Забор крови из американского Подкова Краб, Limulus Полифема

Summary

Американская подковы краба, Limulus Полифема, вероятно, является наиболее удобным источником для большого количества крови любого беспозвоночных. Кровь простой по составу, только с одним камерного типа в общую циркуляцию, гранулированных амебоцит, и только три обильных белков в плазме, гемоцианин, С-реактивного белка, и α2-макроглобулина. Кровь собирается из сердца и клеток крови и плазмы центрифугированием.

Abstract

Подковы краба имеет лучшие характеризуется иммунная система любого долгоживущих беспозвоночных. Изучение иммунитета у мечехвостов способствовало легкости в сборе больших объемов крови и от простоты крови. Мечехвостов показать только один тип ячейки в общую циркуляцию, гранулированных амебоцит. Плазме содержания соли в морской воде, и только три обильных белков, гемоцианин, дыхательной белок, С-реактивного белка, которые функционируют в цитолитического уничтожение чужеродных клеток, в том числе бактериальной клетки и α2-макроглобулина, который ингибирует протеазы вторжение болезнетворных микроорганизмов. Кровь собирается прямой пункции сердца в условиях, которые сводят к минимуму загрязнение липополисахарида (ака, эндотоксин, ЛПС), продукт грам-отрицательных бактерий. Большое животное может принести 200 - 400 мл крови. Для изучения плазмы, клеток крови, немедленно удаляются из плазмы путем центрифугирования и плазмы может быть фракционированного на составляющие ее белки. Клетки крови удобно изучать микроскопически, собирая небольшие объемы крови в LPS-свободный изотонический солевой раствор (0,5 М NaCl) в условиях, допускающих прямое микроскопическое исследование, поставив один из более ЛПС без coverglasses на поверхности блюда культуры, то установка этих coverglasses в простых камер наблюдения следующие ячейки привязанности. Второй подготовки к непосредственному наблюдению является сбор 3 - 5 мл крови в LPS-свободный эмбрион блюдо, а затем культивирующий в искусственной среде фрагменты агрегированных amebocytes к камере, что бутерброды ткани между предметным и покровного стекла. В этой подготовке, подвижных amebocytes мигрировать на поверхность покровного стекла, где они могут легко быть соблюдены. Систему свертывания крови включает в себя совокупность amebocytes и формирование внеклеточного сгусток белка, coagulin, который выделяется из секреторных гранул из клеток крови. Биохимический анализ отмытых клеток крови, что требует агрегации и дегрануляции не происходит, что может быть осуществлено путем сбора крови в 0,1 объемах 2% Твин-20, 0,5 М ЛПС без NaCl, с последующим центрифугированием клеток и мытье 0,5 М NaCl.

Protocol

Анатомические особенности подковы краба, имеющие отношение к кровотечение (рис. 1)

Рисунок 1

1. Три основных отдела тела, спереди назад, являются головогруди (P), opisthosoma (O), и тельсона (Т) ^1.
2. Переднего и бокового свободного края головогруди является фланца.
3. Задне-самый отступ opisthosoma, где тельсона артикулирует, является терминал залив.
4. Совместное где головогруди и opisthosoma сформулировать это шарнир (H).
5. Сердце расположено вдоль спинной средней линии, как раз под панцирь prostoma и opisthosoma ² (рис. 2).
   
   
   
   
   Рисунок 2
   
   

Общие соображения, стерильность и защита от воздействия липополисахарида (эндотоксин)

