Blodtappning från den amerikanska Horseshoe Crab, Limulus Polyfemos

Summary

Den amerikanska hästsko krabba, Limulus Polyfemos, är utan tvekan den mest bekväma källa för stora mängder av blod av alla ryggradslösa. Blodet är enkel sammansättning, med endast en celltyp i den allmänna cirkulationen, det granulat amebocyte, och endast tre rikliga proteiner i plasma, hemocyanin, C-reaktivt protein och α2-makroglobulin. Blod samlas in från hjärtat och blodkroppar och plasma separeras genom centrifugering.

Abstract

Hästskon krabba har den bästa karaktäriserad immunsystemet av någon långlivade ryggradslöst. Studien av immunitet i Horseshoe krabbor har underlättats av den lätthet med att samla in stora mängder blod och från enkelheten i blodet. Hästsko krabbor visar bara en enda celltyp i den allmänna cirkulationen, det granulat amebocyte. Plasman har salthalten i havsvatten och endast tre rikliga proteiner, hemocyanin, andningsvägar protein, C-reaktiva proteiner, som fungerar i cytolytisk förstörelsen av främmande celler, inklusive bakterieceller, och α2-makroglobulin som hämmar proteaser av invaderande patogener. Blod samlas in genom direkt hjärt punktering under förhållanden som minimerar kontaminering av lipopolysackarid (alias, endotoxin, LPS), en produkt av gramnegativa bakterier. Ett stort djur kan ge 200 till 400 ml blod. För studiet av plasman, är blodceller omedelbart bort från plasma genom centrifugering och plasma kan sedan fraktioneras i dess olika proteiner. Blodkroppar är bekvämt studeras mikroskopiskt genom att samla in små mängder blod i LPS-fria isoton koksaltlösning (0,5 M NaCl) under förhållanden som medger direkt mikroskopisk undersökning genom att placera en mer LPS-fri täckglas på kulturen skålen ytan, då montering dem täckglas i enkla observation kammare efter cellbindning. En andra förberedelse för direkt iakttagelse är att samla in 3 - 5 ml blod i ett LPS-fri embryo skålen och sedan explantation fragment av aggregerade amebocytes till en kammare som smörgåsar vävnaden mellan en bild och en coverglass. I denna beredning, den rörliga amebocytes vandrar på coverglass ytan, där de kan vara svåra att upptäcka. Blodets förmåga att levra innebär aggregering av amebocytes och bildandet av ett extracellulärt klump av ett protein, coagulin, som frisätts från sekretoriska granuler av blodkroppar. Biokemiska analys av tvättade blodceller kräver att aggregering och degranulering inte förekomma, vilket kan uppnås genom att samla in blod i 0,1 volymer av 2% Tween-20, 0,5 M LPS-fri NaCl, följt av centrifugering av celler och tvätt med 0,5 M NaCl.

Protocol

Anatomiska funktioner i hästsko krabba relevant blödning (Fig. 1)

Figur 1

1. De tre stora divisioner av kroppen, från främre till bakre, är prosoma (P), den opisthosoma (O), och den mellersta stjärtfenan (T) ^1.
2. Främre och laterala fria marginaler prosoma är flänsen.
3. Den bakre-mest indrag av opisthosoma, där den mellersta stjärtfenan artikulerar, är terminalen Bay.
4. Det gemensamma var prosoma och opisthosoma artikulera är gångjärnet (H).
5. Hjärtat ligger längs ryggens mittlinje, precis under ryggskölden av prostoma och opisthosoma ² (Fig. 2).
   
