Collecte de sang du crabe américaine Horseshoe, Limulus Polyphemus

Summary

Le crabe fer à cheval, américains, Limulus polyphemus, est sans doute la source la plus commode pour les grandes quantités de sang de tous les invertébrés. Le sang est simple dans sa composition, avec un seul type cellulaire dans la circulation générale, le Amébocytes granulaire, et seulement trois protéines abondantes dans le plasma, l'hémocyanine, les protéines C-réactive, et α2-macroglobuline. Le sang est recueilli par le cœur et les cellules du sang et le plasma sont séparées par centrifugation.

Abstract

La limule a le meilleur système caractérisé immunitaire de tout invertébré de longue durée. L'étude de l'immunité dans les limules a été facilitée par la facilité dans la collecte de grandes quantités de sang et de la simplicité du sang. Les limules afficher uniquement un seul type cellulaire dans la circulation générale, le Amébocytes granulaire. Le plasma a la teneur en sel de l'eau de mer et à seulement trois protéines abondantes, l'hémocyanine, la protéine respiratoires, les protéines C-réactive, qui fonctionnent dans la destruction cytolytique des cellules étrangères, y compris les cellules bactériennes, et α2-macroglobuline, qui inhibe les protéases des agents pathogènes envahisseurs. Le sang est recueilli par ponction cardiaque directe dans des conditions qui minimisent la contamination par le lipopolysaccharide (aka, endotoxines, LPS), un produit de la bactérie à Gram négatif. Un grand animal peut produire de 200 à 400 ml de sang. Pour l'étude du plasma, les globules sont immédiatement retirés du plasma par centrifugation, le plasma peut ensuite être fractionné en ses protéines constituantes. Les cellules sanguines sont idéalement étudiés au microscope par la collecte de petites quantités de sang dans le LPS sans solution saline isotonique (0,5 M de NaCl) dans des conditions qui permettent l'examen microscopique direct en plaçant l'un des plus LPS sans coverglasses sur la surface du plat de la culture, puis monter les coverglasses dans des chambres simple observation suivante fixation des cellules. Une deuxième préparation pour l'observation directe est de collecter 3 - 5 mL de sang dans un plat embryon LPS-libre et puis explantation des fragments de amebocytes agrégées pour une chambre qui sandwichs le tissu entre une lame et une lamelle. Dans cette préparation, le amebocytes mobiles migrent vers la surface lamelle, où ils peuvent être facilement observés. Le système de la coagulation du sang implique l'agrégation des amebocytes et la formation d'un caillot extracellulaire d'une protéine, coagulin, qui est libéré par les granules de sécrétion des cellules du sang. L'analyse biochimique des cellules sanguines lavées exige que l'agrégation et la dégranulation ne se produit pas, ce qui peut être accompli par la collecte de sang dans 0,1 volumes de 2% de Tween-20, 0,5 M de NaCl LPS-libres, suivi par centrifugation des cellules et de lavage avec 0,5 M NaCl.

Protocol

Caractéristiques anatomiques de la limule pertinents à une hémorragie (Fig. 1)

Figure 1

1. Les trois principales divisions du corps, d'avant en arrière, sont les prosoma (P), le opisthosome (O), et le telson (T) ^1.
2. Les marges antérieures et latérales libres de la prosoma est la bride.
3. L'indentation plus postérieur de l'opisthosome, où le telson articule, c'est la baie de terminal.
4. La commune où le prosoma et le opisthosome articulé est la charnière (H).
5. Le cœur est situé le long de la ligne médiane dorsale, juste en dessous de la carapace de prostoma et opisthosome ² (Fig. 2).
   
   
   
   
   Figure 2
   
   

Considérations générales, la stérilité et la protection contre l'exposition aux lipopolysaccharides (endotoxines)

