Summary
이 동영상은 체외에서 레이저 핀셋을 사용하여 교양 뉴런의 조작을 설명합니다.
Abstract
본 논문 및 비디오에서 우리는 체외에서 성인 망막 뉴런의 재생 세포 프로세스의 타겟팅 설정을 연구하기 위해 실험실에서 사용되는 프로토콜을 설명합니다. 망막 세포 문화를 준비 절차, 특히 레이저 핀셋 사용하기 위해 만든 요리에 고립 망막 세포의 도금과 절개, 소화 및 망막의 분쇄 및 최종 함께 시작합니다. 이들 요리는 세포 접착제의 절반과 세포 repellant 절반으로 나누어집니다. 세포 접착제 사이드는 우리의 세포가 성장하는시 기판을 제공 살 - 1 항체의 레이어로 코팅됩니다. 기타 접착제 기판은 다른 세포 유형에 사용할 수 있습니다. 셀 repellant 사이드는 폴리 - HEMA의 얇은 레이어로 코팅됩니다. 접시의 폴리 - HEMA 측면에 도금 세포가 레이저 핀셋과 함께 함정에 수송 그리고 쌍을 만들기 위해 살 - 1 면에 세포에 인접 배치됩니다. 어떤 크기의 셀 그룹의 형성이 기술이 가능해야합니다. "레이저 핀셋 제어 미세 조작은"조사가 세포가 이동을 선택할 수있다는 것을 의미하고, 세포 사이의 원하는 거리는 표준화 수 있습니다. 레이저 빔은 문화 요리의 투명한 표면을 통해 이뤄지 때문에, 세포의 선택과 게재는 동봉된, 무균 환경에서 수행하고 있습니다. 세포 영상 시간 경과에 의해 모니터링하고 필요한 세포 생물 학적 기법과 함께 사용할 수 있습니다. 이 기술은 세포 - 세포 상호 작용의 조사를하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Protocol
문화 고립된 세포를 조작을위한 광학 핀셋
광학 핀셋의 트래핑 세력은 빛의 운동량 (.; Ashkin 외, 1986 Ashkin, 1991)에서 생성됩니다. 이러한 세력 쉽게 정지 세포를 함정에 있지만, 그들은 표면에 부착 세포를 이동할 수 없습니다. 따라서 세포가 갇혀있는 시점에서 문화 요리에 부착을 줄이기 위해, coverslip는 구충제 세포와 폴리 - 2 - hydroxyethylmethacrylate (폴리 - HEMA) (시그마 화학 (주), 세인트 루이스, MO), 독성 화합물로 코팅되어 속성은 이전에 내피 세포 (Folkman과 Moscona, 1978)에 접착 연구에 대한 고용. 폴리 - HEMA의 문화 요리 중 하나가 절반을 다루고 있지만, 다른 반쪽은 세포의 성장을 지원하는 기판과 코팅입니다. 저희 연구실에서는 샐 - 1 culturing의 샐러맨더 망막 세포에 대한 기판으로 사용됩니다. 살 - 1 fabricating 및 폴리 - HEMA 코팅 요리가 아래에 설명하는 절차 :
문화 요리 제작
- 산이 클린 coverglasses (# 1 VWR 과학 주식 회사, 미디어, PA). 이 coverglass은 레이저를 초점에 필요한 높은 수치 조리개 목적에 필요한 단지 0.1mm의 두께의에 대한 선정되었습니다.
- 셀 repellant 영역을 만들려면, 실온에서 하룻밤 95 % 에탄올의 1ml 20 MG 폴리 - HEMA를 (시그마 화학 (주), 세인트 루이스, MO) 디졸브. 가능한 한,이 솔루션은 준비 1 개월 이내에 사용해야합니다.
- 같은 두건으로 먼지없는 환경에서 거의 수직 위치에서 coverglasses을 프로프.