   
   
   
   Figur 2
   
   

Allmänna överväganden, sterilitet och skydd mot exponering för lipopolysackarid (endotoxin)

1. Den största fiende framgångsrika utfall är cellens bildning exocytos och bildandet av coagulin koagulera. Cell aggregering och exocytos stimuleras av lipopolysackarid (alias, endotoxin, LPS), en produkt av gramnegativa bakterier. Tröskeln koncentration av LPS för exocytos tvättade celler är 0,1 - 1 mg / ml men celler svävande i plasma aktiveras genom betydligt lägre koncentrationer ^3. Endotoxin inte inaktiveras av autoklavering enkel och kan antas vara närvarande på ytor och i lösningar och reagens som inte är certifierade att endotoxin-fri.
2. För att minska risken för blodpropp under insamling av blod, välj bara perfekt, oskadade djur för blödning. Pre-chill djuren 1-2 h 4 ° C rum. Öva steril teknik. Undvik kontaminering med endotoxin.
3. LPS-fri 3% saltlösning används i klinisk medicin och kan köpas från medicinska leverantörer (se tabell över specialiserade reagenser och förbrukningsmaterial). LPS kan tas bort från glas och metall genom inkubation vid 180 ° C i 4 timmar. Sterila engångsbruk kanyler, Petri-rätter kultur och skruvkork centrifugrör är alla LPS-fria och kan användas utan modifiering så länge rätt steril teknik praktiseras.
4. Stabiliteten i blodceller av olika djur skiljer sig, med cellerna i vissa enskilda djur som genomgår spontan degranulering, vilket resulterar i bildandet av coagulin proppen, även när djuret blödde med största omsorg. Den blodkropparna andra enskilda hästsko krabbor är betydligt mer stabil och när lämpliga förfaranden följs står klart granulat under blödning och separation av celler från plasma.
5. Flera aktörer har rapporterats att stabilisera blodkroppar efter blödning, inklusive koffein (blöda på 0,25 volymer på 10 mm koffein i LPS-fri 3% NaCl) ^4, propranolol (1 mM slutlig koncentration) ^5, dimetylsulfoxid ^6, divalent katjon kelering ( blöda in i en lika stor volym 0,1 M dextros, 0,03 M natriumcitrat, 0,026 M citronsyra, 10 mm dinatrium Etylendiamintetraättiksyra (Na ₂ EDTA), pH 4,6) ^7, hämmare av G-protein och fosfolipas-C-vägar (kolera och pertussus toxiner, U73122) ^8, utbyte av klorid med isetionat anjon ^9, kloridkanal blockerare ^9, cykliskt AMP antagonister ^9, sulfhydryl reagenser (5 mm N-etyl maleimide, NEM) ^5, och membran-aktiva rengöringsmedel Tween-20 ( blöda på 0,1 volym 2% Tween-20 i LPS-fria 0,5 M NaCl).

Förbrukningsmaterial och reagenser för blödning hästskon krabba: samling av stora volymer av blod

1. en eller flera stora, oskadade hästsko krabba
2. sprutflaska som innehåller 70% etanol
3. Kimwipes
4. 14 gauge
5. robust tång
6. ishink med is
7. 50 mL skruvkork av plast för engångsbruk centrifugrör
8. rack för att hålla 50 ml rör
9. counter-top centrifug
10. steril 50 ml serologiska pipetter
11. lampa-typ pipett filler
12. sterila filter apparater
13. vakuumpump
14. LPS-fri 3% NaCl-lösning (för insamling av blodkroppar)
15. Tween-20 (för insamling av blodkroppar)

Förberedelser för stora volymer blödning

1. För blödning, använder stora, oskadade djur. Chill djuret för 1 timme i ett kallt rum innan blödning.
2. Upprätta ett bekvämt arrangemang med ett stabilt stöd för en is-skopa som är ca 0,3 meter hög (den disponibla frigolit container för utskick kallt eller frysta reagens är lämpligt) och en låg stol för operatören. I ishink placeras på stödstruktur och stolen drasupp till denna enhet. Du bör vara bekväm sittställning under en längre tid i stolen med armbågarna vilande på låren, och med vänster hand håller en kämpande hästsko krabba placeras ovanför blodprovsrör stöttade upprätt i en bädd av is i ishinken.
3. Pre-chill 4 - 6 av de 50 ml engångs tuber av plast centrifug med skruv nedläggningar i isbad. Rören vara upprätt i isen varierade runt omkretsen av isbad behållaren. Strax innan blödningen drift, ta bort kapsyler från rören och mössor plats på intilliggande bord, som ansluter sig till steril teknik.
4. Ta av locket på en 14 GA nål och använda robust tång för att lossa nålen i sitt fodral, men ta inte bort nålen från hylsan. UNDERHÅLLA sterilitet. Rör inte delen av nålen med fingrarna. Placera ärm med nål på en angränsande disken med den exponerade ändan av nålen förhöjda kontakt med någon yta att behålla sin sterilitet.
5. Fukta en Kimwipe med 70% etanol.

