Summary
Questo video descrive la manipolazione di colture di neuroni utilizzando pinzette laser in vitro.
Abstract
In questo articolo e video, si descrive i protocolli utilizzati nel nostro laboratorio per studiare le preferenze di targeting dei processi di rigenerazione delle cellule adulte in vitro i neuroni della retina. Procedure per la preparazione di colture di cellule della retina iniziare con la digestione dissezione, e triturazione della retina, e terminano con la placcatura di isolate cellule della retina sui piatti realizzati appositamente per l'utilizzo con pinzette laser. Questi piatti sono divisi in una metà adesivo cellula e mezzo repellente cellula. Il lato adesivo cella è rivestita con uno strato di Sal-1 anticorpi, che forniscono un substrato su cui le nostre cellule crescono. Altri substrati adesivi potrebbero essere utilizzati per altri tipi di cellule. Il lato repellente cellula è rivestita con un sottile strato di poli-HEMA. Le cellule placcato sulla poli-HEMA lato del piatto sono intrappolati con le pinzette laser, trasportate e poi messo in una cella adiacente sul lato Sal-1 per creare una coppia. Formazione di gruppi di cellule di qualsiasi dimensione dovrebbe essere possibile con questa tecnica. "Laser-pinzette controllato micromanipolazione" significa che il ricercatore può scegliere le celle da spostare, e la distanza desiderata tra le cellule possono essere standardizzati. Poiché il raggio laser passa attraverso superfici trasparenti del piatto cultura, la selezione delle cellule e il posizionamento sono fatte in ambiente chiuso ambiente sterile. Le cellule possono essere monitorati tramite video time-lapse e utilizzato con qualsiasi tecnica cellula biologica richiesti. Questa tecnica può aiutare indagini di interazioni cellula-cellula.
Protocol
Pinzette ottiche per la manipolazione di cellule isolate in coltura
Forze cattura di pinzette ottiche sono generati dalla quantità di moto della luce (Ashkin, 1991;. Ashkin et al, 1986). Anche se queste forze facilmente intrappolare le cellule in sospensione, non sono in grado di spostare le cellule che aderiscono a una superficie. Pertanto, per ridurre l'adesione al piatto cultura nel punto in cui sono intrappolati cellule, il vetrino è rivestito con poli-2-idrossietilmetacrilato (poli-HEMA) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), un composto tossico con cella repellente proprietà precedentemente impiegato per gli studi di adesione sulle cellule endoteliali (Folkman e Moscona, 1978). Mentre poli-HEMA copre la metà del piatto cultura, l'altra metà è rivestita con un substrato in grado di supportare la crescita cellulare. Nel nostro laboratorio, Sal-1 è usato come substrato per la coltura di cellule della retina salamandra. La procedura per la realizzazione di Sal-1 e piatti rivestiti di poli-HEMA è descritto di seguito:
Fabbricazione di piatti della cultura
- Vetrini puliti (# 1 VWR Scientific Inc., Media, PA) in acido. Questo coprioggetti è stato scelto per il suo spessore di appena 0,1 millimetri, necessaria per gli obiettivi ad alta apertura numerica necessaria per mettere a fuoco il laser.
- Per creare una zona repellente cellula, sciogliere 20 mg di poli-HEMA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) in 1 ml di etanolo al 95% durante la notte a temperatura ambiente. Preferibilmente, la soluzione deve essere utilizzato entro 1 mese di preparazione.
- Sostenere il vetrini in una posizione quasi verticale in un ambiente privo di polvere, come un cappuccio.
- Appoggiare una o due gocce di soluzione di poli-HEMA vicino alla parte superiore del coprioggetti dalla punta di plastica di una micropipetta 200μl. Le gocce (circa 50-100μl ciascuno) deve essere limitato alla metà del coprioggetti. La ripida pendenza assicura il liquido scorre lungo la superficie del coprioggetti verso il basso, offrendo anche un sottile strato di poli-HEMA. Lasciare che il vetrini rivestiti di poli-HEMA ad asciugare nel cappuccio per 30-60 minuti a temperatura ambiente.
- Segna il poli-HEMA lato del coprioggetti con una penna a punta fine vicino al bordo.
- Praticare un foro di 1 cm nel fondo di un piatto della cultura 35 mm.