1. L'ennemi majeur de la purge réussie est l'agglutination cellulaire, l'exocytose, et la formation du caillot coagulin. L'agrégation cellulaire et l'exocytose sont stimulés par le lipopolysaccharide (aka, endotoxines, LPS), un produit de la bactérie à Gram négatif. Le seuil de concentration de LPS pour l'exocytose des cellules lavées est de 0,1 - 1 mg / mL, mais les cellules en suspension dans le plasma sont activés par des concentrations nettement inférieures ^3. Endotoxines n'est pas inactivée par autoclavage simple et peut être supposé d'être présent sur les surfaces et dans les solutions et les réactifs qui ne sont pas certifiés pour être exemptes d'endotoxines.
2. Afin de réduire les chances de coagulation lors de la collecte de sang, de ne sélectionner que parfaite, les animaux intacts pour les saignements. Pré-refroidir l'animal 1-2 h dans la salle de 4 ° C. Pratique technique stérile. Éviter la contamination avec l'endotoxine.
3. LPS solution saline sans 3% est utilisée en médecine clinique et peuvent être achetés auprès de fournisseurs médicaux (voir le tableau de réactifs et de fournitures spécialisées). LPS peut être retiré de la verrerie et des métaux par incubation à 180 ° C pendant 4 heures. Stérile aiguilles de seringues à usage unique, des boîtes de culture de Petri de style, et des tubes à centrifuger à bouchon à vis sont toutes LPS gratuit et peut être utilisé sans modification tant que la bonne technique stérile est pratiquée.
4. La stabilité des cellules de sang de différents animaux diffère, avec les cellules de certains animaux individu subissant dégranulation spontanée, résultant en la formation du caillot coagulin, même lorsque l'animal est saigné avec le plus grand soin. Les cellules du sang des limules autre individu sont beaucoup plus stables et, quand les procédures appropriées sont suivies, demeurent pleinement granulaires lors de la saignée et la séparation des cellules du plasma.
5. Plusieurs agents ont été signalés à stabiliser les cellules sanguines suivantes saignement, y compris la caféine (0,25 saigner dans des volumes de 10 mM de caféine dans le LPS-libres 3% de NaCl) ^4, le propranolol (1 mM de concentration finale) ^{5, 6} diméthylsulfoxyde, la chélation des cations divalents ( saigner dans un volume égal de 0,1 M dextrose, citrate de sodium 0,03 M, 0,026 M d'acide citrique, 10 mM d'acide éthylène diamine disodique (Na ₂ EDTA), pH 4,6) ^7, les inhibiteurs de la protéine G et la phospholipase C-voies (le choléra et la toxines pertussus, U73122) ^8, la substitution du chlorure avec l'anion iséthionate ^9, les bloqueurs des canaux chlorure de ^9, AMP cyclique antagonistes ^9, réactifs sulfhydryle (5 mM de N-éthyl maléimide, NEM) ^5, et la membrane-actif détergent Tween-20 ( saigner dans un volume de 0,1 à 2% de Tween-20 dans le LPS sans NaCl 0,5 M).

Fournitures et des réactifs pour des saignements de la limule: collection de grands volumes de sang

1. un ou plusieurs grands, crabe fer à cheval, en bon état
2. une bouteille contenant de l'éthanol à 70%
3. Kimwipes
4. Aiguille de calibre 14
5. Pince robuste
6. seau à glace avec de la glace
7. 50 ml à bouchon à vis des tubes en plastique jetables centrifugeuse
8. rack pour tenir le tubes de 50 ml
9. comptoir centrifugeuse
10. stérile de 50 ml Pipettes sérologiques
11. Poire ampoule de type
12. jetables appareil de filtre stérile
13. pompe à vide
14. LPS sans solution à 3% de NaCl (pour la collecte de cellules sanguines)
15. Tween-20 (pour la collecte de cellules sanguines)

Les préparatifs pour le grand volume des saignements

1. Pour des saignements, utilisation à grande, les animaux intacts. Refroidissement de l'animal pendant 1 h dans une chambre froide avant la saignée.
2. Établir un arrangement à l'aise avec un support stable pour une seau à glace qui est d'environ 0,3 mètres de haut (le conteneur d'expédition jetables de polystyrène pour l'envoi de réactifs froids ou congelés est approprié) et une chaise basse pour l'opérateur. Le seau à glace est placé sur la structure d'appui et de la chaise est tiréeà cette unité. Vous devriez être assis confortablement pendant une longue période dans la chaise avec vos coudes sur vos cuisses, et avec la main gauche tenant un crabe fer à cheval, luttant positionné au-dessus des tubes de prélèvement sanguin calé en position verticale dans un lit de glace dans le seau à glace.
3. Pré-froid 4 - 6 sur les 50 ml microtubes jetables en plastique avec des fermetures à vis dans le bain de glace. Les tubes sont mis en position verticale dans la glace variait autour du périmètre du conteneur bain de glace. Juste avant de commencer l'opération de purge, enlever les bouchons des tubes et des bouchons place sur la table adjacente, en adhérant à une technique stérile.
4. Retirez le bouchon d'une aiguille de calibre 14 et d'utiliser les pinces robustes pour desserrer l'aiguille dans sa manche, mais ne retirez pas l'aiguille de la manche. Maintenir la stérilité. NE PAS TOUCHER UNE PARTIE DE L'AIGUILLE avec les doigts. Placez manches avec une aiguille sur un compteur à côté avec la crosse exposée de l'aiguille élevés du contact avec une surface de maintenir sa stérilité.
5. Imbibez un Kimwipe avec de l'éthanol à 70%.