Blödning djuret (specifikt för högerhänt operatör)

1. Håll djuret för blödning: ta tag djur i vänster hand med fyra fingrar i kontakt med den främre fläns prosoma och tummen tag i bakre delen av opisthosma vid basen av svansen (terminalen Bay). Den ventrala yta djuret vänd mot handflatan. Den mellersta stjärtfenan ligger längs basen av tummen och projekt över handleden. Flex djuret försiktigt så att prosoma och opisthosoma är i rät vinkel mot varandra (figur 3a).
   
   
   
   Figur 3
   
   
2. Rengör utsatta gångjärnet gemensamma ansluta prosoma och opisthosoma med 70% etanol tillämpas med en etanol-fuktad Kimwipe (Figur 3b).
3. Vrid vänster hand så att fingrar 2 - 4 är översta och den dorsala ytan av djuret är vänd uppåt. Med höger hand, sätt in 14 GA injektionsnålen, fortfarande i sin skyddshylsa, mellan fingrar 2 och 3 i vänster hand. Ta pincetten i höger hand och dra bort nålen från sin skyddshylsa genom att greppa skurkar med pincett (Figur 3c). Vrid vänster hand så att dorsal yta av handen ansikten till vänster, tummen och pekfingret är uppe, och djuret upp och ner, med sin rygg ytan vänd mot höger hand. Placera ändan av nålen över den första av de 50 rören ml insamling och orientera djuret så att den vassa änden av nålen pekar på gångjärnen gemensamt och så att nålen axel är parallell med rygg mittlinjen (Figur 3d). Sätt in den vassa änden av nålen genom gångjärnet gemensamt till lumen i hjärtat, hålla nålen placeras parallellt med rygg mittlinjen och in vid mittlinjen och med ändan av nålen fortfarande placerad ovanför öppningen av provröret. Nålen sätts ca 1 - 2 cm djupt i den del av hjärtat i prosoma. Så fort hjärtat punkteras kommer blodflödet snabbt (figur 4a, pil), så det är viktigt att se till att leveransen slutet av nålen är placerad över mynningen av provröret för att samla denna första våg av blod.
4. Blod kommer ut ur hjärtat initialt i en kontinuerlig ström som, efter ca 30 - har 50 mL blod samlats in, kommer att minska till enskilda droppar (figur 4b). För att förbättra blodflödet, kan det vara god politik att åter orientera nålspetsen något. Luta nålen uppåt eller nedåt, åt vänster eller höger, skjut sin spets djupare in i hjärtat eller dra den till närmare gångjärnet gemensamt för att hitta den position som optimerar blodflödet. Komprimera inte djuret överdrivet, eftersom detta riskerar att skada djuret och kan leda till att extravaserats blodet att inleda koagulering.
   
   
   
