רצוי, פתרון זה יש להשתמש בתוך חודש 1 של הכנה.
- הנכס את coverglasses במיקום אנכי ליד בסביבת אבק חופשי כמו ברדס.
- מקום אחד או שניים טיפות של תמיסת מרובה המה בסמוך לחלקו העליון של coverglass מקצה פלסטיק של micropipette 200μl. טיפות (כ 50-100μl כל אחד) יש להגביל את מחצית coverglass. המדרון התלול מבטיח הנוזל זורם מטה השטח של coverglass לתחתית, מתן ציפוי אפילו דקה של פולי-המה. אפשר מרובה המה coverglasses מצופה לייבוש למכסה המנוע של 30-60 דקות בטמפרטורת החדר.
- סמן את הצד מרובה המה של coverglass עם עט טיפ מצוין קרוב לקצה.
- לקדוח חור 1 ס"מ בתחתית צלחת תרבות 35 מ"מ.
- דבק coverglass מרובה המה מצופה לתחתית צלחת עם תרבות Sylgard 184 (Dow Corning ושות' Midland, MI) כך שהצד מרובה המה מצופה הפנים כלפי החלק הפנימי של המנה. ודא את הקצה של ציפוי מרובה המה רץ לאורך מרכז החור. המנות אפשר להתייבש במשך 1-3 ימים בטמפרטורת החדר בסביבה נטולת אבק.
- Scratch קו בצד החיצוני של coverglass עם עט יהלום טיפ הבאה בקצה ציפוי מרובה המה. ואז, שריטה שני קווים חוצים בזווית ישרה הוא כ 2 מ"מ זה מזה. שתי נקודות של הצומת לשמש כנקודת התייחסות או נקודות fiducial לשמש לשחזר את האוריינטציה של אותו מאכל התרבות על הבמה מיקרוסקופ.
- לעקר את הכלים באור אולטרה סגול לילה.
- כדי ליצור חצי התא חסיד של המנה תרבות, מעיל החצי הלא מרובה המה עם סאל-1, אשר מכיל אנטי סלמנדרה עכבר נוגדנים נגד העלה קרום התא רשתית (בתנאי בנדיבות על ידי ד"ר פיטר מק 'ליש, בית הספר לרפואה של מורהאוס , Atlanta, GA; לראות מקליש et al (1983)).. ראשית, המעיל בצד-1 מ"ג סאל עם כ 100μl של 0.1 / מ"ל סטרילי אנטי עכבר עז IgG נוגדנים (Boehringer מנהיים Corporation, באינדיאנפוליס IN), נזהרת לא לשפוך את הנוזל על הצד מרובה המה. השאירו למשך שלוש שעות, ולאחר מכן להסיר אותה. לשטוף את האזור אותו עם פתרון Ringer של סטרילית פעם או פעמיים, אז במקום 100μl סאל-1 supernatant, נזהרת לא לשפוך את הנוזל לתוך הצד מרובה המה של המנה. הנוגדן first מבטיח סאל-1 הוא מצופה בריכוז ידוע.
- דגירה את הכלים עם סאל-1 לילה.
- הסר את הפתרון סאל-1 נוגדן ולשטוף את האזור בתמיסת רינגר של סטרילית. הציגו 2 בינוני מ"ל למנה קצר לפני ציפוי התא.
הרכב של הפתרון Ringer של דוחי, סרום ללא בינוני דוחי, והפתרון של רינגר לעיכול האנזים נמצאים מקליש ו-Townes אנדרסון (1988) ו מנדל et al. (1993).
הכנת תרביות תאים
התאים המשמשים וידאו זה נגזרו אור מותאם, בוגר מימיים שלב נמר סלמנדרות (Ambystoma tigrinum), מדידת 17-22 ס"מ אורך (צ'רלס סאליבן Inc, בנשוויל, טנסי), נשמר על 5 מעלות צלזיוס על 12 שעות: 12 שעות אור כהה מחזור. הפרוטוקולים אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש הוועדה (IACUC) באוניברסיטה לרפואה ורפואת שיניים של ניו ג'רזי בהתאם קפדנית עם ההנחיות של המכון הלאומי לבריאות. הנהלים להכנת תרביות תאים ברשתית מתוארים על ידי נחמן-Clewner ו-Townes אנדרסון (1996) הם כדלקמן:
- לערוף ומוח החיות. הסר את העיניים לנתח את קרניות ו איריס. הרשתיות צריך לנתק קצת בתוך עיינית. על ידי הצבת מלקחיים מעוקל מתחת הרשתית, לגרוף את הרשתיות. אין זה חשוב אם העדשה מחוברת הרשתית בשלב זה.