- 200μl micropipette의 플라스틱 팁에서 coverglass 상단의 폴리 - HEMA 솔루션 중 하나 또는 두 방울을 넣으십시오. 방울 (각 50 - 100μl 정도) coverglass의 절반으로 제한해야합니다. 가파른 경사면은 액체가 폴리 - HEMA의 얇은 코팅도를 제공하고, 아래로 coverglass의 표면 아래로 흐르는 보장합니다. 폴리 - HEMA 코팅 coverglasses는 실온에서 30~60분 위해 후드의 건조하도록 허용합니다.
- 가장자리에 가까운 훌륭한 팁 펜으로 coverglass의 폴리 - HEMA 측면을 표시합니다.
- 35mm 문화 접시의 바닥에 1cm의 구멍을 드릴.
- 접착제 폴리 - HEMA 코팅 쪽이 접시의 안쪽 방향으로 얼굴을 너무 Sylgard 184 (다우 코닝 (주), 미들랜드, MI)와 문화 요리의 하단에 폴리 - HEMA 코팅 coverglass. 폴리 - HEMA 코팅의 가장자리를 확인은 구멍의 중심을 실행합니다. 요리 먼지없는 환경에서 실온에서 1-3일 위해 건조하실 수 있습니다.
- 폴리 - HEMA 코팅의 가장자리 아래의 다이아몬드 팁 펜으로 coverglass의 외부에 라인을 스크래치. 그렇다면, 그것 떨어져 약 2mm에 직각에 두 줄을 건너 스크래치. 교차로의 두 지점이 참조 또는 현미경 단계에 문화 접시 같은 방향을 복제에 사용되는 fiducial 포인트 역할을합니다.
- 야간 자외선 아래에서 요리를 소독.
- 망막 세포 점막 (넉넉한 박사 피터 MacLeish, 의학 모어 하우스 학교에 의해 제공에 대해 제기된 마우스 방지 샐러맨더 항체를 포함하는 문화 요리의 휴대 자기편 반 코트 샐 - 1 이외의 폴리 - HEMA 절반을 만들려면 , 아틀란타, GA;. MacLeish 외 (1983)를 참조). 첫째, 외투 약 100μl 0.1의 MG / ML 살균 염소 안티 - 마우스 IgG 항체 (Boehringer 만하임 공사, 인디애나 폴리스)와 살 - 1 면을, 폴리 - HEMA쪽으로을 통해 액체를 누설하지 않도록주의한다. 세 시간 동안 떠나 다음, 그것을 제거합니다. 한 두 번, 다음 접시의 폴리 - HEMA 측면에 액체를 누설하지 돌보는, 100μl 샐 - 1 뜨는 배치 살균 링어의 솔루션과 같은 영역을 씻으십시오. 첫 번째 항체는 살 - 1 알려진 농도에 코팅되어 보장합니다.
- 살 - 1 하룻밤과 요리를 품다.
- 살 - 1 항체 솔루션을 제거하고 멸균 링어의 솔루션으로 영역을 씻어. 전지 도금으로 직전 접시 2 ML 매체를 소개합니다.
수륙 양용 링어의 솔루션, 혈청없는 양용 매체 및 효소 소화에 대한 링어의 솔루션의 구성은 MacLeish와 타운스 - 앤더슨 (1988)과 멘델 외에서 발견됩니다. (1993).
세포 배양의 준비
이 동영상에 사용되는 세포에서 파생되었다 가벼운 적응, 성인, 수중 상 호랑이 도롱뇽은 (Ambystoma tigrinum), 길이 17~22센티미터 측정 (찰스 설리반 주식 회사, 내쉬빌, TN), 5 유지 ° C를에 12 H : 12 H 빛을 어두운주기. 프로토콜은 기관 애니멀 케어 승인 및 국립 보건원의 지침에 따라 엄격 의약과 뉴저지의 치과 대학위원회 (IACUC)를 사용했다. 망막 세포 문화를 준비하기위한 절차 Nachman - Clewner와 타운스 - 앤더슨 (1996)에 의해 설명 다음과 같이 있습니다 :
- 동물을 참살하고 속. 눈을 제거하고 각막과 홍채를 해부하다. 망막은 세안 컵 안에 약간 분리해야합니다. 망막 밑에 곡선 포셉를 배치함으로써, 망막을 특종. 렌즈가이 단계에있는 망막에 연결된 경우 그것은 중요하지 않습니다.
