Summary
यह वीडियो सभ्य न्यूरॉन्स इन विट्रो में लेजर चिमटी का उपयोग कर के हेरफेर का वर्णन करता है.
Abstract
इस कागज और वीडियो में, हम लक्ष्यीकरण regenerating सेल प्रक्रियाओं के इन विट्रो में वयस्क रेटिना न्यूरॉन्स की वरीयताओं को अध्ययन के लिए हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का वर्णन. रेटिना सेल संस्कृतियों की तैयारी के लिए प्रक्रिया विच्छेदन, पाचन और रेटिना के trituration, लेजर चिमटी के साथ उपयोग के लिए विशेष रूप से बने बर्तन पर अलग रेटिना की कोशिकाओं के चढ़ाना के साथ और अंत के साथ शुरू करते हैं. इन व्यंजनों को एक सेल चिपकने वाला आधा और एक सेल repellant आधा में विभाजित हैं. सेल चिपकने वाला पक्ष साल एक एंटीबॉडी, जो एक सब्सट्रेट पर जो हमारी कोशिकाओं को बढ़ने प्रदान की एक परत के साथ लेपित है. अन्य चिपकने वाला substrates अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. सेल repellant पक्ष पाली - हेमा की एक पतली परत के साथ लेपित है. पकवान की पाली - हेमा पक्ष पर मढ़वाया कोशिकाओं लेजर चिमटी के साथ फंस रहे हैं, पहुंचाया और फिर एक सेल करने के लिए आसन्न साल एक तरफ एक जोड़ी बनाने के लिए रखा. किसी भी आकार के सेल समूहों का गठन इस तकनीक के साथ संभव होना चाहिए. "लेजर चिमटी नियंत्रित micromanipulation" का मतलब है कि अन्वेषक जो कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए चुन सकते हैं, और कोशिकाओं के बीच वांछित दूरी मानकीकृत किया जा सकता है. क्योंकि लेजर बीम संस्कृति पकवान की पारदर्शी सतहों के माध्यम से चला जाता है, सेल चयन और नियुक्ति एक संलग्न, बाँझ वातावरण में किया जाता है. कक्ष समय चूक वीडियो द्वारा नजर रखी जा सकता है और किसी भी सेल जैविक तकनीक की आवश्यकता के साथ इस्तेमाल किया. इस तकनीक को सेल सेल बातचीत की जांच में मदद मिल सकती है.
Protocol
संस्कृति में अलग कक्षों को जोड़ तोड़ के लिए ऑप्टिकल चिमटी
ऑप्टिकल चिमटी के फँसाने बलों प्रकाश की गति (; Ashkin एट अल, 1986 Ashkin, 1991) से उत्पन्न कर रहे हैं. हालांकि इन बलों को आसानी से जाल निलंबन में कोशिकाओं, वे कोशिकाओं है कि एक सतह का पालन स्थानांतरित करने के लिए सक्षम नहीं हैं. इसलिए, बिंदु है जहां कोशिकाओं में फंस रहे हैं संस्कृति डिश के लिए आसंजन कम, coverslip पाली-2-hydroxyethylmethacrylate (पाली - हेमा) (सिग्मा रासायनिक कं, सेंट लुइस, MO), विकर्षक सेल के साथ एक nontoxic परिसर के साथ लेपित है गुण पहले endothelial कोशिकाओं (Folkman और Moscona, 1978) पर आसंजन अध्ययन के लिए नियोजित. जबकि पाली हेमा संस्कृति पकवान की एक आधा कवर, दूसरे आधे एक सब्सट्रेट है कि सेल के विकास का समर्थन करता है के साथ लेपित है. हमारी प्रयोगशाला में, 1 साल - संवर्धन समन्दर रेटिना की कोशिकाओं के लिए सब्सट्रेट के रूप में प्रयोग किया जाता है. साल-1 fabricating और पाली - हेमा लेपित व्यंजन नीचे वर्णित है के लिए प्रक्रिया :
संस्कृति बर्तन का निर्माण
- एसिड में साफ़ coverglasses (# 1 VWR वैज्ञानिक इंक, मीडिया, फिलीस्तीनी अथॉरिटी). इस coverglass सिर्फ 0.1mm मोटाई, उच्च संख्यात्मक एपर्चर लेजर ध्यान केंद्रित करने के लिए आवश्यक उद्देश्यों के लिए आवश्यक के लिए चुना गया था.