1. Главный враг успешной кровотечение ячейки слипания, экзоцитоз, формирование сгустка coagulin. Агрегация клеток и экзоцитоз стимулируются липополисахарида (ака, эндотоксин, ЛПС), продукт грам-отрицательных бактерий. Пороговой концентрации ЛПС для экзоцитоза для отмытых клеток составляет 0,1 - 1 мг / мл, но клетки, взвешенных в плазме активируются значительно более низкие концентрации ^3. Эндотоксина не инактивируется простой автоклавирования и можно предположить, присутствовать на поверхности и в растворах и реагенты, которые не сертифицированы для эндотоксина бесплатно.
2. Чтобы уменьшить вероятность свертывания крови во время сбора крови, выбрать только идеально, неповрежденных животных для кровотечения. Предварительное охлаждение животных 1-2 ч в 4 ° C комнате. Практика стерильной техники. Избегайте загрязнения эндотоксина.
3. LPS-бесплатно 3% физиологического раствора используется в клинической медицине и может быть приобретен у поставщиков медицинского (см. таблицу специализированных реактивов и расходных материалов). ЛПС может быть удален из стекла и металла путем инкубации при температуре 180 ° С в течение 4 часов. Стерильный одноразовый шприц иглы, Петри стиле блюда культуры и завинчивающейся крышкой трубы центрифуги все LPS-бесплатно и может быть использован без изменений до тех пор, как надлежащее стерильных практикуется.
4. Устойчивость клеток крови различных животных отличается, с клетками некоторых отдельных животных проходит спонтанной дегрануляции, что приводит к образованию сгустка coagulin, даже когда животное кровь с величайшей осторожностью. Клетки крови других индивидуальных мечехвостов значительно более стабильной и, когда соответствующие процедуры соблюдаются, остаются полностью гранулированных во время кровотечения и разделения клеток из плазмы.
5. Некоторые агенты были зарегистрированы для стабилизации крови клеток после кровотечения, в том числе кофеина (0,25 кровоточить в объемах 10 мМ кофеина в LPS-свободные 3% NaCl) ^4, пропранолол (1 мМ конечной концентрации) ^5, диметилсульфоксид ^6, отравлений двухвалентных катионов ( кровоточить в равный объем 0,1 М раствора декстрозы, 0,03 М цитрат натрия, 0,026 М лимонной кислоты, 10 мМ динатриевая этилендиаминтетрауксусной кислоты (Na ₂ ЭДТА), рН 4,6) ^7, ингибиторы G-белком и фосфолипаза-C путей (холера и pertussus токсинов, U73122) ^8, замены хлорида isethionate анион ^9, хлорид антагонистов ^9, циклический AMP-антагонистов ^9, сульфгидрильных реагентов (5 мМ N-этил малеимида, NEM) ^5, и мембранно-активных моющих средств твин-20 ( кровоточить в 0,1 объема 2% Твин-20 в LPS-свободный 0,5 М NaCl).

Расходные материалы и реагенты для кровотечения подковы краба: сбор больших объемов крови

1. один или несколько больших, неповрежденных подковы краба
2. шприц флакон, содержащий 70% этанола
3. Kimwipes
4. 14 иглы
5. крепкий щипцы
6. ведерко со льдом со льдом
7. 50 мл завинчивающейся крышкой пластиковой одноразовой трубы центрифуги
8. стойки для хранения 50 мл труб
9. Счетчик-топ центрифуги
10. стерильные 50 мл серологических пипеток
11. лампы типа пипетки наполнителя
12. одноразовые стерильные фильтрационный аппарат
13. вакуум-насос
14. LPS-свободные 3% раствором хлорида натрия (для сбора клеток крови)
15. Твин-20 (для сбора клеток крови)

Подготовка большого объема кровотечения

1. Для кровотечения, использование больших, неповрежденных животных. Холод животного в течение 1 ч в холодном помещении до кровотечения.
2. Создание удобной договоренности с устойчивую опору для льда ведро, которое составляет около 0,3 метров (одноразовые доставки пенополистирола контейнер для рассылки холодного или замороженного реагентов уместно) и кресло для оператора. Ведерко со льдом помещается на опорной конструкции и председатель обращаетсядо этого устройства. Вы должны быть удобными сидя в течение длительного периода в кресле с локти на бедрах, и с левой руки, держащей борется подковы краба расположена над сбора крови труб подпер в вертикальном положении в постели льда в ведерко со льдом.
3. Предварительное охлаждение 4 - 6 из 50 мл одноразовых пластиковых пробирок с винтовой замыкания в ледяной бане. Трубы устанавливаются вертикально в лед колебался по периметру контейнера ледяной бане. Незадолго до начала кровотечения операцию, удалить заглушки с труб и место шапки на соседних таблице, придерживаясь стерильной техники.
4. Снимите крышку 14 га иглы и использовать крепкий щипцы, чтобы ослабить иглу в своем рукаве, но не вынимайте иглу из рукава. Сохранения стерильности. Не прикасайтесь часть иглы с помощью пальцев. Место рукав с иглой на соседние счетчик с открытой прикладом иглы повышенных от контакта с любой поверхностью, чтобы сохранить свое бесплодие.
5. Смочите Kimwipe с 70% этанола.