- 40 분 대한 샐러맨더 링어의 솔루션에 14 U / ML papain (워싱턴, 프리 홀드, NJ)에서 망막을 소화.
- 사용하기 전에, papain 링어의 솔루션은 30 분 대한 95% O 5분의 2 %의 CO 2 가스로 부풀어 오른해야합니다. 다음, 0.22 미크론 필터 (Millipore, Carrigtwohill, 아일랜드)를 통해 통과 소독.
- 무균 샐러맨더 링어의 솔루션을 세 번있는 망막을 씻어.
- 링어의 솔루션에서 렌즈를 제거하고 부드럽게 세포 현탁액을 양보하는 피펫을 보어 3mm로 망막 조직을 씹다.
절연 뉴런의 레이저 핀셋 조작
- 무대에 기준점과 함께 접시에 표시를 정렬하여 요리를 orienting, 현미경 단계에 문화 접시를 놓습니다. 컴퓨터에 fiducial 지점의 좌표를 저장합니다.
- 플레이트 살 - 1 모두에 세포와 요리의 폴리 - HEMA 반쪽.
- 세포는 항체 기판에 연결하는 요리의 점착 성의 측면에 전지 오래되는, 약 20 분에 대한 해결하실 수 있습니다.
- 접시의 살 - 1 점착 성의 측면에서 셀을 선택합니다. x와 y 단계의 세포에 가까운 위치의 좌표를 표시합니다. 우리의 경우에는, 요점은 선택된 셀의 기본 dendrites에서 약 10μm했다. 컴퓨터에 좌표를 저장합니다.
- 접시의 폴리 - HEMA 측면에 우리 사건 photoreceptor에 두 번째 신경 세포를, 선택하고 그것을 함정에 레이저 트위터 도구를 사용하십시오. 트래핑은 전력 수준의 넓은 범위에서 얻을 수 있습니다. 그러나, 우리는 10 % 세포와 함께 트래핑 파편을 피하기 위해 충분히 낮은 -20 %에서 레이저의 전원을 설정하지만, 매체를 통해 세포를 전송하기에 충분한.
- 트랩에서 셀을 누른 상태에서 세포가 잘 문화 접시의 표면 위 및 연결된 뉴런 위에 있도록 무대를 낮춥니다. 살 - 1 측면에 이전에 저장한 x와 y 좌표로 세포를 가지고 컴퓨터를 제어에서 단계를 이동합니다. 무대의 움직임은 8 20μm / s의 설정했지만, 최대 속도는 경험적으로 결정하여야한다. 살 - 1 면에 대상 지점에 도착, 접시의 표면에 갇혀있는 셀을 가져 무대를 올립니다. 셀 배치 몇 미크론의 정밀도로 만들 수 있습니다. 세포가 살 - 1 기판을 준수하도록 허용합니다.
- 쌍 형성 전후 쌍의 두 세포의 디지털 이미지를 취득하는 것은 유용한 기록을 제공합니다.
- 인큐베이터에있는 셀 쌍을 유지합니다. 샐러맨더 세포 들어, 10 humidified 챔버에서 요리를 배치 ° C. 세포 영상 시간 경과에 의해 모니터링하고 필요한 세포 생물 학적 기법과 함께 사용할 수 있습니다.
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Discussion
라이트 추진력을 가지고 있으며, 그것이 세포를 통해 전달과 같은 광선이 굴절 때 힘이 추진력의 방향을 변경해야합니다. 때문에 운동량 보존의 법칙의 반대 방향으로 포스가 차례로, 휴대폰으로 다시 반응해야합니다. Ashkin (1991)은 현미경의 목적 렌즈의 초점 레이저 빔을에 의해 생성되는 힘은 초점의 중심 방향으로 셀 이동합니다 것으로 나타났다. 레이저 광선의 힘을 몇 piconewtons를 생성하더라도,이 힘을는 매체를 통해 세포를 해낼 수있다는 것을 충분하다. 제대로 물에 의해 흡수되는 적외선 근처의 파장은 셀 (리우 외 1995)에 손상을 방지하는 데 사용됩니다. 저희 연구실에서 사용되는 레이저 트위터 워크 스테이션은 (셀 로봇 주식 회사, 알버커키 NM) 980nm 파장의 1 승, 지속적인 웨이브 다이오드 레이저를 사용합니다. 레이저 빛은 현미경과 같은 초점 비행기에서 빔을 초점을 맞춘 높은 수치 구경의 40x 기름 침지 계획 neofluor 목표 렌즈 (NA1.3) (칼 자이스 혈구 주식 회사)를 통해 세포로 전송됩니다.