- एक सेल repellant क्षेत्र बनाने के लिए, 95% इथेनॉल 1ml में 20 मिलीग्राम पाली - हेमा (सिग्मा रासायनिक कं, सेंट लुइस, MO) रातोंरात भंग कमरे के तापमान पर. अधिमानतः, इस समाधान की तैयारी के 1 महीने के भीतर किया जाना चाहिए.
- जैसे एक डाकू के रूप में एक धूल से मुक्त वातावरण में एक के पास ऊर्ध्वाधर स्थिति में coverglasses प्रोप.
- पाली - हेमा 200μl micropipette के प्लास्टिक सिरे से coverglass के शीर्ष के निकट समाधान के एक या दो बूँदें प्लेस. बूँदें (50 100μl प्रत्येक के बारे में) coverglass के एक आधे के लिए प्रतिबंधित किया जाना चाहिए. खड़ी इच्छा सुनिश्चित करता है तरल नीचे coverglass की सतह के नीचे बहती है, पाली - हेमा की एक पतली भी कोटिंग प्रदान. पाली - हेमा लेपित coverglasses कमरे के तापमान पर 30-60 मिनट के लिए हुड में सूखे के लिए अनुमति दें.
- किनारे के पास एक अच्छी टिप पेन के साथ पाली - हेमा coverglass की ओर मार्क.
- एक 35 मिमी संस्कृति डिश के तल में एक 1 सेमी छेद ड्रिल.
- पाली - हेमा Sylgard 184 (डॉव Corning कं, मिडलैंड, एमआई) के साथ संस्कृति इतनी पकवान के नीचे करने के लिए लेपित coverglass कि पाली - हेमा लेपित पक्ष पकवान के अंदर की ओर चेहरे गोंद. पाली - हेमा कोटिंग के किनारे सुनिश्चित नीचे छेद के केंद्र चलाता है. व्यंजन एक धूल से मुक्त वातावरण में कमरे के तापमान पर 1-3 दिनों के लिए शुष्क करने की अनुमति दें.
- एक हीरे की नोक कलम निम्नलिखित पाली - हेमा कोटिंग के किनारे के साथ coverglass के बाहर एक लाइन स्क्रैच. फिर, यह लगभग 2mm दो पार सही कोण पर अलग लाइनों खरोंच. चौराहे के दो अंक संदर्भ या Fiducial अंक खुर्दबीन मंच पर संस्कृति पकवान की इसी अभिविन्यास reproducing के लिए इस्तेमाल किया जा के रूप में सेवा करते हैं.
- पराबैंगनी प्रकाश के तहत व्यंजन रातोंरात जीवाणुरहित.
- संस्कृति डिश सेल पक्षपाती आधा साल-1 के साथ गैर पाली - हेमा आधा कोट, जो एक विरोधी समन्दर माउस रेटिनल कोशिका झिल्ली (उदारता, मोरहाउस स्कूल ऑफ मेडिसिन के डॉ. पीटर MacLeish द्वारा प्रदान के खिलाफ उठाया एंटीबॉडी शामिल बनाने , अटलांटा, GA,. MacLeish एट अल (1983) देखें). सबसे पहले, लगभग 100μl 0.1 मिलीग्राम / मिलीलीटर बाँझ बकरी विरोधी माउस आईजीजी प्रतिरक्षी (Boehringer मैनहेम निगम, इंडियानापोलिस में) के साथ साल 1 साइड कोट, पाली - हेमा पक्ष पर अधिक तरल नहीं फैल ख्याल रख रही है. तीन घंटे के लिए छोड़ दें, तो इसे हटा दें. बाँझ है घंटी समाधान के साथ ही क्षेत्र धो एक या दो बार, तो 100μl साल एक सतह पर तैरनेवाला जगह, ध्यान लेने के तरल पकवान की पाली - हेमा पक्ष में नहीं फैल. पहली एंटीबॉडी सुनिश्चित करता है साल एक एक ज्ञात एकाग्रता में लेपित है.