Кровотечение животных (специально для правого оператора)

1. Холдинг животного при кровотечении: понять животное в левой руке четыре пальца в контакте с переднего фланца головогруди и большого пальца схватив задней части opisthosma у основания хвоста (терминал залив). Вентральной поверхности животного лица ладони. Тельсона лежит вдоль основания большого пальца и проектов за запястье. Flex животное осторожно, чтобы головогруди и opisthosoma находятся под прямым углом друг к другу (рис. 3а).
   
   
   
   Рисунок 3
   
   
2. Чистая подвергается шарнирного соединения и соединения головогруди opisthosoma с 70% этанола применяться с этанолом увлажненных Kimwipe (рис. 3б).
3. Поверните левую руку так, что пальцы 2 - 4, верхний и спинной поверхности животного вверх. С правой рукой, вставьте 14 га иглу шприца, все еще находится в защитный кожух, между пальцами 2 и 3 левой руки. Возьмите пинцетом в правой руке и удалить иглу из защитного рукава, держа приклад с пинцетом (рис. 3в). Поверните левую руку так, что спинной поверхности стороны лица с левой стороны, большой и указательный палец вверх, и животное с ног на голову, с его спинной поверхности, обращенной к правой руке. Позиция прикладом иглу над первым из 50 мл коллекции трубок и ориентироваться животное так, чтобы острый конец иглы направлен на шарнирного соединения и таким образом, чтобы игла вала параллельно спинной средней линии (рис. 3). Вставьте острие иглы через шарнирного соединения в просвет сердце, держа иглу расположены параллельно спинной средней линии и вставляется в средней линии и с прикладом иглу еще расположен над открытием коллекции трубки. Игла вводится около 1 - 2 см вглубь части сердца в головогруди. Как только сердце проколот, кровь будет течь быстрее (рис. 4а, стрелка), поэтому важно обеспечить, чтобы поставка конце иглы шприца располагается над устьем пробирки для сбора, что начальная волна крови.
4. Кровь выйдет из сердца первоначально в непрерывном потоке, что примерно через 30 - 50 мл крови были собраны, замедлится до отдельных капель (рис. 4б). Чтобы улучшить кровоток, она может быть хорошей политикой переориентировать кончик иглы чуть-чуть. Tilt иглу вверх или вниз, влево или вправо; слайд его кончик глубже в сердце или тянуть его ближе к шарнирного соединения, чтобы найти позицию, которая оптимизирует кровообращение. Не сжимать животных чрезмерно, потому что это риски повреждения животных и может привести к extravasated крови инициировать свертывание.
   
   
   
