Summary
Fondamentaux, propriétés encore unique du système olfactif des rongeurs ont conduit à son étude augmente chez les biologistes. Une évaluation relativement simple de sa fonction est alors également nécessaire. Nous décrivons ici les tests sensibles pour la caractérisation de la sensibilité olfactive et la souris de préférence.
Abstract
Le système olfactif est de rongeurs d'un intérêt croissant pour les scientifiques, ont étudié, en partie, dans la biologie des systèmes en raison de sa stéréotypés, des circuits encore accessibles. En outre, la capacité unique de cette région à générer de nouveaux neurones tout au long vie d'un organisme en fait un système attractif pour les biologistes du développement et de régénération semblables. Ces intérêts nécessite des moyens pour une évaluation rapide, et fiable de la fonction olfactive. De nombreux tests de la capacité olfactive est complexe, variable ou non spécifiquement conçus pour les souris. En outre, certains tests sont sensibles aux déficits de la mémoire ainsi que des défauts dans les capacités olfactives, confondant les résultats obtenus.
Ici, nous décrivons une simple pile de tests conçus pour identifier les défauts de la sensibilité olfactive et la préférence. Tout d'abord, une évaluation de la santé générale initiale permet l'identification des animaux appropriés pour des tests supplémentaires. Deuxièmement, les souris sont exposées à différentes dilutions de parfums pour vérifier si il ya une différence de seuil. Troisièmement, les souris sont présentés avec des parfums différents, à la fois attrayant et aversifs, qui permettent l'évaluation de la préférence olfactive. Ces études devraient faire simple, la caractérisation initiale du comportement olfactif accessibles pour les laboratoires des ressources et des compétences diversifiées.
Protocol
Examen médical général
Un traitement plus complet des examens de santé général peuvent être trouvées dans Jacqueline Crawley ressources phénotypage excellente comportement, quel mal avec ma souris? 1. Nous utilisons d'abord une batterie de tests modifiés d'observation pour évaluer la santé générale du sujet. La batterie comprend des éléments de Samuel Irwin protocole d'évaluation complète de 2 à identifier rapidement les sujets qui seront inappropriés pour des tests supplémentaires. En bref, la batterie modifiés identifie les animaux qui sont physiquement anormale (par exemple, fortement sous-ou sur-poids, mal entretenues, dyspnéique) ou qui présentent une posture anormale, la locomotion ou de comportements. Ces manifestations pourraient toutes être de la maladie. Toute évaluation initiale qui identifie pareillement sujets malsains est approprié.
Il est également important de noter que les animaux sont utilisés à la fois humainement pendant l'examen de santé général ainsi que lors des essais ultérieurs. Aucune anesthésie ou analgésie est utilisée comme ces tests ne tiennent pas compte des procédures potentiellement douloureuses.
Test sensibilité olfactive
Ce test est conçu pour détecter une différence de sensibilité olfactive entre deux groupes de souris (par exemple un type sauvage et un groupe de mutants d'animaux). Dans ce test, les dilutions multiples d'un parfum sont faites. Un animal naïf examine ensuite une dilution unique de ce parfum et le temps total d'exploration (dans les 3 minutes) est enregistrée. Dilutions multiples du parfum sont testés sur différents sujets naïfs et le temps total d'exploration est utilisé pour générer des courbes dose-réponse pour chaque groupe de souris. Deux chercheurs devraient être impliqués dans les tests, avec un aveugle à des génotypes sujet et / ou condition.
Chercheur principal
- Obtenir quatre cages propres (8 H x 10 W x 18 L, en pouces), le tout sans literie. Alignez les quatre cages dans l'enceinte de biosécurité.
- Mettre en place des cloisons entre chaque scène en utilisant un papier filtre opaque. Placez une affiche noire à travers la partition finale tels que les lignes de côté en noir sur le côté et en bas de la cage. Couvrez le dessus de l'arène avec un morceau de plexiglas clair pour permettre à la lumière pour éclairer la scène.
