アメリカカブトガニ、カブトガニポリフェムスから採血

Summary

アメリカカブトガニ、カブトガニポリフェムスは、間違いなくあらゆる脊椎動物の血液中の大量のための最も便利なソースです。血液は全身循環、粒状の血球、血漿、ヘモシアニン、C -反応性タンパク質、およびα2-マクログロブリンで唯一の3種類のタンパク質で唯一の細胞型で、構成は単純です。血液は心臓から収集され、血液細胞と血漿を遠心分離によって分離されています。

Abstract

カブトガニはどんな長寿命無脊椎動物の最も特徴とする免疫システムを持っています。カブトガニの免疫の研究は、血液を大量に収集すると血液のシンプルさから使いやすさによって促進されています。カブトガニは、一般的な循環で唯一の単一のセルのタイプ、粒状の血球を示しています。プラズマは、海の水と3つしか豊富なタンパク質、ヘモシアニン、呼吸器蛋白質、プロテアーゼを阻害する細菌細胞、およびα2-マクログロブリンを含む外国の細胞の細胞溶解破壊に機能するC -反応性蛋白質、、、の塩分含有量を有​​する病原体の侵入の。血液は、リポ多糖（別名、エンドトキシン、LPS）、グラム陰性菌の製品による汚染を最小限に抑えるための条件の下で直接心臓穿刺によって収集されます。血液400mLの - 大型動物は、200を得ることができる。プラズマの研究のために、血液細胞は、直ちに遠心分離によって血漿から除去され、プラズマは、その構成要素であるタンパク質に分画することができる。血液細胞は、便利にし、それらのcoverglassesを取り付け、培養皿の表面の詳細LPS -フリーcoverglassesのいずれかを配置することにより、直接顕微鏡検査を可能にする条件の下でLPS -フリー等張生理食塩水（0.5MのNaCl）に血液の少量を収集することにより、顕微鏡的に研究されています細胞接着は、次の簡単な観察室インチ直接観察のための第二の準備は、3を収集することです - LPS -フリー胚皿​​に血液5mLをしてからチャンバーに集約amebocytesの断片をexplantingそのスライドとカバーガラスの間にサンドイッチの組織。この準備では、運動性amebocytesは、​​それらが容易に観察することができるカバーガラス表面、に移行する。血液凝固系はamebocytesの凝集と血液細胞の分泌顆粒から放出されるタンパク質、coagulin、細胞外血栓の形成を含む。洗浄した血液細胞の生化学的解析は、2％Tween - 20を、0.5 M LPS -フリーのNaCl、細胞の遠心分離に続いて、0.5で洗浄するM 0.1のボリュームに血液を集めることによって達成することができるその凝集と脱顆粒が発生しないが、必要です。塩化ナトリウム。

Protocol

出血に関連するカブトガニの解剖学的特徴（図1）

図1

1. 体の三大部門は、後部に前方から、前体部（P）、opisthosoma（O）、及び尾節^（T）1です。
2. 前体部の前方と横方向の自由なマージンはフランジです。
3. 尾節が連結するopisthosomaの後、ほとんどのインデントは、、端末のベイです。
4. 前体部とopisthosomaが明確にジョイントがヒンジ（H）です。
5. 心臓は、ちょうどprostomaとopisthosoma ^2（図2）の甲羅の下に、背側正中線に沿って位置しています。
   
   
   
   
   図2
   
   