- Incollare il poli-HEMA coprioggetti rivestiti al fondo del piatto con la cultura Sylgard 184 (Dow Corning Co., Midland, MI), in modo che la poli-HEMA lato patinato rivolto verso l'interno del piatto. Assicurarsi che il bordo della poli-HEMA rivestimento corre lungo il centro del foro. Lasciare i piatti ad asciugare per 1-3 giorni a temperatura ambiente in un ambiente privo di polvere.
- Scratch una linea sulla parte esterna del coprioggetti con un diamante punta della penna seguendo il bordo della poli-HEMA rivestimento. Poi, gratta due linee si intersecano ad angolo retto rispetto ad esso di circa due millimetri di distanza. I due punti di intersezione servire come riferimento o punti fiduciali da utilizzare per riprodurre lo stesso orientamento del piatto cultura sul palco microscopio.
- Sterilizzare i piatti sotto la luce ultravioletta durante la notte.
- Per creare una cella-aderente metà del piatto cultura, il cappotto non poli-HEMA metà con Sal-1, che contiene una salamandra anticorpi anti-topo sollevate contro le membrane delle cellule della retina (generosamente forniti da Dr. Peter MacLeish, Scuola di Medicina di Morehouse , Atlanta, GA; vedere MacLeish et al (1983)).. In primo luogo, il cappotto-1 Sal lato con circa 100μl di 0,1 mg / ml sterile capra anti-topo IgG (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis IN), facendo attenzione a non versare il liquido sopra sulla poli-HEMA lato. Lasciate per tre ore, poi rimuoverlo. Lavare l'area stessa con soluzione di Ringer sterile di una o due volte, poi posto 100μl Sal-1 surnatante, facendo attenzione a non versare il liquido nella poli-HEMA lato del piatto. Il primo anticorpo assicura Sal-1 è rivestita in una concentrazione nota.
- Incubare i piatti con la Sal-1 durante la notte.
- Rimuovere la soluzione Sal-1 anticorpo e sciacquare la zona con soluzione di Ringer sterile è. Aggiungere 2 ml di mezzo per il piatto appena prima di placcatura cellulare.
La composizione della soluzione Ringer anfibi, mezzo privo di siero anfibi, e la soluzione di Ringer per la digestione enzimatica si trovano in MacLeish e Townes-Anderson (1988) e Mandell et al. (1993).
Preparazione di colture cellulari
Le cellule utilizzate in questo video sono stati ricavati dalla luce adattati, adulto, acquatico fase tigre salamandre (Ambystoma tigrinum), che misura 17-22 cm di lunghezza (Charles Sullivan Inc., Nashville, TN), mantenuto a 5 ° C su un 12 h: 12 h ciclo luce-buio. I protocolli sono stati approvati dalla cura degli animali e utilizzo Comitato Istituzionale (IACUC) presso l'Università di Medicina e Odontoiatria del New Jersey in stretta conformità con le linee guida del National Institutes of Health. Le procedure per la preparazione di colture di cellule della retina sono descritti da Nachman-Clewner e Townes-Anderson (1996) e sono i seguenti:
- Decapitare midollo e gli animali. Rimuovere gli occhi e sezionare le cornee e iris. La retina deve staccare un po 'dentro l'oculare. Inserendo una pinza curva sotto la retina, scoop le retine. Non è importante se l'obiettivo è collegato alla retina in questa fase.
- Digerire la retina in 14 U / ml di papaina (Worthington, Freehold, New Jersey) in soluzione di Ringer salamandra per 40 minuti.
- Prima dell'uso, la soluzione Ringer papaina dovrebbe essere bollito con% O 95 2 / 5% gas CO 2 per 30 min. E poi sterilizzati con passaggio attraverso un filtro di 0,22 micron (Millipore, Carrigtwohill, Irlanda).
- Sciacquare la retina con una soluzione sterile di Ringer salamandra tre volte.
- Togliere le lenti dalla soluzione del Ringer, poi delicatamente triturare il tessuto retinico con un foro da 3 mm pipetta fino ad ottenere una sospensione cellulare.
Pinzette laser manipolazione dei neuroni isolati
- Porre la capsula cultura sul palco microscopio, orientando il piatto, allineando un segno sul piatto con un punto di riferimento sul palco. Salva le coordinate dei punti fiduciali nel computer.
- Cellule piastra su entrambi i Sal-1 e poli-HEMA metà del piatto.
- Consentire alle cellule di stabilirsi per circa 20 minuti, il che è abbastanza lungo per le cellule dalla parte aderente del piatto di allegare al substrato anticorpi.