   Figur 4
   
   
5. Eftersom varje provröret fylls med blod, rotera isbad för att få nästa tomma röret under leverans i slutet av nålen.
6. Som blödning bromsar, riskerar du att få luftflöde i retrograd riktning in nålen och in i hjärtat. Detta kan inträffa när djuret rätar ut, vilket minskar blodtrycket. Försök att förhindra detta genom att hålla djuret i den böjda ställning eller genom att räta ske långsamt.
7. När djuret slutar att ge blod, ta bort blödningen nålen från hjärtat. Re-cap insamling rören och centrifugera direkt i bordsskivan centrifug, 1000 RPM, 5 min. Blodkropparna bildar kompakta pellets vid botten av samlingen rören. Eftersom alla komponenter för blodproppar finns inom sekretoriska vesiklar av blodkroppar, så snart som plasma separeras från cellerna,risken för koagulering av plasma elimineras.
8. Det är absolut nödvändigt för att undvika koagulering av extravaserats blod. Följande åtgärder minskar risken för blodpropp: Pre-kylning djuret och underhålla samlingen rören i ett isbad, skonsam hantering av djur, minskning av den snabbhet med vilken blodet rinner ut ur nålen, centrifugering av blodet omedelbart efter insamling, förhindrande av förorening av nålar och slangar samling med endotoxin, underhåll av sterila förfarande. Som nämnts ovan, vissa enskilda djur har särskilt irriterad blodkroppar som initierar exocytos även när dessa försiktighetsåtgärder följs.
9. Efter centrifugering, inspektera rören efter tecken på blodproppar - delar av celler och gelatinös propp material fäst väggarna i röret, gelatinös material på toppen av proppen, eller ännu värre, stora mängder koagulera med anhållna blodkroppar i vätska kolumn (Figur 4c, pil). Materialet från dessa rör serum, inte plasma och innehåller utsöndras produkter av blodkroppar.
10. Överför plasma till sterila rör med 50 ml steril serologisk pipett. Var försiktig vid pipettering för att undvika aspirerande någon av celler från cellpelleten i botten av röret. Det är bäst att lämna några ml plasma ovan pelleten att undvika att störa cellpelleten.
11. Det förfarande som beskrivs ovan är utformad för att samla in stora volymer av plasma förorenat av sekretoriska produkter av blodkroppar. Att samla in stora volymer av tvättade blodceller, samla upp blodet till 0,1 volymer på 2% Tween-20 upplöst i 3% LPS-fri NaCl lösning. Centrifugera cellerna försiktigt i 10 minuter att upprätta en lös cellpellet, tvätta sedan cellerna med flera förändringar av LPS-fri 3% NaCl. Ett utdrag av de celler som innehåller sekretoriska produkter av blodceller kan framställas genom lysering de tvättade cellerna i LPS-fritt destillerat vatten. Detta lysat innehåller en mångfald av proteiner och peptider som verkar i bakteriedödande immunförsvaret ^10,11 och innehåller även coagulogen, den zymogen formen av proteinet i den extracellulära blodpropp, och insamlingen av proteaser som omvandlar coagulogen till coagulin, form av det protein som polymerizes i fibriller av proppen ^12. Detta extrakt liknar den kommersiellt tillgänglig produkt, Limulus amebocyte lysat eller LAL, som används för att analys av förekomst av lipopolysackarid ^13. Den proteas kaskad ansvarig för proteolytiska ändring av coagulogen till coagulin aktiveras av LPS ^14.
12. Disposition av djur efter avblodning. Blödning utförs av de metoder som anges ovan tolereras väl av djuret. Vid arbete på den marinbiologiska laboratorium i Woods Hole, återvänder jag djur till havet efter blödningen med förväntningen att de kommer att överleva. Om djur hålls i akvarier långt från det normala utbudet av hästsko krabbor, kan de blödde flera gånger en eller två gånger i månaden. Som beskrivs nedan, djur hålls i fångenskap kräver vatten av hög kvalitet och frekvent utfodring för att bibehålla sin hälsa. Eutanasi kan åstadkommas genom förstörelsen av rygg ganglion, som ligger i den dorsala mittlinjen mellan ögonen.