一般的な考慮事項、不妊およびリポ多糖への曝露からの保護（エンドトキシン）

1. 成功したブリードの主要な敵は、細胞の凝集、エキソサイトーシス、およびcoagulinの血栓の形成である。細胞の凝集とエキソサイトーシスは、リポ多糖（別名、エンドトキシン、LPS）、グラム陰性菌の製品によって刺激されています。 1 mg / mLのが血漿中に浮遊細胞が有意に低い濃度の³によって活性化される-洗浄された細胞のためのエキソサイトーシスのためのLPSの閾値濃度は0.1です。エンドトキシンは、シンプルなオートクレーブで不活化されず、表面に存在すると、エンドトキシンフリーであることが認定されていないソリューションや試薬のと仮定することができます。
2. 採血時の血液凝固の可能性を減らすために、出血のためにのみ完全な、無傷の動物を選択します。 4℃の部屋で動物を1〜2時間を事前に冷やします。無菌操作を練習。エンドトキシンによる汚染を避けてください。
3. LPS -フリー3％の生理食塩水は、臨床医学で使用され、（特殊な試薬や消耗品の表を参照）、医療供給者から購入することができます。 LPSは、180 4時間℃でインキュベーションすることによりガラスと金属から削除することができます。滅菌使い捨ての注射針、ペトリスタイルの培養皿、そしてスクリューキャップの遠心管は、すべてのLPS -無料ですので、長い間、適切な無菌操作が実施されている修正なしで使用できます。
4. さまざまな動物の血液細胞の安定性は、動物は細心の注意をもって採血している場合でも、coagulinの血栓の形成をもたらす、自発的な脱顆粒を受けて、いくつかの個々の動物の細胞と、異なります。他の個々のカブトガニの血液細胞は、はるかに安定しており、適切な手順に従っているときに、出血やプラズマからの細胞の分離中も完全に粒状のまま。
5. いくつかのエージェントは、カフェイン（LPS -フリー3％のNaClで10mMのカフェインの0.25ボリュームに出血する^）4、プロプラノロール（1mMの最終濃度^）5、ジメチルスルホキシド^6、二価陽イオンのキレート化（含む出血以下の血液細胞を、安定させるために報告されている0.1 Mデキストロース、0.03 Mクエン酸ナトリウム、0.026 Mクエン酸、10mMの二ナトリウムエチレンジアミン四酢酸（のNa ₂ EDTA）、pH 4.6の^）7、G -タンパク質とホスホリパーゼC経路の阻害剤（コレラとの等量にブリードpertussusの毒素^{、U73122）8、}イセチオン酸アニオン⁹塩化物の置換、塩素イオンチャンネル遮断薬^9、サイクリック- AMP拮抗剤^9、スルフヒドリル試薬（5mMのN -エチルマレイミド^{、NEM）5、}及び膜-アクティブ洗剤のTween - 20（ 0.1容量の2パーセントLPS -フリー0.5MのNaClのTween - 20）に出血する。

カブトガニの出血のための消耗品と試薬：血液の大量のコレクション

1. 一つ以上の大規模な、無傷のカブトガニ
2. 70％エタノールを含む噴霧ボトル
3. キムワイプ
4. 14ゲージの針
5. 頑丈な鉗子
6. 氷と氷のバケツ
7. 50mLのスクリューキャップのプラスチック製使い捨て遠心管
8. 50 mLチューブを保持するためにラック
9. カウンタートップ遠心機
10. 滅菌50mLの血清学的ピペット
11. 電球型ピペットフィラー
12. 使い捨て無菌フィルター装置
13. 真空ポンプ
14. LPS -フリー3％のNaCl溶液（血液細胞の収集のための）
15. のTween - 20（血液細胞の収集のための）