- Selezionare una cella sul lato Sal-1 aderenti del piatto. Segna il x e y coordinate fase di una posizione vicina alla cella. Nel nostro caso, il punto è stato di circa 10μm dalla dendriti primarie della cella selezionata. Salva coordinate nel computer.
- Selezionare un neurone secondo, nel nostro caso un fotorecettore, sulla poli-HEMA lato del piatto e utilizzare lo strumento pinzetta laser per intrappolare esso. Cattura può essere raggiunto su una vasta gamma di livelli di potenza. Tuttavia, impostare la potenza del laser al 10% -20%, che è sufficientemente basso per evitare i detriti cattura insieme con il cellulare, ma sufficiente per trasportare il cellulare attraverso il mezzo.
- Mentre si tiene la cellula nella trappola, abbassare il palco in modo che la cellula è ben al di sopra della superficie del piatto di sopra di qualsiasi cultura e neuroni attaccati. Spostare lo stadio sotto il controllo del computer per portare la cella a salvata in precedenza coordinate xey sul lato-1 Sal. Il movimento era pronto a 8-20μm / s, ma la velocità massima dovrebbe essere empiricamente determinato. All'arrivo al punto di destinazione sul lato Sal-1, sollevare sul palco per portare la cellula intrappolati alla superficie del piatto. Posizionamento delle cellule può essere fatto con una precisione di pochi micron. Permettono alla cellula di aderire al substrato-1 Sal.
- Ottenere immagini digitalizzate di entrambe le cellule nella coppia prima e dopo la formazione delle coppie fornisce un record utile.
- Mantenere le coppie di cellule in un incubatore. Per le celle salamandra, posizionare i piatti in una camera umidificata a 10 ° C. Le cellule possono essere monitorate da lasso video in tempo e utilizzato con qualsiasi tecnica cellula biologica richiesti.
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Discussion
La luce ha slancio, e quando un raggio di luce viene rifratta che passa attraverso una cella, è necessaria una forza per cambiare la direzione del momento. A causa della legge di conservazione del momento, una forza nella direzione opposta deve, a sua volta, reagisce di nuovo su una cella. Ashkin (1991) ha mostrato che la forza generata da un fascio laser focalizzato da una lente obiettivo microscopio si muoverà una cella verso il centro della messa a fuoco. Anche se un raggio laser genera solo un paio di piconewtons di forza, questa forza è sufficiente per tirare una cellula attraverso media. Una lunghezza d'onda del vicino infrarosso, che è scarsamente assorbita dall'acqua è usato per evitare di danneggiare il cellulare (Liu et al 1995). Il laser-pinzetta workstation utilizzate nel nostro laboratorio (Cell Robotics Inc., Albuquerque NM) utilizza una W 1, continua laser a diodi onda di 980 nm di lunghezza d'onda. La luce laser viene trasmessa alle cellule attraverso una lente 40x immersione in olio obiettivo piano neofluor di alta apertura numerica (NA1.3) (Carl Zeiss Inc.) che si concentra il fascio sul piano focale stesso come il microscopio.
Pinzette laser controllato micromanipolazione presenta una serie di vantaggi rispetto studi sulle cellule in modo casuale placcato. Per esempio, le cellule possono essere posizionati ad una distanza desiderata da un altro che può essere standardizzato per tutte le cellule manipolate. Inoltre, il raggio laser passa attraverso la superficie trasparente del piatto cultura e, quindi, la manipolazione delle cellule avviene in ambiente chiuso ambiente sterile. Le forze molto piccole generate dal laser pone un limite su ciò che può essere intrappolati. Nella nostra esperienza, l'adesione e la forma delle cellule sono i fattori più importanti che limita cattura di successo. In generale, abbiamo trappola cellule isolate di 10-15μm di diametro e trasportarli distanze di diversi millimetri in tutto il piatto cultura alla loro destinazione. E 'possibile spostare celle più grandi di queste, ad esempio, le cellule gliali Muller, che sono 20-40μm di lunghezza e sono le più grandi cellule nelle nostre culture.
Poiché le cellule cattura è una sfida in cui le cellule aderiscono al fondo di vetro del piatto cultura e gli uni agli altri, sviluppando un cellulare repellente superficie del coprioggetti con poly-HEMA si è rivelata preziosa per il nostro successo a manipolare le cellule. Anche così, le celle del poli-HEMA superficie divenne vischiosi e difficile da manipolare in culture più di 1-2 ore di vita. Nelle vecchie culture, la pratica comune nel nostro laboratorio è stato quello di cercare di raccogliere le cellule con il laser utilizzando l'impostazione di massima potenza, quindi accendere fino a trasportarlo.