(A)
(B) 
Figure 1. Arena Set-Up. (A) convenablement habillé, arène vide (b) Arena avec un papier filtre sujet et parfumée. - Commencez habituer les sujets. Placez le premier sujet dans la première cage d'accoutumance. Après 15 minutes, passer le premier sujet à la deuxième cage. Nettoyez la cage d'abord avec la tuberculose Quatricide. Ensuite, placer le sujet dans la première seconde, la cage nettoyée. Continuez ce processus avec les sujets suivants. En définitive, chaque sujet doit être habitués dans les trois cages avant d'être placés dans l'arène (cage quatrième et dernier) pour un autre 15 minutes d'accoutumance avant les essais.
(B) 
Chercheur aveugles
- Faire un nombre approprié de 2 pouces par 2 pouces carrés de papier filtre pour les échantillons de parfum.
- En utilisant le parfum de pré-sélectionnées, de manière appropriée de le diluer. Pour les échantillons hydrophobes tels que le beurre d'arachide, utiliser le pétrole comme solvant; pour tous les autres, l'utilisation de l'eau distillée. Vortex.
- Régler un dispositif d'enregistrement vidéo numérique à l'extrémité de l'enceinte de sécurité biologique tels que la fin cage entière est au point. Prenez une vidéo préliminaires pour s'assurer paramètres sont adéquats.
- Enregistrement de l'ordre dans lequel les dilutions seront testés, en prenant soin de randomiser l'ordre des essais.
- L'objet Record litière et les numéros d'identification.
- Une fois que le sujet a été habituée pendant 15 minutes dans l'arène, commencer la préparation pour le premier essai. Pipeter la première dilution de haut en bas dans le tube conique avant pipetage sur un carré de papier filtre. La surface du papier filtre doit être couvert de façon optimale ~ 85% (environ 0,50 ml de solution). Utilisez un Kimwipe pour s'assurer que le papier filtre n'est pas trop saturé.
- Commencez l'enregistrement vidéo.
- Placer le carré de papier filtre dans la cage à l'extrémité opposée de la position actuelle de l'animal.
- Commencer à chronométrer.
- Après 3 minutes, arrêter l'enregistrement et retirer le parfum diluée.
- Si un seul parfum (ex: cannelle) doit être testé, retirer le sujet premier test de l'arène. Répétez les étapes 6-11 pour chaque animal, de façon appropriée diluer le parfum pour chaque sujet. Si plus d'un parfum est d'être testé, cependant, ne retirez pas le sujet du test de l'arène. Au lieu de cela, débuter le chronométrage.
- Appropriée diluer le parfum de la prochaine utilisant les mêmes méthodes que ci-dessus.
- Après 1 minute, commencer l'enregistrement vidéo. Placer le carré de papier filtre avec la dilution du parfum suivante dans la cage à l'extrémité opposée de la Positio actuelle de l'animaln.
- Répétez les étapes 6-13 pour chaque parfum, en notant le nombre de fichiers vidéo pour chaque essai.
- Répétez les étapes 6-14 pour chaque sujet.
Figure 2. Les résultats représentatifs pour une session de tests de sensibilité olfactive. Chaque souris soit du groupe contrôle (groupe A) ou le groupe expérimental (groupe B) a été exposé à l'une des cinq différentes dilutions de l'extrait de cannelle sur un papier filtre pour un, trois sessions minute. Le temps total passé à explorer le papier filtre a été évaluée. Souris dans le groupe A ont une plus grande sensibilité olfactive que ceux dans le groupe B.
Test préférence olfactive
Ce test est conçu pour identifier les lacunes de détection spécifique, à savoir la capacité de sentir les parfums attrayant ou aversif. La procédure suivante s'inspire largement du protocole de Kobayakawa, K., et al.3. Encore une fois, deux chercheurs devraient être impliqués dans les tests, avec un aveugle à des génotypes sujet et / ou condition. Le temps total d'exploration est de nouveau enregistré (à la vue vidéo) pour des parfums différents. Ceux parfums avec un total de fois plus grande que l'eau exploratoires sont désignés comme "attractifs", tandis que ceux avec des temps de moins que l'eau sont appelées «aversif». Le chercheur se demande ensuite si les senteurs mêmes sont «attractifs» ou «aversion» pour des sujets de test différents.