大量出血のための準備

1. 出血の場合は、大規模な、無傷の動物を使用してください。出血前の低温室で1時間、動物を冷やす。
2. 約0.3メートルの高さ（風邪や凍結試薬を郵送するための使い捨て発泡スチロールの輸送用コンテナが適切である）と演算子のための低い椅子であるアイスバケット用の安定したサポートで快適な取り決めを確立する。アイスバケットは、支持構造上に配置されており、椅子が描かれているまで本機に。あなたの肘があなたの腿で休むと椅子で長時間快適に座って、そして氷のバケツに氷のベッドで直立支えられた採血管の上方に位置奮闘カブトガニを保持している左手とすべきです。
3. プレチル4 - 氷浴でネジのクロージャーと50mLの使い捨てのプラスチック製の遠心チューブの6。チューブを氷浴容器の周囲に遠隔氷で直立設定されています。ただ出血の操作を開始する前に、無菌操作に付着して、隣接テーブルの上にチューブと場所のキャップからキャップを取り外します。
4. 14 GAの針のキャップを外し、そのスリーブにニードルを緩めるために頑丈な鉗子を使用していますが、袖から針を削除しないでください。無菌性を維持する。指でニードルの任意の部分を触れないでください。針の露出尻と隣接したカウンターの針を持つ場所のスリーブは、無菌性を維持するために、どのような表面との接触から上昇。
5. 70％エタノールとキムワイプを湿らせ。

（特に右利きのオペレータのための）動物の出血

1. 前体部の前部フランジと尾の付け根（ターミナルベイ）でopisthosmaの後部をつかみ、親指と接触している4本の指で左手で把持動物：出血のために動物を保持する。動物の腹側表面には、手のひらに直面している。尾節は手首上の親指とプロジェクトのベースに沿って位置しています。静かにその前体部とopisthosomaが互いに（図3a）に対して直角であることを動物を曲げる。
   
   
   
   図3
   
   
2. に適用される70％エタノールで公開されたヒンジジョイントの接続前体部とopisthosomaを清掃してエタノールで湿らせたキムワイプを（図3b）。
3. 4最上位であり、動物の背側表面が上を向く - 指2がいるような左手を回転させる。右手で、左手の指2と3の間に、まだその保護スリーブで、14 GAシリンジの針を挿入する。右手で鉗子を取ると鉗子（図3c）でお尻をつかんで、その保護スリーブから針を取り除く。手のその背面と左側に向くように左手を回転させ、その背側表面は、右手を手前に向けて、親指と人差し指が上です、そして動物が逆さまです。針の鋭い端が針のシャフトは、背側正中線（図3d）と平行になるように関節やヒンジで指摘されるように、50 mLのコレクションチューブと東洋動物の最初に上記の針のお尻を合わせます。針は、背側正中線に平行に配置し、正中線で、まだコレクションチューブの開口部の上方に位置針のお尻と挿入保ち、心臓の内腔にヒンジジョイントを介して針の鋭利な端を挿入します。前体部の中心の部分に深さ2センチメートル - 針は、約1挿入されます。とすぐに心臓がパンクなので、血液が（図4a、矢印）急速に流れることになるので、注射針の送出端が、血液のその初期サージを収集するコレクションチューブの口の上に置かれていることを確認することが重要です。
4. 血液50mLのが収集された、個々の滴（図4b）に遅くなる - 血液は、約30日以降の連続ストリームで最初に心臓を終了します。血流を改善するために、それはわずかに針の向き、先端に良い政策かもしれません。左または右、下針を上方に傾けるか、心に深くその先端をスライドさせたり、血流を最適化する位置を見つけるために共同のヒンジに近いためにそれを引く。このリスクは、動物を損傷し、溢血凝固を開始する可能性があるため、過度に動物を圧縮しないでください。
   
   
   