Saignement de l'animal (en particulier pour l'opérateur droitier)

1. Tenir l'animal pour saignement: animaux saisir dans la main gauche avec les quatre doigts en contact avec la bride antérieure de la prosoma et le pouce saisissant la partie postérieure de la opisthosma à la base de la queue (la baie du terminal). La surface ventrale de l'animal face à la paume de votre main. Le telson se trouve le long de la base du pouce et des projets sur le poignet. Flex l'animal en douceur afin que les prosoma et opisthosome sont à angle droit les uns aux autres (figure 3a).
   
   
   
   Figure 3
   
   
2. Nettoyer la charnière exposés conjoints prosoma connexion et opisthosome avec de l'éthanol à 70% appliquée avec un mélange éthanol-humidifiées Kimwipe (figure 3B).
3. Tournez la main gauche de telle sorte que les doigts de 2 à 4 sont plus élevées et la surface dorsale de l'animal vers le haut. Avec la main droite, insérer l'aiguille de seringue 14 ga, toujours dans son étui de protection, entre les doigts 2 et 3 de la main gauche. Prenez la pince dans la main droite et retirer l'aiguille de sa gaine de protection en saisissant la crosse avec la pince (figure 3C). Tournez la main gauche afin que la surface dorsale de la main face à votre gauche, le pouce et l'index sont en hausse, et l'animal est à l'envers, avec sa surface dorsale face à la main droite. Placez le bout de l'aiguille au-dessus du premier des 50 tubes de prélèvement ml et d'orienter l'animal afin que l'extrémité pointue de l'aiguille est pointée à la charnière d'articulation et ainsi que la tige de l'aiguille est parallèle à la ligne médiane dorsale (figure 3d). Insérez l'extrémité pointue de l'aiguille à travers la charnière dans la lumière du cœur, en gardant l'aiguille positionnée parallèlement à la ligne médiane dorsale et insérée à la ligne médiane et avec la crosse de l'aiguille reste positionné au-dessus de l'ouverture du tube collecteur. L'aiguille est insérée environ 1 - 2 cm de profondeur dans la partie du cœur dans le prosoma. Dès que le cœur est crevé, le sang va couler rapidement (figure 4a, la flèche), il est donc important de s'assurer que la fin de livraison de l'aiguille de la seringue est positionnée sur la bouche du tube de prélèvement pour recueillir cette première montée de sang.
4. Le sang du cœur vers d'abord dans un flux continu qui, après environ 30 - 50 ml de sang ont été collectés, seront lents à gouttes individuelles (figure 4b). Pour améliorer la circulation sanguine, il peut être de bonne politique de réorienter la pointe de l'aiguille légèrement. Inclinez l'aiguille haut ou le bas, à gauche ou à droite; glisser son extrémité profondément dans le cœur ou le retirer au plus près de la charnière d'articulation à trouver la position qui optimise le flux sanguin. Ne pas compresser l'animal de manière excessive, car cela risque de nuire à l'animal et peut entraîner le sang extravasé pour initier la coagulation.
   
   
   