Bearbetning och lagring av plasma

1. Skydd mot proteaser. Om plasma är att användas för proteinrening bör den behandlas med proteashämmare omedelbart efter samlingen. Lägg phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF) till en slutlig koncentration av 1 mm. PMSF hålls som en 0,1 M stamlösning i DMSO och etanol. Det är ganska instabilt i vatten ^15, så kan inte åberopas för långvarigt skydd, men förutom omedelbart efter separation av plasma från blodceller inaktiverar de små mängder proteaser som kan ha släppts ut från cellerna.
2. Steril filtrering: sterilisera plasma genom ultrafiltrering under vakuum med hjälp av en disponibel medellång filtrering enhet utrustad med en 0,22 mm por filter. Dessa filter har en tendens att täppa. Det är lämpligt att centrifugera plasma innan det filtreras för att reducera detta problem. Om stora mängder plasma behandlas, är det lämpligt att förfilter plasma först med hjälp ett Millipore filter med 1 mm porstorlek, sedan med en 0,45 mm porstorlek Millipore filter.
3. Plasma kan skyddas från bakteriell kontamination antingen genom att lägga NaN ₃ till en slutlig koncentration av 0,2 mg / ml eller med steril filtrering. Osterila plasma ska aldrig förvaras under längre tid än 2 dagar utan det ena eller det andra av dessa anti-bakteriell åtgärder vidtas.
4. Blodproppar. Till skillnad från däggdjur förmåga att levra innehåller Limulus plasma ingen av de element för blodproppar. Istället hela maskiner för koagelbildning, den strukturella proteinet av proppen (coagulogen) och systemet med proteaser den processen coagulogen att göra det kan polymerisation i olösliga levra sig, finns i sekretoriska granula av blodceller ^16. Så om det blodkropparna tas bort innan de har en chans att genomgå exocytos är plasma helt fri från proteiner för koagulering och förblir flytande på obestämd tid.
5. Protein rening. Hemocyanin är närvarande vid 40 mg / ml i plasma och en 48-Mer av en 70 kDa subenhet. Det kan isoleras genom ultracentrifugering (40.000 X g, 8 h) eller gel filtrering med en stor porstorlek utanförskap kåda som Biogel A5m ^17. C-reaktivt protein är närvarande vid 1 - 5 mg / ml och kan isoleras genom släktskap isolering på phosphorylethanolamine-Sepharose, med upplösning med en kalcium kelator ^18. Det breda spektrum proteashämmare, en _{2-macroglogulin} har renats genom gelfiltrering på Sephacryl S-300 harts efter hemocyanin och C-reaktivt protein har tagits bort ^19.

Mikroskopisk undersökning av rörliga blodkroppar i kultur

1. Etablering av amebocyte gräsmattor in vitro: LPS-fri 3% NaCl-lösning tillsätts steril plast Petri stil kultur maträtter (1 ml för en 35 mm maträtt, 2,5 ml för en 60 mm maträtt, 6 ml för en 90 ml maträtt). Blod erhålls sedan från hjärtat med hjälp av den metod som beskrivs ovan, men med den ändringen att en 23 gauge, 1 i steril spruta nål används i stället för de 14 gauge nål. Blod rinner drop-by-drop från 23 gauge kanyl och en droppe samlas in i 35 mm skålen, 3 droppar in i 60 mm skålen och 9 droppar i 100 mm skålen. Den blodkropparna är sedan blandas jämnt i 3% NaCl-lösning genom att försiktigt snurra, först i ett cirkulärt mönster, sedan tillbaka-och-tillbaka. Beredningen är inkuberas i 5 min vid rumstemperatur T att låta blodkroppar att fästa skålen ytan, då den första saltlösning ersätts med en buffert av valet ^3.
2. Om man vill bibehålla underlaget-anslutna blodkroppar i en undegranulated skick, den första saltlösning-blodplasma blandning ersätts med färska LPS-fri 3% NaCl. Plasma påskyndar spontana degranulering av blodceller, även i frånvaro av LPS och dess borttagande stabiliserar undegranulated tillståndet i cellerna.
3. Om den ursprungliga saltlösning ersätts med steril plasma, blodkroppar omvandlas från den ovala formen av cirkulerande blodkroppar (bild 5) och platta på underlaget, och sedan initiera degranulation och bildandet av ett lager av coagulin extracellulära blodpropp ovanför gräsmattan tillplattade amebocytes ^20.
   