   Рисунок 4
   
   
5. Поскольку каждая коллекция трубки наполняется кровью, вращать ледяной бане довести следующую пустую трубку под доставки конце иглы.
6. Как кровотечение замедляется, вы рискуете в том, воздушный поток в обратном направлении в иглу и в сердце. Это может произойти, когда животное выпрямляется, тем самым снижая артериальное давление. Постарайтесь, чтобы предотвратить это, поддерживая животное в согнутом положении или разрешив выпрямление происходит очень медленно.
7. Когда животное останавливается сдачи крови, удалить кровотечения иглу из сердца. Re капитализации коллекции трубок и сразу же в центрифуге настольные центрифуги, 1000 RPM, 5 мин. Клетки крови образуют компактный гранул на дне коллекция трубок. Поскольку все компоненты для свертывания крови, которые содержатся в секреторных пузырьках клеток крови, как только плазма отделяется от клетки,риск свертывания плазмы устранены.
8. Крайне важно, чтобы избежать свертывания extravasated крови. Следующие меры снижения риска свертывания: Предварительное охлаждение животных и поддержание коллекции труб в ледяной бане, бережное обращение с животными, снижение скорости, с которой кровь течет из шприца; центрифугирования крови немедленно после сбора, предотвращение загрязнения игл и сбора труб с эндотоксина, поддержание стерильной процедуры. Как уже отмечалось выше, отдельные животные особенно раздражительными клеток крови, которые инициируют экзоцитоза даже тогда, когда эти меры предосторожности соблюдаются.
9. После центрифугирования проверить трубы на наличие признаков свертывания крови - нити клетки и желатиновых материала сгусток прикреплен к стенкам трубы, желатиновых материала в верхней части сгусток, или, хуже того, большое количество сгустков с захваченного кровяных клеток в столба жидкости (рис. 4в, стрелка). Материал из этих труб сыворотки, а не плазмы, а также содержит выделяются продукты клеток крови.
10. Передача плазмы стерильные пробирки с 50 мл стерильного серологические пипетки. Будьте осторожны при пипетки, чтобы избежать аспирации любой из клетки осадок клеток в нижней части трубы. Лучше всего оставить несколько мл плазмы над гранул чтобы не потревожить осадок клеток.
11. Описанная выше процедура предназначена для сбора больших объемов плазмы незагрязненных по секреторных продуктов из клеток крови. Чтобы накапливать большие объемы отмытых клеток крови, собирают кровь в 0,1 объемах 2% Твин-20 растворяют в 3% ЛПС без раствором хлорида натрия. Центрифуга клетки мягко в течение 10 минут, чтобы установить свободную осадок клеток, затем промыть клетки с несколькими изменениями LPS-свободных 3% NaCl. Экстракт клеток, которые содержатся секреторные продукты крови клетки могут быть получены путем лизиса отмытых клеток в LPS-свободный дистиллированной воды. Этот лизат содержит разнообразные белки и пептиды, которые работают в антимикробные иммунную защиту ^10,11, а также содержит coagulogen, зимоген форме структурный белок внеклеточной сгусток крови, и коллекция протеаз, которые преобразуют coagulogen к coagulin, форма белка, который полимеризуется в фибриллы сгусток ^12. Этот отрывок похож на коммерчески доступный продукт, Limulus амебоцит лизата или LAL, который используется для анализа на наличие липополисахарида ^13. Протеазы каскад протеолитических ответственность за модификацию coagulogen к coagulin активируется LPS ^14.
12. Распоряжение животных после кровотечения. Кровотечение проведенного методов, указанных выше хорошо переносится животными. Когда работал в Морской биологической лаборатории в Вудс-Хол, я возвращаюсь животных к океану после кровотечения с ожиданием, что они выживут. Если животные содержались в аквариумах далеким от нормального диапазона мечехвостов, они могут быть кровь многократно один или два раза в месяц. Как описано ниже, животные содержащиеся в неволе требуют высокого качества воды и частое кормление для поддержания их здоровья. Эвтаназия может быть достигнуто путем уничтожения спинной ганглий, который находится в спинной средней линии между глазами.