- תקציר הרשתיות ב papain 14 U / ml (וורטינגטון, לפריהולד, NJ) בתמיסה סלמנדרה רינגר במשך 40 דקות.
- לפני השימוש, הפתרון Ringer של papain צריך להיות מבעבע עם 95% O 2 / 5% גז CO 2 למשך 30 דקות., מעוקרים אז דרך 0.22 מיקרון המסנן (Millipore, Carrigtwohill, אירלנד) על ידי מעבר.
- שוטפים את הרשתית עם פתרון סטרילי סלמנדרה רינגר שלוש פעמים.
- הסר את העדשות מפתרון רינגר, אז בעדינות triturate רקמת הרשתית עם 3 מ"מ משעמם פיפטה להניב ההשעיה התא.
לייזר פינצטה מניפולציה של נוירונים בודדים
- מניחים את צלחת התרבות על הבמה מיקרוסקופ, המכוונת את המנה על ידי יישור סימן על צלחת עם נקודת התייחסות על הבמה. שמור את הקואורדינטות של נקודות fiducial במחשב.
- צלחת התאים על שניהם סאל-1 ו-Poly-המה חצאים של המנה.
- אפשר התאים להסתפק בערך 20 דקות, וזה זמן מספיק תאים בצד חסיד של המנה לצרף למצע נוגדן.
- בחר תא בצד סאל-1 חסיד של המנה. סמן את x ו-y הבמה עמדה קרוב לתא. במקרה שלנו, הנקודה היתה כ 10μm מן דנדריטים העיקרי של התא הנבחר. שמור קואורדינטות במחשב.
- בחר הנוירון השני, במקרה שלנו photoreceptor, בצד מרובה המה המנה ולהשתמש בכלי פינצטה לייזר כדי ללכוד אותו. השמנה יכולה להיות מושגת על פני טווח רחב של רמות הספק. עם זאת, אנו קובעים את הכוח של הלייזר ב 10% -20%, שהיא נמוכה מספיק כדי למנוע השמנה, יחד עם פסולת התא, אבל מספיק כדי להוביל את התא דרך המדיום.
- בעוד מחזיק את התא במלכודת, מנמיכים את הבמה כך התא היטב מעל פני השטח של צלחת תרבות מעל כל הנוירונים המצורפת. הזז את הבמה תחת שליטה במחשב כדי להביא את התא אל x ו-y שנשמרו בעבר קואורדינטות בצד סאל-1. התנועה השלב נקבע על 8-20μm / s, אך המהירות המרבית צריך להיקבע באופן אמפירי. ההגעה לנקודת היעד בצד סאל-1, להעלות את הבמה כדי להביא את התא לכודים על פני השטח של המנה. מיקום התא יכול להתבצע עם דיוק של מיקרונים אחדים. אפשר התא להיצמד למצע סאל-1.
- קבלת תמונות דיגיטציה של תאים הן צמד לפני ואחרי הקמת הצמד מספק שיא שימושי.
- שמירה על זוגות תא באינקובטור. עבור תאים סלמנדרה, במקום מנות בתא humidified על 10 ° C. תאים יכול להיות פיקוח על ידי זמן לשגות וידאו בשימוש עם טכניקה כל תא ביולוגי הנדרש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Light יש מומנטום, וכאשר קרן האור נשבר כשהוא עובר דרך תא, כוח נדרש כדי לשנות את כיוון המומנטום. בגלל חוק שימור התנע, כוח בכיוון ההפוך חייב, בתורו, להגיב בחזרה לתא. Ashkin (1991) הראה כי הכוח שנוצר על ידי קרן לייזר ממוקדת על ידי עדשה מיקרוסקופ המטרה יעברו תא לעבר מרכז המיקוד. אף על פי קרן לייזר מייצר רק piconewtons כמה כוח, כוח זה מספיק כדי למשוך תא דרך המדיום. גל אינפרא אדום הקרוב כי הוא נספג היטב על ידי מים משמש כדי למנוע נזק לתא (Liu et al 1995). תחנת עבודה לייזר פינצטה בשימוש במעבדה שלנו (Cell Robotics Inc, Albuquerque NM) משתמשת 1 W, גל מתמשך דיודת לייזר באורך גל של 980nm. אור הלייזר מועברת אל התאים באמצעות שמן 40X טבילה העדשה תוכנית המטרה neofluor של הצמצם המספרי גבוה (NA1.3) (Carl Zeiss Inc) אשר מתמקדת הקורה בכל מישור המוקד כמו המיקרוסקופ.