레이저 핀셋 제어의 미세 조작은 무작위로 도금 세포 연구를 통해 장점 번호를 보여줍니다. 예를 들어, 세포는 하나 모든 조작 세포에 대한 표준화 수있는 또 다른에서 원하는 거리에 배치될 수 있습니다. 또한, 레이저 빔을는 문화 접시의 투명한 표면을 통과하고, 따라서 세포 조작은 동봉된, 무균 환경에서 이루어집니다. 레이저에 의해 생성된 아주 작은 세력이 갇혀있을 수에 제한을두고 있습니다. 우리의 경험에 접착과 세포 모양이 성공적으로 트래핑을 제한하는 가장 중요한 요소입니다. 일반적으로, 우리는 직경 10 - 15μm의 절연 세포를 트랩하고 그들에게 그들의 목적지에 문화 접시에 걸쳐 몇 mm의 거리 수송. 이보다 큰 세포를 이동하는 것이 가능하다, 예를 들어, 길이 20 - 40μm이며, 우리 문화에서 가장 큰 세포 아르 뮬러 glial 세포.
세포를 트래핑하면 세포가 문화 요리의 유리 바닥을 서로 준수 도전이기 때문에, 폴리 - HEMA를 사용하여 coverglass에 셀 repellant 표면을 개발하는 것은 조작 세포에 성공 소중한이었다. 그럼에도 불구하고, 폴리 - HEMA 표면에 세포가 결국 이상 1-2시간 오래된 문화의 조작 stickier하고 어렵게되었다. 오래된 문화에서, 우리가 실험실에서 일반적인 연습은 최대 전력 설정을 사용하여 레이저로 세포를 꼬실려고하는 것이었다, 그때 그것을 수송하기 위해 전원을 켜십시오.
작은 물체가 레이저에 갇혀있을 수있는 용이성은 파편이 잘 세포 밖 거리에서 함정에 뽑아 될 수있다는 것을 의미합니다. 이것은 우리의 세포의 트래핑하는 동안 문제가 나타났다. 이것은 트랩 내에 세포를 저장할 수있는 최소 가능성에 대한 레이저의 전원을 거절하여 대부분의 경우에 피할 수 있습니다. 세포가 함정에 운반 수있는 속도는 매체의 점도에 의해 제한됩니다. 우리는 일반적으로 전송을위한 안전한 범위 내에서 것을 알았습니다 80-20 주위 μm의 / 초 속도를 설정합니다.
레이저 트랩에서 열린 세포에 해로운 영향을 가지고있는 가능성을 고려해야합니다. 우리의 망막 문화권에서는, 우리는 레이저 빔을에서 캡처한 때 파괴 색소 세포와 같은 어두운 개체를 발생합니다. 분명, 따라서 이러한 세포가 레이저 핀셋을 사용하여 공부하실 수 없습니다. 클라크 외 2,008 있지만, 망막 뉴런과 우리 연구실에서 수행 photoreceptors에 대한 이전의 연구에서, 우리는 (타운스 - 앤더슨 외 1998 neuritic 성장과 트위터 - 조작 세포 및 비 조작 세포 사이의 연결을 형성 능력에 차이를 찾을 수 없음 ).
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Acknowledgments
연구는 NIH 보조금 EY012031과 EY0182175 및 FM 커비 재단에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR international | 48380 080 | |
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | |
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning | 7078A-5 | |
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning | 430165 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc. | ||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc. | ||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss, Inc. | Numerical aperture (N.A. 1.3) | |
| Black and white CCD camera | Sony Corporation | ||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