Обработка и хранение плазмы

1. Защита от протеаз. Если плазма будет использоваться для очистки белков, следует относиться с ингибиторами протеазы сразу после сбора. Добавить phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) до конечной концентрации 1 мМ. PMSF хранится в виде 0,1 М маточного раствора в ДМСО или этаноле. Вполне нестабильный в воде ^15, так что нельзя полагаться на прочной защитой, но того сразу же после отделения плазмы от клеток крови инактивирует небольшое количество протеаз, которые могли быть освобождены из клетки.
2. Стерильная фильтрация: стерилизовать плазмы методом ультрафильтрации под вакуумом использованием одноразовых среднего фильтрации устройство оснащено 0,22 фильтр пор мм. Эти фильтры имеют тенденцию забивать. Желательно, чтобы центрифуги плазмы до фильтрации, чтобы уменьшить эту проблему. Если большие объемы плазмы обрабатываются, желательно, чтобы фильтр предварительной очистки плазмы первом использовании Millipore фильтр с размером пор 1 мм, то с 0,45 мм размер пор Millipore фильтр.
3. Плазма может быть защищена от бактериального загрязнения либо путем добавления NaN ₃ до конечной концентрации 0,2 мг / мл или стерильной фильтрации. Нестерильных плазмы никогда не должны храниться на срок более 2-х дней без одного или другого из этих антибактериальных принимаемых мерах.
4. Свертывания крови. В отличие от млекопитающих, систему свертывания, Limulus плазма содержит ни один из элементов для свертывания крови. Вместо этого, все оборудование для сгустка, структурный белок сгусток (coagulogen) и системы протеаз, что процесс coagulogeн, чтобы сделать ее способной полимеризации в нерастворимую сгусток, находится в секреторных гранулах клеток крови ^16. Так что, если клетки крови удаляются прежде, чем они имеют шанс пройти экзоцитоза, плазма полностью свободным от белков свертывания крови и останется жидкости на неопределенный срок.
5. Белки очистки. Гемоцианин присутствует в 40 мг / мл в плазме и 48-Мер из 70 кДа субъединицы. Он может быть изолированным ультрацентрифугированием (40000 X г, 8 ч) или гель-фильтрации с большим размером пор исключение смол, таких как биогеля А5М ^17. С-реактивного белка присутствуют на 1 - 5 мг / мл и может быть выделен с помощью аффинной изоляции на phosphorylethanolamine-сефарозой, с элюированием кальция хелат ^18. Широкого спектра действия ингибитора протеазы, _{2-macroglogulin,} были очищены гель-фильтрации на Sephacryl С-300 смолы после гемоцианин и С-реактивного белка были удалены ^19.

Микроскопическое исследование подвижных клеток крови в культуре

1. Создание амебоцит газоны в пробирке: LPS-свободные 3% раствором хлорида натрия добавляется к стерильным пластиковым Петри стиле культуры блюда (1 мл на 35 мм блюдо, 2,5 мл на 60 мм блюдо, 6 мл на 90 мл блюдо). Кровь затем получить пункции сердца по методу, описанному выше, но с отличием, что 23 калибр, 1 в стерильной иглой шприца используется вместо 14 калибра иглы. Кровь течет капельный от 23 иглы и 1 каплю собирается в 35 мм блюдо, 3 капли на 60 мм блюдо, и 9 капель на 100 мм блюдо. Клетки крови смешивают равномерно в 3% раствором хлорида натрия, осторожно закрученной, сначала в круговой схеме, а затем обратно и вперед. Препарат выдерживают в течение 5 мин при комнатной T, чтобы клетки крови приложить к поверхности посуды, то начальная солевой заменяется буфером выбора ^3.
2. Если желательно поддерживать субстрат подключением клеток крови в undegranulated состояния, начальный физиологический раствор плазмы крови смесь заменяли свежим LPS-свободных 3% NaCl. Плазменные ускоряет спонтанную дегрануляцию клеток крови даже в отсутствии ЛПС, и ее удаление стабилизирует undegranulated состояние клеток.
3. Если начальная солевой заменяется стерильной плазмы, клеток крови, перейти от яйцевидной формы циркулирующих клеток крови (рис. 5) и придавить на субстрате, а затем инициировать дегрануляцию и формирование слоя coagulin внеклеточной сгусток крови выше газона уплощенных amebocytes ^20.
   