S'il vous plaît suivez les étapes 1-3 dans la section Test sensibilité olfactive pour le chercheur principal.
Chercheur aveugles
La procédure de tests olfactifs préférences est la même, avec de légères modifications des étapes 2 et 4. S'il vous plaît suivez les étapes 1 à 15 dans la section Test sensibilité olfactive pour le chercheur aveugle, avec les modifications suivantes: Pour l'étape 2, en utilisant les senteurs pré-sélectionnés (une combinaison de senteurs à la fois attrayant et aversif), rendre les solutions diluée de façon appropriée de chacun dans tubes coniques. Pour les échantillons hydrophobes tels que le beurre d'arachide, utiliser le pétrole comme solvant; pour tous les autres, l'utilisation de l'eau distillée. Vortex. Pour l'étape 4, plutôt que l'enregistrement de la dilution à tester, d'enregistrer l'ordre des senteurs variées qui seront testés, aléatoire l'ordre des essais.
Ce test est conçu pour identifier les lacunes de détection spécifique, à savoir la capacité de sentir les parfums attrayant ou aversif. La procédure suivante s'inspire largement du protocole de Kobayakawa, K. et al. 3. Encore une fois, deux chercheurs devraient être impliqués dans les tests, avec un aveugle à des génotypes sujet et / ou condition. Le temps total d'exploration est de nouveau enregistré (à la vue vidéo) pour des parfums différents. Ceux parfums avec un total de fois plus grande que l'eau exploratoires sont désignés comme "attractifs", tandis que ceux avec des temps de moins que l'eau sont appelées «aversif». Le chercheur se demande ensuite si les senteurs mêmes sont «attractifs» ou «aversion» pour des sujets de test différents.
S'il vous plaît suivez les étapes 1-3 dans la section Test sensibilité olfactive pour le chercheur principal.
Chercheur aveugles
La procédure de tests olfactifs préférences est la même, avec de légères modifications des étapes 2, 4 et 13. S'il vous plaît suivez les étapes 1 à 15 dans la section Test sensibilité olfactive pour le chercheur aveugle, avec les modifications suivantes: Pour l'étape 2, en utilisant les senteurs pré-sélectionnés (une combinaison de senteurs à la fois attrayant et aversif), rendre les solutions diluée de façon appropriée de chacun dans tubes coniques. Pour les échantillons hydrophobes tels que le beurre d'arachide, utiliser le pétrole comme solvant; pour tous les autres, l'utilisation de l'eau distillée. Vortex. Pour l'étape 4, plutôt que l'enregistrement de la dilution à tester, d'enregistrer l'ordre des senteurs variées qui seront testés, la randomisation de l'ordre dans chaque essai. Pour l'étape 13, place du carré de papier filtre avec le parfum suivant dans la cage à l'extrémité opposée de la position actuelle de l'animal.
Figure 3. Les résultats représentatifs pour une session de tests de préférences olfactives. Chaque souris a été exposé à chacune des différentes senteurs sur papier filtre pour un, trois sessions minute. Le temps total passé à explorer le papier filtre a été évaluée. Le beurre d'arachide et la vanille sont attrayants parfums (parfum du temps exploratoires> l'eau le temps d'exploration) et 2-méthylbutyrique est aversif (parfum du temps exploratoires <l'eau de temps exploratoire).
Notation des tests olfactifs
Après l'acquisition de toutes les sensibilité olfactive et vidéos préférence, il est nécessaire d'analyser le temps total passé à explorer chaque dilution / parfum. Avez-aveugle, le chercheur d'analyser l'ensemble des vidéos pour la cohérence.