   Figure 4
   
   
5. Comme chaque tube de prélèvement se remplit de sang, tournez le bain de glace pour amener le tube vide suivante sous l'extrémité de livraison de l'aiguille.
6. Comme saignement diminue, vous courez le risque d'avoir des flux d'air dans un sens rétrograde dans l'aiguille et dans le coeur. Cela peut se produire lorsque l'animal se redresse, ce qui réduit la pression sanguine. Essayez d'éviter cela en maintenant l'animal dans la position fléchie ou en permettant le redressement de se produire que lentement.
7. Lorsque l'animal s'arrête à donner du sang, retirez l'aiguille des saignements de cœur. Re-bouchon de la collecte des tubes et centrifuger immédiatement dans la centrifugeuse de table, 1000 rpm, 5 min. Les cellules du sang se former des boulettes compactes au fond des tubes de prélèvement. Parce que toutes les composantes de la coagulation sanguine sont contenues dans des vésicules de sécrétion des cellules du sang, dès que le plasma est séparé des cellules,le risque de coagulation du plasma est éliminé.
8. Il est impératif d'éviter la coagulation du sang extravasé. Les mesures suivantes réduisent le risque de coagulation: Pré-refroidissement de l'animal et le maintien des tubes de collecte dans un bain de glace; manipulation douce de l'animal, la réduction de la rapidité avec laquelle le sang s'écoule de l'aiguille de la seringue; centrifugation du sang immédiatement après la collecte, l'évitement de la contamination des aiguilles et des tubes de prélèvement avec l'endotoxine, le maintien de la procédure stérile. Comme mentionné ci-dessus, certains animaux ont des cellules sanguines particulièrement irritable qui initient l'exocytose, même si ces précautions sont respectées.
9. Après centrifugation, inspecter les tubes des signes de coagulation du sang - brins de cellules et le matériel caillot gélatineux fixées aux parois du tube, une matière gélatineuse au sommet du caillot, ou, pire, de grandes quantités de caillot avec des cellules sanguines piégé dans le colonne de fluide (figure 4c, la flèche). Le matériau de ces tubes est le sérum, le plasma n'est pas, et qui contient les produits sécrétés des cellules du sang.
10. Transférer le plasma dans des tubes stériles avec les 50 ml pipettes sérologiques stériles. Soyez prudent lors du pipetage pour éviter toute aspiration des cellules à partir du culot cellulaire dans le fond du tube. Il est préférable de laisser quelques mL de plasma au-dessus du culot pour éviter de perturber le culot cellulaire.
11. La procédure décrite ci-dessus est conçu pour recueillir de grandes quantités de plasma contaminé par les produits de sécrétion des cellules du sang. Pour collecter de grandes quantités de globules lavés, recueillir le sang dans 0,1 volumes de 2% de Tween-20 dissous dans 3% LPS sans solution de NaCl. Centrifuger les cellules doucement pendant 10 minutes pour établir une cellule de perdre une boulette, puis laver les cellules avec plusieurs changements de LPS-libres 3% de NaCl. Un extrait des cellules qui contient les produits de sécrétion des cellules de sang peuvent être préparés par la lyse des cellules lavées dans LPS sans eau distillée. Ce lysat contient un large éventail de protéines et de peptides qui opèrent dans la lutte anti-microbien de défense immunitaire ^10,11 et contient également coagulogen, la forme zymogène de la protéine de structure du caillot de sang extracellulaire, et la collecte des protéases qui convertissent coagulogen d'coagulin, la forme de la protéine qui se polymérise en fibrilles de ¹² caillot. Cet extrait est similaire au produit disponible dans le commerce, Limulus Amébocytes lysat ou LAL, qui est utilisé pour doser la présence de lipopolysaccharide ^13. La cascade de la protéase responsable de la modification protéolytique de coagulogen d'coagulin est activé par le LPS ^14.
12. Disposition des animaux après la saignée. Saignement menée par les méthodes mentionnées ci-dessus est bien toléré par l'animal. Lorsque l'on travaille au Laboratoire de biologie marine de Woods Hole, je reviens d'animaux de l'océan après la saignée avec l'espoir qu'ils vont survivre. Si les animaux sont maintenus dans des aquariums éloigné de la fourchette normale de limules, ils peuvent être saigné à plusieurs reprises une ou deux fois par mois. Comme il est décrit ci-dessous, les animaux maintenus en captivité ont besoin d'eau de haute qualité et alimentation fréquente pour maintenir leur santé. L'euthanasie peut être accompli par la destruction du ganglion dorsal, qui est situé dans la ligne médiane dorsale entre les yeux.