   
   
   Рисунок 5
   
   
4. Создание эксплантов культур агрегированных amebocytes. Когда кровь собирается в стерильных, LPS-свободных условиях, клетки крови оседают из подвески и совокупного формировать ткани, как масса. Удобный контейнер для этого является стеклянной посуде эмбриона оказанные LPS-бесплатно инкубации в течение 4 ч при 180 ⁰ С. Кровь собрали в этом контейнере пункции сердца использованием 19 иглы, инкубируют в течение 1 - 2 часа при комнатной Т, то части 1 мм квадратный вырезаны из амебоцит совокупности с стерильную иглу шприца 18 калибр и зажат между двумя или coverglasses покровного стекла и слайдов, разделенных фрагментов coverglasses выступать в качестве прокладки. Примерно через полчаса, amebocytes начинают мигрировать с периферии эксплантов на покровного стекла (рис. 6а), где они могут быть просмотрены с помощью фазового контраста или DIC оптики ^21. Первоначально, мигрирующих клеток компактные с гиалиновых псевдоподии (рис. 6, б (м)), что распространяются выше миграции субстрат, а затем опускают в контакт с поверхностью и поступательное движение включает в себя поток гранулированного цитоплазмы в псевдоподия ²² . Позже, клетки сглаживаются (рис. 6, б (е)) и инициировать дегрануляции (рис. 6, б (г)) и прекратить передвижение ^23. Культуры камеры, описанные здесь позволяет перфузии различных экспериментальных препаратов в культуре камеры для исследования их влияния на клеточной подвижности и гранул экзоцитоза ^9. Расширенные методологического обзора амебоцит культуры для микроскопического исследования можно найти в ^24.
   
   
   
   Рисунок 6
   
   

Техническое обслуживание взрослых мечехвостов в аквариумах

Подкова крабы требуют высокого качества морской воды и может сохраняться в аквариумах оснащены системой очистки воды, которая обеспечивает фильтрацию частиц, аэрации, и денитрификации воды ^25. Животные должны быть поданы 2 или 3 раза в неделю по креветки, омары, рыба или кальмары. Кормление осуществляется путем удаления животного из аквариума, планаркотик его на спину, и размещение пищу в рот. Если голодны, животное вскоре начнет глотания пищи. В зависимости от сложности системы морской водой, животное должно сохраняться в течение часа или около того, пока она испражняется в отдельный контейнер морской воды, или он может быть возвращен в аквариуме после кормления началось. Для долгосрочного обслуживания, животных следует держать подальше от света, чтобы предотвратить рост зеленым или сине-зеленых водорослей на поверхности панциря. Водоросли подорвать панциря и с тех взрослый не линьки, это приведет к смерти животного ^26. В дикой природе животные проводят большую часть времени частично похоронен в песок, но песок или гравий в аквариум представляет трудности в поддержании уровня чистоты важно для долгосрочного обслуживания.

Discussion

Есть четыре вида подковы краба, Limulus Полифема с восточного побережья Северной Америки и три вида, которые варьируются от Японии до Бенгальского залива. Животных определяется как "живое ископаемое", потому что анатомически подобные формы были найдены в ископаемом состоянии от 445 миллионов лет назад ^27. Подковы краба представляет долгоживущих животных, что требует 10 - 13 лет, чтобы достичь зрелости и жизни не менее 20 лет ^28. Хотя он был подвергнут обширный уборки в качестве приманки для угорь и раковины рыболовства ^29, американский подковы краба по-прежнему достаточно много и позволяет неразрушающее коллекция из 50 мл крови из маленького взрослого и до 400 мл с большие женщины. Сборник даже это много крови может быть завершена менее чем за 10 минут. Я не знаю другого доступны беспозвоночных, что дает так много крови, имея так мало усилий.

Важность ЛАЛ тест на эндотоксин, индикатор присутствия грам-отрицательных бактерий, стимулировал интерес к иммунной системе подковы краба ^13. LAL тест зависит от активации инициирования протеазы в систему свертывания крови ЛПС ^14, с чтения из сгустка или колориметрический тест для протеазы деятельности. Двух элементов иммунитета, которые получили наибольшее внимание было белками плазмы и несколько белков и пептидов из секреторных гранул из клеток крови. Результатом стало высоте подковы краба со статусом, имеющие лучшие описано иммунной системы для любых долгоживущих беспозвоночных ¹¹