   
   
   Figur 5
   
   
4. Inrättande av Explantation kulturer av aggregerade amebocytes. När blodet samlas under sterila, LPS-fria förhållanden, blodkroppar lösa ut från fjädring och samlade för att bilda en vävnad-liknande massa. En praktisk behållare för detta är glaset embryot maträtten gjorde LPS-gratis genom inkubation under 4 timmar vid 180 ⁰ C. Blod som samlats i denna behållare från hjärtat med hjälp av en 19 gauge nål inkuberas under 1 - 2 h vid rumstemperatur T, sedan bitar 1 mm stora skärs från amebocyte samlade med en steril 18 gauge injektionsnålen och är inneslutet mellan två täckglas eller en coverglass och en bild åtskilda av fragment av täckglas att fungera som distanser. Efter ungefär en halvtimme börjar amebocytes migrerar från utkanten av Explantation på coverglass (bild 6a), där de kan ses med faskontrast eller DIC optik ^21. Inledningsvis den vandrande cellerna är kompakta med hyaline pseudopods (Fig. 6b (m)) som är förlängd över migration underlaget, och som sedan sänks i kontakt med ytan och framåt innebär att flödet av granulat cytoplasman i pseudopod ²² . Senare cellerna platta (Fig. 6b (f)) och initiera degranulation (Fig. 6b (d)) och upphöra förflyttning ^23. Kulturen kammaren som beskrivs här tillåter genomblödningen i olika experimentella agenter i den kultur kammaren för att undersöka deras effekter på cell motilitet och granulat exocytos ^9. En utökad metodologiska genomgång av amebocyte kultur för mikroskopisk undersökning finns i ^24.
   
   
   
   Figur 6
   
   

Underhåll av vuxna hästsko krabbor i akvarier

Hästsko krabbor kräver hög vattenkvalitet havet och kan hållas i akvarier försedd med ett vattenreningssystem som ger partikel filtrering, luftning, och denitrifikation av vattnet ^25. Djuren bör utfodras 2 eller 3 gånger i veckan på räkor, hummer, fisk eller bläckfisk. Utfodring sker genom att ta bort djuret från akvariet, PLAsiering den på sin rygg, och släppa ut livsmedlet på munnen. Om hungrig, kommer djuret börjar snart svälja maten. Beroende på sofistikerade havsvattnet, bör djuret behållas för en timme eller så tills det avföring i en separat behållare med vatten eller den kan återföras till akvariet efter utfodring har börjat. För långsiktiga underhållet ska djuret hållas borta från ljus för att förhindra tillväxt av gröna eller blå-gröna alger på ytan av ryggskölden. Alger urholka ryggskölden och eftersom vuxna inte molt, kommer detta leda till döden för djuret ^26. I det vilda djuren tillbringar mycket av tiden delvis nedgrävd i sanden, men sand eller grus i akvariet presenterar en svårighet att upprätthålla den nivå av renlighet viktigt för långsiktigt underhåll.

Discussion

Det finns fyra arter av hästsko krabba, Limulus Polyfemos från den östra kusten av Nordamerika och tre arter som sträcker sig från Japan till Bengaliska viken. Djuret identifieras som ett "levande fossil" eftersom anatomiskt liknande former har hittats som fossil från 445 miljoner år sedan ^27. Hästskon krabba representerar ett långlivat djur, som kräver 10 till 13 år att nå mognad och leva minst 20 år ^28. Även om det har utsatts för omfattande avverkning som bete för ål och conch fiske ^29, är den amerikanska hästsko krabba fortfarande någorlunda riklig och tillåter icke-destruktiv samling av 50 mL blod från en liten vuxen och så mycket som 400 ml från en stor hona. Insamling av även denna mycket blod kan fyllas i på mindre än 10 minuter. Jag vet ingen annan lättillgänglig ryggradslösa som ger så mycket blod med så liten ansträngning.

Vikten av LAL-test för endotoxin, en indikator för förekomst av gramnegativa bakterier, har stimulerat intresset i immunsystemet av hästsko krabba ^13. Lal provas beror på aktiveringen av den initierande proteas av blodets förmåga att levra av LPS ^14, med en avläsning av koagelbildning eller en kolorimetrisk assay för proteas aktivitet. De två delarna av immunitet som har fått störst uppmärksamhet har proteiner i plasma och flera proteiner och peptider i sekretoriska granuler av blodkroppar. Resultatet har blivit höjden av hästskon krabba till statusen av att ha de bäst beskrivas immunsystemet för långlivat ryggradslösa ¹¹