Traitement et le stockage du plasma

1. Protection contre les protéases. Si le plasma est utilisé pour la purification de protéines, elle devrait être traitée avec des inhibiteurs de protéase immédiatement après le prélèvement. Ajouter phénylméthylsulfonyle (PMSF) à une concentration finale de 1 mM. PMSF est gardé comme une solution à 0,1 M d'actions dans le DMSO ou l'éthanol. Il est assez instable dans l'eau ^15, ne peuvent donc pas être invoqué pour une protection durable, mais plus immédiatement après la séparation du plasma des globules inactivent les petites quantités de protéases qui pourraient avoir été libérés par les cellules.
2. Filtration stérile: stériliser le plasma par ultrafiltration sous vide en utilisant un moyen de filtration jetables dispositif muni d'un filtre à pores de 0,22 mm. Ces filtres ont tendance à se boucher. Il est conseillé de centrifuger le plasma avant le filtrage pour réduire ce problème. Si de grandes quantités de plasma sont transformés, il est conseillé de pré-filtre le premier plasma en utilisant un filtre Millipore avec une taille de pores de 1 mm, puis avec un 0,45 mm taille des pores du filtre Millipore.
3. Le plasma peut être protégée de la contamination bactérienne soit en ajoutant NaN ₃ à une concentration finale de 0,2 mg / ml ou par filtration stérile. Non stériles de plasma ne doivent jamais être stockées pour des périodes de plus de 2 jours sans l'un ou l'autre de ces mesures anti-bactérien prises.
4. La coagulation du sang. Contrairement au système de la coagulation chez les mammifères, le plasma contient Limulus aucun des éléments de la coagulation sanguine. Au lieu de cela, toute la machinerie pour la formation de caillots, la protéine structurale du caillot (coagulogen) et le système de protéases qui coaguloge processus den pour le rendre capable de polymériser dans le caillot insoluble, se trouve dans les granules de sécrétion des ¹⁶ cellules du sang. Donc, si les cellules du sang sont éliminés avant qu'ils n'aient une chance de se soumettre à l'exocytose, le plasma est entièrement libre des protéines de la coagulation et restera fluide indéfiniment.
5. Purification des protéines. Hemocyanin est présent à 40 mg / ml dans le plasma et est un 48-mer d'une sous-unité de 70 kDa. Elle peut être isolée par ultracentrifugation (40 000 X g, 8 h) ou filtration sur gel avec une résine d'exclusion des pores de grande taille tels que BioGel A5m ^17. Les protéines C-réactives sont présents au 1 - 5 mg / mL et peut être isolée par l'isolement d'affinité sur Sépharose-phosphorylethanolamine, avec élution avec un chélateur de calcium ^18. L'inhibiteur de protéase à large spectre, un _{2-macroglogulin,} a été purifié par filtration sur gel Sephacryl S-300 résine après hémocyanine et les protéines C-réactives ont été retirés ^19.

L'examen microscopique des cellules du sang mobiles dans la culture

1. Création de pelouses Amébocytes in vitro: LPS sans solution à 3% de NaCl est ajouté à la culture en plastique stérile plats de Pétri de style (1 ml pour un plat de 35 mm, 2,5 ml pour une boîte de 60 mm, 6 ml pour un plat 90 ml). Le sang est ensuite obtenu par ponction cardiaque en utilisant la méthode décrite ci-dessus, mais avec la modification que d'une jauge 23, 1 en aiguille de la seringue stérile est utilisé à la place de l'aiguille de calibre 14. Le sang s'écoule goutte à goutte de l'aiguille de calibre 23 et 1 goutte est recueilli dans le plat de 35 mm, 3 gouttes dans le plat de 60 mm et 9 gouttes dans le plat de 100 mm. Les cellules sanguines sont ensuite mélangés uniformément dans la solution NaCl 3% en secouant doucement, d'abord dans un mouvement circulaire, puis va-et-vient. La préparation est incubée pendant 5 min à T ambiante pour permettre aux cellules de sang pour fixer à la surface plat, puis la solution saline initiale est remplacé par un tampon de choix ^3.
2. Si l'on veut maintenir les cellules sanguines substratum-jointe dans un état undegranulated, le mélange plasmatique initiale de solution saline du sang est remplacé par le LPS sans frais 3% de NaCl. Plasma accélère la dégranulation spontanée des cellules du sang, même en l'absence de LPS, et son retrait stabilise l'état undegranulated des cellules.
3. Si la solution saline initiale est remplacée par du plasma stérile, les cellules sanguines à partir de transformer la forme ovoïde de la cellule de sang circulant (Fig. 5) et les aplatir sur le substrat, puis lancer la dégranulation et la formation d'une couche de caillot sanguin coagulin extracellulaire dessus de la pelouse du amebocytes aplatie ^20.
   