La facilità con cui gli oggetti piccoli possono essere intrappolati nel laser significa che i detriti possono essere tirato nella trappola da distanze ben al di fuori della cellula. Questo si è rivelato un problema durante la cattura delle nostre cellule. Ciò può essere evitato nella maggior parte dei casi, abbassando la potenza del laser al minimo possibile in grado di tenere il cellulare all'interno della trappola. La velocità con cui le cellule possono essere trasportati in trappola è limitata dalla viscosità del mezzo. Normalmente impostare la velocità di circa 80-20 micron / secondo che è risultato essere all'interno di un range di sicurezza per il trasporto.
La possibilità che il laser ha effetti negativi sulle cellule tenuto in trappola deve essere considerato. Nelle nostre culture della retina, incontriamo oggetti scuri come le cellule del pigmento, che vengono distrutti quando catturati nel raggio laser. Chiaramente, quindi, queste cellule non possono essere studiate usando pinzette laser. Tuttavia, in precedenti studi sui neuroni della retina e fotorecettori svolto nel nostro laboratorio, abbiamo trovato alcuna differenza nella crescita neuritiche e la capacità di formare connessioni tra le cellule pinzetta-manipolate e le cellule non manipolata (Townes-Anderson et al 1998; Clarke et al 2008 ).
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Acknowledgments
La ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH EY012031 e EY0182175 e la FM Kirby Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25mm circle No.1 coverglass | VWR international | 48380 080 | |
| poly-2-hydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma-Aldrich | P-3932 | Dissolve in 95% ethanol |
| Goat anti-mouse IgG antibody | Chemicon International | AP181 | 1mg in 1ml, dilute 10x for use |
| Sal-1 supernatant containing mouse anti-salamander antibody | generously provided by Dr. Peter MacLeish | Dr. Peter MacLeish, Morehouse School of Medicine, Atlanta, GA | |
| 3 mm bore 5ml pyrex disposable pipets | Corning | 7078A-5 | |
| Cell culture dishes 35mm x 10mm | Corning | 430165 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Optical tweezers-microtool or laser tweezers | Cell Robotics Inc. | ||
| 1 W continuous wave diode laser of 980nm wavelength | Cell Robotics Inc. | ||
| Axiovert 100 inverted light microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| 40x oil immersion plan neofluor objective lens | Carl Zeiss, Inc. | Numerical aperture (N.A. 1.3) | |
| Black and white CCD camera | Sony Corporation | ||
| Computer and joystick with software | Cell Robotics Inc. | for controlling a motorized stage |
References
- Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. Observation of a Single-Beam Gradient Force Optical Trap for Dielectric Particles. Opt. Lett. 11, 288-290 (1986).
- Clarke, R. J., Hoegnason, K., Brimacombe, M., Townes-Anderson, E. Cone and rod cells have different target preferences in vitro as revealed by optical tweezers. Mol. Vision. 14, 706-720 (2008).
- Folkman, J., Moscona, A. Role of cell shape in growth control. Nature. 273, 345-349 (1978).
- Liu, Y., Cheng, D. K., Soneck, G. J., Berns, M. W., Chapman, C. F., Tromberg, B. J. Evidence of localized cell heating induced by infrared optical tweezers. Biophysical Journal. 68, 2137-2144 (1995).
- MacLeish, P. R., Barnstable, C. J., Townes-Anderson, E. Use of a monoclonal antibody as a substrate for mature neurons in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 7014-7018 (1983).
- MacLeish, P. R., Townes-Anderson, E. Growth and synapse formation among major classes of adult salamander retinal neurons in vitro. Neuron. 1, 751-760 (1988).
- Mandell, J. W., MacLeish, P. R. Townes-Anderson E. Process outgrowth and synaptic varicosity formation by adult photoreceptors in vitro. J. Neurosci. 13, 3533-3548 (1993).
- Nachman-Clewner, M., Townes-Anderson, E. Injury-induced remodelling and regeneration of the ribbon presynaptic terminal in vitro. J. Neurocytol. 25, 597-613 (1996).
- Townes-Anderson, E., St Jules, R. S., Sherry, D. M., Lichtenberger, J., Hassanain, M. Micromanipulation of retinal neurons by optical tweezers. Mol. Vis.. 4, (1998).