   図4
   
   
5. 各コレクションチューブは血でいっぱいになると、針の送出端の下に次の空のチューブを持って来るために氷浴を回転させる。
6. 出血が遅くなるように、針にし、心臓への逆方向に空気の流れを持つことのリスクを実行します。動物が出てまっすぐにするときにこれは、それによって血圧を減らすこと、発生する可能性があります。屈曲位置で動物を維持することにより、または徐々にしか発生することが矯正できるため、これを防止するようにしてください。
7. 動物の血を与えて停止すると、心臓からの出血の針を取り除く。再キャップコレクションチューブとテーブルトップ遠心機、1000 RPM、5分ですぐに遠心分離。血液細胞は、コレクションチューブの底部に小型のペレットを形成します。血液凝固のためのすべてのコンポーネントは、血液細胞の分泌小胞に含まれているため、すぐにプラズマとしては、細胞から分離されている血漿の凝固のリスクが排除されます。
8. それは、溢血の凝固を避けるために不可欠です。次の対策は、凝固のリスクを減らす：動物をプレ冷やして氷浴でコレクションチューブを維持し、動物の穏やかなハンドリング、血液が注射器の針から流れると速さの減少を、血液の遠心分離直後コレクションの後、エンドトキシンと針とコレクションチューブのコンタミネーションの回避、滅菌手順のメンテナンス。上述したように、いくつかの個々の動物は、これらの処置がとられている場合でも、エキソサイトーシスを開始する、特に過敏性血液細胞を持っている。
9. 遠心後、血液凝固の兆候がないチューブを検査 - 細胞とゲル状の塊の材料のストランドは、チューブの壁に凝血塊の上部にあるゼラチン様物質、または、で捕捉された血液細胞と凝固の悪化、大量の添付流体の列（図4c、矢印）。これらの管からの物質は血漿、血清ではなく、血液細胞の分泌の製品が含まれています。
10. 50 mLの滅菌血清ピペットを滅菌チューブにプラズマを転送する。チューブの底に細胞ペレットからの細胞のいずれかを吸引避けるためにピペッティングする場合は、注意が必要です。細胞ペレットを乱さない避けるために、ペレット、上記のプラズマの数mLを残すことが最善です。
11. 上記の手順は、血液細胞の分泌産物によって汚染されていない血漿を大量に収集するように設計されています。洗浄した血液細胞を大量に収集するには、Tween - 20で3％LPS -フリーNaCl溶液に溶解した2％の0.1ボリュームに血液を集める。緩い細胞ペレットを確立するために10分間穏やかに細胞を遠心し、LPS -フリー3％のNaClのいくつかの変化で細胞を洗浄する。血液細胞の分泌産物を含む細胞抽出液は、LPSフリー蒸留水で洗浄した細胞を溶解することによって調製することができる。このライセートは、抗微生物免疫防御^10,11で動作し、またcoagulogen、細胞外の血液凝固の構造タンパク質のチモーゲン形態、およびcoagulinにcoagulogenを変換するプロテアーゼのコレクションを、含まれているタンパク質やペプチドの多様な配列が含まれています血栓¹²の線維に重合するタンパク質の形。この抽出物は、リポ多糖¹³の存在をアッセイするために使用されている市販の製品、カブトガニ血球ライセートまたはLAL、に似ています。 coagulinへcoagulogenのタンパク質分解改造の責任プロテアーゼカスケードがLPS ¹⁴によって活性化される。
12. 出血後の動物の処分。上記の特定された方法で実施した出血は動物でも許容される。ウッズホールでの海洋生物学研究所で働いているときに、私は彼らが生き残ることを見込んで出血後に海に動物を返します。動物は、カブトガニの正常範囲から遠い水槽で維持されている場合、それらは月に1,2回繰り返して出血することができます。以下に記載されるように、飼育下で維持動物は自分の健康を維持するために高品質の水と頻繁な給餌が必要です。安楽死が目の間の背側正中線に位置する背側神経節、の破壊によって達成することができる。