- साल - एक रातोंरात के साथ व्यंजन सेते हैं.
- साल-1 एंटीबॉडी समाधान निकालें और बाँझ घंटी समाधान के साथ क्षेत्र कुल्ला. सिर्फ सेल चढ़ाना से पहले पकवान 2 मिलीलीटर मध्यम परिचय.
उभयचर घंटी समाधान, सीरम मुक्त उभयचर मध्यम, और एंजाइम पाचन के लिए घंटी के समाधान की रचना MacLeish और तोव्नेस-एंडरसन (1988) और Mandell एट अल में पाया जाता है. (1993).
सेल संस्कृतियों की तैयारी
इस वीडियो में इस्तेमाल किया कोशिकाओं से प्राप्त किए गए प्रकाश अनुकूलित, वयस्क, जलीय चरण बाघ salamanders (tigrinum Ambystoma), लंबाई में 17-22 सेमी को मापने (चार्ल्स सुलिवन इंक, Nashville, TN), 5 में बनाए रखा ° C पर एक 12 घंटे: 12 घंटे प्रकाश अंधेरे चक्र. प्रोटोकॉल संस्थागत पशु की देखभाल के द्वारा अनुमोदित किया गया और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान से दिशा निर्देशों के साथ सख्त अनुसार विश्वविद्यालय में चिकित्सा और दंत चिकित्सा न्यू जर्सी के की समिति (IACUC) का प्रयोग करें. रेटिना सेल संस्कृतियों की तैयारी के लिए प्रक्रियाओं Nachman Clewner और तोव्नेस एंडरसन (1996) द्वारा वर्णित हैं और निम्नानुसार हैं:
- सिर काटना और मज्जा जानवरों. आँखें निकालें और corneas और परितारिका काटना. retinas eyecup के भीतर थोड़ा अलग होना चाहिए. रेटिना के नीचे एक घुमावदार संदंश रखकर बाहर retinas स्कूप. यह महत्वपूर्ण नहीं है अगर लेंस इस चरण में रेटिना से जुड़ा हुआ है.
- 14 यू / मिलीलीटर समन्दर है घंटी समाधान में papain (Worthington, Freehold, NJ) में 40 मिनट के लिए retinas डाइजेस्ट.
- उपयोग करने के लिए पहले papain है घंटी समाधान 95% 2 हे / 30 मिनट के लिए 5% सीओ 2 गैस के साथ bubbled होना चाहिए, तब 0.22 माइक्रोन फिल्टर (Millipore, Carrigtwohill, आयरलैंड) के माध्यम से पारित होने के द्वारा निष्फल.
- बाँझ समन्दर है घंटी तीन बार समाधान के साथ retinas कुल्ला.
- घंटी समाधान से लेंस निकालें, फिर धीरे से एक 3 मिमी के साथ रेटिना ऊतक triturate विंदुक बोर करने के लिए एक सेल निलंबन उपज.
लेजर पृथक न्यूरॉन्स की चिमटी हेरफेर
- खुर्दबीन मंच पर संस्कृति डिश प्लेस, मंच पर एक संदर्भ बिंदु के साथ पकवान पर एक निशान aligning से पकवान orienting. कंप्यूटर में Fiducial अंकों की निर्देशांक सहेजें.
- दोनों साल-1 पर प्लेट कोशिकाओं और पकवान की पाली - हेमा आधा.
- कोशिकाओं को लगभग 20 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए, जो पकवान की पक्षपाती पक्ष पर कोशिकाओं के लिए लंबे समय पर्याप्त है एंटीबॉडी सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न करने की अनुमति दें.
- पकवान की साल - एक पक्षपाती पक्ष पर एक कक्ष का चयन करें करें. मार्क x और y चरण सेल के करीब स्थिति के निर्देशांक. हमारे मामले में, चयनित कक्ष के प्राथमिक dendrites से लगभग 10μm बिंदु था. निर्देशांक कंप्यूटर में सहेजें.