   
   
   Figure 5
   
   
4. Création de cultures d'explants de amebocytes agrégées. Lorsque le sang est recueilli en vertu stérile, sans LPS conditions, les globules se déposent par suspension et s'agrègent pour former une masse de tissu ressemblant. Un conteneur pratique pour cela est le plat en verre embryon rendus LPS-libres par une incubation de 4 h à 180 ⁰ C. Le sang prélevé dans ce conteneur par ponction cardiaque à l'aide d'une aiguille de calibre 19 est incubé pendant 1 - 2 h à T ambiante, puis 1 carré morceaux mm sont coupés de l'ensemble Amébocytes avec une aiguille de la seringue stérile de 18 jauge et sont pris en sandwich entre deux coverglasses ou un lamelle et un toboggan séparés par des fragments de coverglasses d'agir comme des entretoises. Après environ une demi-heure, amebocytes commencer la migration de la périphérie de l'explant sur ​​la lamelle (fig. 6a), où ils peuvent être visualisés avec un contraste de phase ou optiques DIC ^21. Initialement, les cellules qui migrent sont compactes avec hyalines pseudopodes (fig. 6b (m)) qui sont prolongés au-dessus du substratum de migration, et qui sont ensuite descendus dans le contact avec la surface et mouvement vers l'avant implique la circulation du cytoplasme granulaire dans les ²² pseudopode . Plus tard, les cellules s'aplatissent (fig. 6b (f)) et d'initier dégranulation (fig. 6b (d)) et cesser de locomotion ^23. La chambre de culture décrite ici permet la perfusion de différents agents expérimentaux dans la chambre de culture pour étudier leurs effets sur la motilité cellulaire et ⁹ exocytose des granules. Un examen approfondi de la culture méthodologique Amébocytes pour l'examen microscopique peut être trouvée dans ^24.
   
   
   
   Figure 6
   
   

Entretien des adultes limules dans les aquariums

Les limules besoin de haute qualité et l'eau de mer peut être maintenu dans des aquariums équipés d'un système de purification d'eau qui assure la filtration des particules, l'aération et la dénitrification de l'eau ^25. Les animaux doivent être nourris 2 ou 3 fois par semaine sur les crevettes, homard, poisson, ou des calmars. L'alimentation est accompli en retirant l'animal de l'aquarium, l'APLil CING sur son dos, et placer les aliments sur la bouche. Si la faim, l'animal va bientôt commencer à avaler la nourriture. Selon la sophistication du système d'eau de mer, l'animal devrait être maintenue pour une heure ou jusqu'à ce qu'il défèque dans un récipient séparé d'eau de mer ou il peut être retourné à l'aquarium après le repas a commencé. Pour maintenance à long terme, l'animal doit être gardé loin de la lumière pour empêcher la croissance d'algues vertes ou bleu-vert à la surface de la carapace. Algues éroder la carapace et puisque l'adulte ne mue, ce qui cause la mort de l'animal ^26. Dans la nature, les animaux passent beaucoup de temps partiellement enfouies dans le sable, mais le sable ou le gravier dans l'aquarium présente une difficulté à maintenir le niveau de propreté important pour maintenance à long terme.

Discussion

Il ya quatre espèces de limules, polyphemus Limulus de la côte Est d'Amérique du Nord et trois espèces qui vont du Japon à la baie du Bengale. L'animal est identifié comme un "fossile vivant" parce que les formes anatomiquement similaires ont été trouvés comme des fossiles de 445 millions d'années ^27. La limule représente un animal à long terme, nécessitant 10 - 13 ans pour atteindre la maturité et la vie d'au moins 20 ans ^28. Bien qu'il ait été soumis à la récolte vaste comme appât pour la pêche de l'anguille et de conques ^29, le crabe fer à cheval est américaine encore raisonnablement abondante et permet la collecte non-destructive de 50 ml de sang d'un adulte de petite taille et autant que 400 ml d'une femelle de grande taille. Collecte de même cette beaucoup de sang peut être complété en moins de 10 minutes. Je ne connais pas d'autres invertébrés facilement disponible qui offre tant de sang avec si peu d'effort.

L'importance de l'essai LAL pour les endotoxines, un indicateur de la présence de bactéries Gram-négatives, a stimulé l'intérêt dans le système immunitaire de la limule ^13. Le test LAL dépend de l'activation de la protéase du lancement du système de coagulation du sang par le LPS ^14, avec une lecture de la formation de caillots ou d'un dosage colorimétrique de l'activité de la protéase. Les deux éléments de l'immunité qui ont reçu le plus d'attention ont été les protéines du plasma et des protéines et des peptides de plusieurs des granules de sécrétion des cellules du sang. Le résultat a été l'élévation de la limule à l'état d'avoir mieux décrit le système immunitaire pour tout invertébré longue durée de vie ¹¹