- Aperçu de la video, notant les points suivants: a) lorsque le papier filtre est placé dans l'arène, b) lorsque la souris s'approche du papier filtre, c) lorsque la souris enquête sur le papier filtre et d) lorsque trois minutes sont écoulées (à partir lorsque le filtre document a été placé dans l'arène). Savoir quand se concentrer sur le comportement de la souris, il est plus facile de précision le score du temps total passé à explorer après examen.
- Revue de la vidéo. Noter le temps quand la souris étudie d'abord le papier filtre (latence).
- L'utilisation d'un chronomètre, le temps de toutes les enquêtes dans les trois minutes de placer le papier filtre dans l'arène. Le moment de l'enquête est défini comme n'importe quel moment lors des narines de la souris sont <1 mm du papier filtre. Il est important de ne pas inclure tout le temps lorsque la souris est à proximité du papier filtre, mais il n'est pas activement d'instruction. Ne pas inclure les épisodes de la mastication et de lécher le papier ou des épisodes de s'asseoir sur le papier dans le temps total d'exploration. Il est nécessaire d'adhérer étroitement et régulièrement à ces règles afin d'analyser précisément le comportement olfactif.
- Temps de latence d'enregistrement, le temps total consacré aux enquêtes du papier filtre et le numéro de fichier vidéo.
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Discussion
Les tests susmentionnés permettre l'évaluation rapide et fiable de la fonction olfactive de base. Il n'est pas à négliger, toutefois, que cette fiabilité exige la sélection et la préparation des sujets pour les essais. Les animaux qui sont malades ou incapables sont souvent des sujets de test incompatibles. En outre, l'habituation des sujets du test est la clé. Nous avons constaté que l'utilisation de cages multiples au cours du processus d'habituation permet aux animaux de se familiariser avec la manipulation et l'expérimentateur environnements changeants. Nous avons également constaté que les temps plus courts que ceux indiqués pour l'accoutumance ne sont pas suffisantes pour réduire l'anxiété. Soucieux également des animaux sont souvent des sujets de test imprévisibles et peuvent masquer des différences vrai.
Dans le test réel de la souris, il est important non seulement pour être cohérent lors de l'acquisition de données, mais aussi en analysant le comportement des sujets. Nous avons trouvé utile de ne compter que ce moment où le nez du sujet de test est <1 mm du papier filtre dans le cadre du temps total d'exploration. En outre, les comportements comme mordre ou de mâcher du papier filtre ne sont pas inclus dans le temps total d'exploration. En outre, les temps de latence (pour des parfums attrayants) peut également être une mesure utile. Différents milieux souris peut exiger différentes dilutions de senteurs pour la discrimination efficace entre un témoin et le groupe expérimental. Il est également important de sexe et d'âge correspond-match paires. Nous avons trouvé utile de tirer empiriquement dilutions parfum approprié (sur des sujets similaires au groupe de contrôle) avant de procéder à des tests expérimentaux de souris naïves. Enfin, ces tests ont été choisis afin de minimiser l'effet de toute autre déficience cognitive, notamment, des défauts dans l'apprentissage et / ou de mémoire. À cette fin, il est essentiel d'utiliser des souris naïves pour les tests.
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Acknowledgments
Financement: Ce travail a été soutenu par un QG Stuart & Victoria Quan Bourse prédoctorale (RVM), NIH Pioneer Award (RAS)
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Methylbutyric acid | Reagent | Sigma-Aldrich | W269506 | Concentrations Used:9.16 x 10-1 – 10-8 M (in H20) |
| Pure Vanilla Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy) | Reagent | Unilever | n/a | Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil |
| Cinnamon Extract | Reagent | McCormick & Co. | n/a | Concentrations Used:10-1 – 10-5 dilution (in H20) |
| Mineral Oil, light | Reagent | Fisher Scientific | O121-1 | Concentrations Used:N/A |
References
- Crawley, J. N. What’s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice. , John Wiley and Sons. 42-60 (2007).
- Irwin, S. Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse. Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).
- Kobayakawa, K. Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb. Nature. 450, 503-508 (2007).