- हमारे मामले में एक फोटोरिसेप्टर में एक दूसरे न्यूरॉन, पकवान की पाली - हेमा पक्ष पर, का चयन करें और लेजर चिमटी से नोचना उपकरण का उपयोग करने के लिए यह जाल. फँसाने सत्ता के स्तर की एक विस्तृत रेंज पर प्राप्त किया जा सकता है. हालांकि, हम 10% -20% है, जो काफी कम करने के लिए कक्ष के साथ फँसाने मलबे से बचने के है लेजर की शक्ति सेट, लेकिन मध्यम सेल के माध्यम से परिवहन करने के लिए पर्याप्त है.
- जबकि जाल में सेल पकड़े, मंच कम इतना है कि सेल संस्कृति डिश की सतह से ऊपर अच्छी तरह से और किसी भी संलग्न न्यूरॉन्स के ऊपर है. साल एक तरफ पहले से सहेजी गई x और y निर्देशांक सेल लाने कंप्यूटर नियंत्रण के अधीन मंच ले जाएँ. मंच आंदोलन 8 - 20μm / s पर सेट किया गया था, लेकिन अधिकतम गति empirically निर्धारित किया जाना चाहिए. साल एक तरफ गंतव्य बिंदु पर पहुंचने पर, मंच पर जुटाने के लिए डिश की सतह फंस सेल लाने के लिए. सेल प्लेसमेंट कुछ microns के एक सटीकता के साथ बनाया जा सकता है है. सेल साल एक सब्सट्रेट करने के लिए पालन करने की अनुमति दें.
- जोड़ी गठन के पहले और बाद में जोड़ी में दोनों कक्षों की छवियों डिजीटल प्राप्त करने के एक उपयोगी रिकॉर्ड प्रदान करता है.
- एक मशीन में सेल जोड़े बनाए रखें. समन्दर कोशिकाओं के लिए, एक humidified कक्ष में 10 व्यंजन जगह डिग्री सेल्सियस कक्ष वीडियो समय चूक द्वारा नजर रखी जा सकता है और किसी भी सेल जैविक तकनीक की आवश्यकता के साथ इस्तेमाल किया.
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Discussion
लाइट गति है, और जब एक प्रकाश किरण के रूप में यह एक सेल के माध्यम से गुजरता है refracted है, एक बल गति की दिशा बदलने के लिए आवश्यक है. गति के संरक्षण के कानून की वजह से, विपरीत दिशा में एक शक्ति, बारी में, किसी कक्ष पर वापस प्रतिक्रिया. Ashkin (1991) से पता चला है कि एक खुर्दबीन उद्देश्य लेंस द्वारा ध्यान केंद्रित एक लेजर बीम से उत्पन्न बल ध्यान के केंद्र की ओर एक सेल कदम होगा. हालांकि एक लेज़र बीम बल के केवल कुछ piconewtons उत्पन्न करता है, इस बल के माध्यम से एक सेल पुल करने के लिए पर्याप्त है. एक निकट अवरक्त तरंगदैर्ध्य है कि खराब पानी द्वारा अवशोषित कर लेता है सेल (लियू एट अल 1995) के लिए क्षति से बचने के लिए प्रयोग किया जाता है. लेजर चिमटी से नोचना हमारी प्रयोगशाला में प्रयुक्त वर्कस्टेशन (सेल रोबोटिक इंक, Albuquerque समुद्री मील दूर) 1 डब्ल्यू, 980nm तरंग दैर्ध्य की निरंतर तरंग लेजर डायोड का उपयोग करता है. लेसर प्रकाश के माध्यम से कोशिकाओं को उच्च संख्यात्मक एपर्चर के एक 40x तेल विसर्जन योजना neofluor उद्देश्य लेंस (NA1.3) (कार्ल Zeiss इंक) जो माइक्रोस्कोप के रूप में एक ही फोकल हवाई जहाज़ पर बीम केंद्रित फैलता है.