血漿の処理と保管

1. プロテアーゼからの保護。プラズマは、タンパク質精製に使用する場合、それは即座に収集した後、プロテアーゼ阻害剤で治療されるべきである。 1mMの最終濃度にフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）を追加します。 PMSFは、DMSOまたはエタノールで0.1 Mのストック溶液として保持されます。それは水¹⁵で非常に不安定であるので、永続的な保護のために頼ることはできませんが、すぐに血液細胞から血漿を分離後に加えて、細胞から放出されている可能性がありますプロテアーゼの少量の不活性化するでしょう。
2. 滅菌濾過：0.22 mmの細孔のフィルターを装着した使い捨ての中規模ろ過装置を使用して真空下で限外濾過によりプラズマを滅菌する。これらのフィルタは目詰まりする傾向があります。この問題を軽減するフィルタリングの前に血漿を遠心分離することをお勧めします。プラズマの大量処理をする場合、それは最初の0.45ミリメートル孔径ミリポアフィルターとし、1mmの孔径とのミリポアフィルターを用いてプレフィルタープラズマにお勧めです。
3. プラズマは、0.2 mg / mLの最終濃度にNaN _3を追加したり、無菌ろ過のいずれかによって細菌汚染から保護することができる。 Unsterileプラズマは、1つまたはこれらの抗細菌対策が取られて、他のことなく、2日間より長い期間保存されることはありません。
4. 血液凝固。哺乳類の血液凝固系とは異なり、カブトガニ血漿は、血液凝固のための要素のどれが含まれていません。代わりに、血栓形成、血栓の構造タンパク質（coagulogen）とプロテアーゼのシステム全体の機械そのプロセスのcoaguloge、不溶性の塊に重合が可能なレンダリングにNが血液細胞¹⁶の分泌顆粒に含まれています。彼らはエキソサイトーシスを受ける機会を持つ前に、血液細胞が除去されているのであれば、プラズマは、凝固のためのタンパク質の完全に自由であり、いつまでも液体のままになります。
5. タンパク質精製。ヘモシアニンは、プラズマでは40 mg / mLで存在し、70 kDaのサブユニットの48 - merのです。それはバイオゲルA5m ¹⁷などの大きな細孔のサイズ排除樹脂を超遠心分離（40,000 × gで、8時間）またはゲルろ過によって単離することができる。 C -反応性タンパク質は、1に存在する- 5 mg / mLのとは、カルシウムキレート化剤¹⁸の溶出で、phosphorylethanolamine -セファロース上でアフィニティー分離によって単離することができる。広域スペクトルのプロテアーゼ阻害剤_、2 - macroglogulinは、セファクリルを用いたゲル濾過により精製されたS - 300ヘモシアニンとC -反応性タンパク質は後の樹脂は^、19を削除されています。

文化の運動性血液細胞の顕微鏡検査

1. in vitroでの血球芝生の確立：LPS -フリー3％のNaCl溶液を滅菌プラスチックシャーレスタイルの培養皿（35mmディッシュ用1 mLを、60mmディッシュに2.5 mLを、90mLのディッシュ6 mL）に追加されます。血液は、前述の方法を用いて心臓穿刺によって得られるが、無菌の注射針の23ゲージ、1は14ゲージの針の代わりに使用されていることを修正した。さ血液は、23ゲージの針からのドロップでドロップを流れ、1滴を35 mmディッシュ、60mmディッシュに3滴、および100 mmディッシュに9滴に回収される。血液細胞は、その後に前後して、穏やかな、回転する円形のパターンの最初で3％のNaCl溶液中で均一に混合されています。準備が血液細胞が培養皿の表面にアタッチできるように部屋のTで5分間インキュベートされ、その後初期の生理食塩水は、選択肢³のバッファに置き換えられます。
2. それが基層に接続されたundegranulated状態で血液細胞を維持するために必要な場合は、最初の生理食塩水、血液血漿の混合物は、新鮮なLPS -フリー3％のNaClに置換されます。プラズマでもLPSの非存在下で血液細胞の自発的な脱顆粒を加速し、その除去は細胞のundegranulated状態を安定化させる。
3. 最初の生理食塩水を滅菌プラズマに置き換えている場合は、血液細胞は、循環血液細胞の卵形の形状（図5）から変換し、基層の上に平らにし、脱顆粒とcoagulin細胞外血液凝固の層の形成を開始する扁平amebocytes ²⁰の芝生上に。
   
   
   