לייזר פינצטה שבשליטת המיקרומניפולציה מציג מספר יתרונות על פני מחקרים על תאים מצופה באופן אקראי. לדוגמה, תאים יכולים להיות ממוקמים במרחק הרצוי אחת מהשנייה אשר יכול להיות סטנדרטי עבור כל התאים מניפולציות. בנוסף, קרן הלייזר עובר דרך משטח שקוף של המנה תרבות, ולכן מניפולציה התא נעשית בסביבה, סגורים סטרילית. כוחות קטנים מאוד שנוצר על ידי לייזר המקומות מגבלה על מה יכול להיות לכוד. מניסיוננו, הידבקות ואת צורת התא הם הגורמים החשובים ביותר הגבלת השמנה מוצלח. באופן כללי, אנו מלכודת תאים מבודדים של 10-15μm בקוטר להסיעם מרחקים של מילימטרים אחדים על פני צלחת תרבות ליעדם. אפשר להזיז תאים אלה גדולים יותר, למשל, תאים מולר גליה, שהם 20-40μm באורך הם התאים הגדולים התרבויות שלנו.
בגלל השמנה תאים הוא אתגר כאשר התאים להיצמד לתחתית כוס צלחת תרבות זו לזו, פיתוח שטח פני התא דוחה על coverglass באמצעות מרובה המה הוכיח שלא יסולא בפז להצלחה שלנו בתאים מניפולציה. למרות זאת, התאים על פני השטח מרובה המה בסופו של דבר הפכה מסובכת וקשה לתמרן בתרבויות יותר מ 1-2 שעות. בתרבויות מבוגרים יותר, מקובל במעבדה שלנו היה לנסות להרים את התאים עם לייזר תוך שימוש בהגדרה הכוח המקסימלי, ולאחר מכן להפעיל את הכוח כלפי מטה כדי להעביר אותו.
הקלות שבה חפצים קטנים יכולים להיות לכודים הלייזר כלומר פסולת יכול להיות משכו למלכודת ממרחקים גם מחוץ לתא. זו הוכחה להיות בעיה במהלך לכידה של התאים שלנו. זו ניתן להימנע ברוב המקרים על ידי לכבות את העוצמה של הלייזר על מינימום אפשרי שיכול להחזיק את התא בתוך המלכודת. המהירות שבה תאים יכולים להיות מועבר במלכודת מוגבל על ידי צמיגות של המדיום. בדרך כלל אנחנו להגדיר את מהירות בסביבות 8-20 מיקרומטר / שנייה אשר נמצאה בטווח בטוח התחבורה.
האפשרות כי לייזר יש השפעות מזיקות על התאים שנערך המלכודת יש לקחת בחשבון. בתרבויות הרשתית שלנו, אנו פוגשים אובייקטים כהים כגון תאים פיגמנט אשר נהרסים כאשר נתפס קרן לייזר. ברור, אם כן, תאים אלה לא ניתן ללמוד באמצעות לייזר פינצטה. עם זאת, במחקרים קודמים על נוירונים הרשתית photoreceptors שבוצעו במעבדה שלנו, לא מצאנו הבדל בצמיחה מדלקת עצבים ויכולת ליצור קשרים בין תאים פינצטה, מניפולציות תאים שאינם מניפולציה (Townes-Anderson et al 1998; קלארק et al 2008 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחקר נתמך על ידי NIH מענקים EY012031 ו EY0182175 ואת קירבי FM קרן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR international | 48380 080 | |
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | |
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning | 7078A-5 | |
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning | 430165 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc. | ||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc. | ||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss, Inc. | Numerical aperture (N.A. 1.3) | |
| Black and white CCD camera | Sony Corporation | ||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