लेजर चिमटी नियंत्रित micromanipulation बेतरतीब ढंग से मढ़वाया कोशिकाओं पर अध्ययन से अधिक लाभ की एक संख्या प्रस्तुत करता है. उदाहरण के लिए, कोशिकाओं से एक दूसरे जो सभी चालाकी कोशिकाओं के लिए मानकीकृत किया जा सकता है एक वांछित दूरी पर रखा जा सकता है है. इसके अलावा, लेजर बीम संस्कृति पकवान की पारदर्शी सतह के माध्यम से गुजरता है और इसलिए, सेल हेरफेर एक संलग्न, बाँझ वातावरण में किया जाता है. बहुत छोटे लेजर द्वारा उत्पन्न बलों क्या फंस जा सकता है पर एक सीमा स्थानों. हमारे अनुभव में, आसंजन और सेल आकार सबसे महत्वपूर्ण सफल फँसाने सीमित कारक हैं. सामान्य में, हम व्यास में 10-15μm अलग कक्षों जाल और उन्हें अपने गंतव्य के लिए संस्कृति डिश भर में कई मिलीमीटर की दूरी परिवहन. यह संभव है इन से बड़ा कोशिकाओं को बढ़ने के लिए, उदाहरण के लिए, मुलर glial कोशिकाओं, जो लंबाई में 20 40μm कर रहे हैं और हमारे संस्कृतियों में सबसे बड़ी कोशिकाओं रहे हैं.
क्योंकि कोशिकाओं को फँसाने जब कोशिकाओं संस्कृति पकवान की गिलास नीचे करने के लिए और एक दूसरे का पालन एक चुनौती है, coverglass पाली - हेमा का उपयोग कर एक सेल repellant सतह के विकास से छेड़छाड़ की कोशिकाओं में हमारी सफलता के लिए अमूल्य साबित कर दिया. फिर भी, पाली - हेमा सतह पर कोशिकाओं अंततः stickier और मुश्किल से 1-2 घंटे से अधिक पुरानी संस्कृतियों में हेरफेर हो गया. पुराने संस्कृतियों में, हमारी प्रयोगशाला में आम अभ्यास करने के लिए अधिकतम शक्ति सेटिंग का उपयोग कर लेजर के साथ कोशिकाओं लेने की कोशिश करने के लिए किया गया था, तो बिजली नीचे बारी करने के लिए यह परिवहन.
आसानी के साथ जो छोटी वस्तुओं लेजर में फंस जा सकता है मतलब है कि मलबे कक्ष के बाहर अच्छी तरह से दूरी से जाल में खींचा जा सकता है है. यह हमारी कोशिकाओं के फँसाने के दौरान एक समस्या साबित हुई. ज्यादातर मामलों में यह नीचे मोड़ न्यूनतम संभव है कि जाल के भीतर सेल को पकड़ कर सकते हैं लेजर की शक्ति से बचा जा सकता है. गति, जिस पर कोशिकाओं के जाल में जाया जा सकता है है माध्यम का चिपचिपापन द्वारा सीमित है. हम आम तौर पर 8-20 आसपास सुक्ष्ममापी / दूसरा जो परिवहन के लिए एक सुरक्षित सीमा के भीतर हो पाया था पर गति सेट.
संभावना है कि लेजर जाल में आयोजित कोशिकाओं पर हानिकारक प्रभाव है विचार किया जाना चाहिए. हमारे रेटिना संस्कृतियों में, हम अंधेरे रंगद्रव्य कोशिकाओं जो जब लेजर बीम में कब्जा कर लिया नष्ट कर रहे हैं जैसे वस्तुओं मुठभेड़. जाहिर है, इसलिए इन कोशिकाओं लेजर चिमटी का उपयोग नहीं किया जा अध्ययन कर सकते हैं. हालांकि, रेटिना न्यूरॉन्स और हमारी प्रयोगशाला में किए गए photoreceptors पर पिछले अध्ययनों में, हम neuritic विकास और क्षमता को चिमटी से नोचना - चालाकी से कोशिकाओं और गैर - चालाकी कोशिकाओं के बीच कनेक्शन फार्म में कोई अंतर नहीं पाया (तोव्नेस एंडरसन एट अल 1998, क्लार्क एट अल 2008 ).
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Acknowledgments
अनुसंधान NIH EY012031 अनुदान और EY0182175 और एफएम Kirby फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR international | 48380 080 | |
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | |
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning | 7078A-5 | |
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning | 430165 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc. | ||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc. | ||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss, Inc. | Numerical aperture (N.A. 1.3) | |
| Black and white CCD camera | Sony Corporation | ||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