   図5
   
   
4. 集約されたamebocytesの植文化の確立。血液は無菌、LPS -フリーの条件下で収集されると、血液細胞は、組織のような塊を形成するために、サスペンションや集計から沈降する。このための便利な容器は^180℃で4時間インキュベーションすることによりLPS -フリーレンダリングされたガラスの胚の料理です。 19ゲージの針を用いて心臓穿刺によりこの容器に採取した血液は1インキュベートさ - しルームT、1mm角の滅菌18ゲージの注射針と血球凝集体から切断されている部分で2時間二coverglassesかの間に挟まれているカバーガラスとスペーサーとして機能するようにcoverglassesの断片で区切られたスライド。約半時間後、amebocytesは、それらは、位相コントラストやDIC光学系²¹を見ることができるカバーガラス（図6a）、上に外植片の周囲からの移行を開始。最初に、移行細胞が移行基層の上に拡張されている硝子pseudopods（図6b（M））とコンパクトですし、表面に接触低下することと前進運動は仮足²²に粒状の細胞質の流れを伴う。後、細胞は平らに（図6b（F））と脱顆粒を開始する（図6b（D））と運動^23を停止する。ここで説明する培養チャンバーには、培養チャンバーに異なる実験的な薬剤の血流が細胞の運動性および顆粒のエキソサイトーシス⁹上のそれらの効果を調査することができます。顕微鏡検査用血球文化の拡張方法論の見直しを²⁴で見つけることができます。
   
   
   
   図6
   
   

水槽内の成人カブトガニのメンテナンス

カブトガニは、高品質の海の水を必要とし、粒子ろ過、曝気、水²⁵の脱窒を提供する水浄化システムを搭載した水槽で維持することができます。動物は、エビ、ロブスター、魚、またはイカで2か週3回供給されるべきである。餌は水族館、PLAから動物を除去することによって達成されるその背中にそれを平定し、口に食べ物を置く。空腹なら、動物はすぐに食べ物を嚥下開始されます。それは海の水の別の容器にdefecatesや給餌が始まったれたあとに水槽に戻すことができるまで、海の水のシステムの高度化に応じて、動物は時間かそこらのために維持されるべきである。長期的なメンテナンスのため、動物は、甲羅の表面に緑または青緑色藻類の増殖を防ぐために、光からできるだけ離してください。藻類が甲羅を侵食し、大人が脱皮していないので、これは動物の^26〜死の原因となります。野生では、動物は部分的に砂に埋もれた多くの時間を過ごすが、砂や水槽の砂利は、長期的なメンテナンスのために重要な清浄度のレベルを維持する上で困難を提示。

Discussion

カブトガニの4種、東側の北アメリカの海岸三種、日本からベンガル湾にその範囲からカブトガニポリフェムスがあります。解剖学的に同様のフォームが^274.45億年前から化石として発見されているので、動物は"生きた化石"として識別されます。成熟に達するために13歳と20歳以上²⁸生きている-カブトガニは、10を必要とする、長寿命の動物を表しています。それはウナギとサザエの漁業²⁹餌として大規模な伐採にさらされているが、アメリカカブトガニは、引き続き合理的に豊富であり、非破壊小さな大人から血液を50mLのコレクションやからまた、400 mLを許可大規模な女性。さらにこれだけの血のコレクションは、10分以内で完了することができます。私は少しの努力でそんなに血に支払う他の容易に入手可能な無脊椎動物を発見された。

エンドトキシンLALテストの重要性、グラム陰性細菌の存在の指標は、カブトガニ¹³の免疫系への関心を刺激している。 LAL試験は、読み出し血栓形成のまたはプロテアーゼ活性の比色アッセイのと、LPS ^{14日までに} 、血液凝固系の開始プロテアーゼの活性化に依存する。最大の注目を受けている免疫の二つの要素は、血漿の蛋白質と血液細胞の分泌顆粒のいくつかのタンパク質やペプチドをされている。その結果、あらゆる長寿命の無脊椎動物の¹¹の最高に記載の免疫システムを持っていることの状況にカブトガニの上昇となっている