Summary
이것은 갓 태어난 새끼 쥐의 우수한 경추 신경 (SCG)에서 기본 교감 신경을 분리하고 문화하는 방법을 설명하는 프로토콜입니다.
Abstract
쥐에서 우수 자궁 경부 신경 (SCG)은 교감 신경을 포함 작은 광택, 아몬드 모양의 구조입니다. 이들 뉴런은 머리와 목 지역에 대한 공감 innervations를 제공하고 그들은 잘 특징과 비교적 균질 인구 (4) 구성합니다. 교감 신경이 NGF의 가용성은 그들의 문화와 실험 조작 (2, 3, 6)을 용이하게 생존, 분화 및 axonal 성장과 넓은 확산에 대한 신경 성장 인자 (NGF)에 따라 달라집니다. 이러한 이유로, 교양 교감 신경이의 연결을 개발 및 분화, 프로그램 및 병리 학적 세포 죽음의 메커니즘 및 신호 전달 (1, 2, 5, 6)를 포함하여 연구의 다양한 사용되었습니다. 신생아 쥐 및 culturing 교감 신경에서 SCG를 해부하는 것은 매우 복잡하지 않으며 매우 빠르게 마스터하실 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 신생아 쥐 새끼에서 SCG을 해부하다하고 교감 신경의 문화를 확립하기 위해 그들을 사용하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 문서는 또한 준비 단계와이를하는 데 필요한 다양한 시약과 장비를 설명합니다.
Protocol
1. 해부를위한 준비 :
- 적절한 문화 실험의 성격에 따라 접시 (10cm 또는 6 - 글쎄 또는 24 - 잘 접시 등) 및 외투들을 쥐 - 꼬리 콜라겐 24시간 절개 전에로를 선택합니다. 쥐 - 꼬리 콜라겐을 준비하고 외투 문화 요리에 사용하기위한 방법은 (1) 다른 설명했습니다.
- 인산염의 0.25 % 트립신의 솔루션을 준비 호수 (PBS) (없음 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))와 필터 소독이 버퍼. -20 º C. 1 ML aliquots 및 상점 준비
- 소주 / deionized H 2 O. 2.5 MM 유리딘 각각 5 - FDU를 포함하는 솔루션을 준비 필터 - 소독 50 μl aliquots를 준비합니다. -20 º C.에 저장
- 10 %의 열 inactivated 말 혈청 (열 30 분 56 º C waterbath의 잠복기에 의해 inactivate)와 5% 태아 소 혈청과 RPMI 1640 배지 : 완전한 매체를 준비합니다.
- 최종 중간 준비 : 1 %의 열 inactivated 말 혈청 + NGF (100ηg/ml 최종 농도) + 페니실린 / 스트렙토 마이신 (1 / 250) + 250분의 1 uridine/5-FDU 솔루션 RPMI 1640 배지 (10 μm의 최종 농도) . 참고 : 매번 사용하기 전에이 매체는 신선한까지하여야한다. 24 웰 플레이트 형식의 실험, 이러한 매체 12 ML 준비를해야합니다. 그것은 당신이 약간 여분을 준비하는 것이 좋습니다. NGF는 상업 다양한 소스 (이 프로토콜의 끝에 표 참조)에서 구입할 수 있습니다.
- 장비 : 하나는 해부 현미경과 광원이 필요합니다. 초점 팁을 듀얼 구스넥 광섬유 조명기을 선호합니다. 스테인레스 포셉을 마이크로는 - 해부 두 켤레와 해부 가위 (또한 스테인레스 스틸 : 또한, 하나는 (autoclaving 또는 최소한 20 분 동안 70 %의 에탄올에 몸을 담글 수로) 다음과 같은 해부 도구를 청소하고 소독해야합니다 그리고 Roboz에서 모두). 두 무균 주사기 바늘은 (26 gague X 1 ½ 인치 또는 이와 유사한 것)도 필요합니다. 그것은 알루미늄 호일에 싸여 Kimwipe으로 덮여 스티로폼의 3 "X3"조각 해부 보드를 설정하는 것이 필요합니다. 오염을 제거하다 70 %의 에탄올과 보드를 스프레이. 마지막으로, 불타는 광택 유리 파스투레 피펫을 준비합니다. 회전하는 동안 화재 - 폴란드어하기 위해, 유리 피펫을 가지고 몇 초 동안 불꽃의 팁을시오. 검사시 팁은 매끄러운 모양과 개방이 좁아 것입니다. 이것은 세포가 dissociated 될 단계가 필요합니다. 피펫은 멸균 남아 있도록 세포 배양 후드에 불을 연마를 수행합니다.
2. 우수한 자궁암 신경의 해부 :
- 연령 P0 또는 P1의 아르 신생아 쥐의 새끼를 수집합니다.
- 신속하게 오염의 가능성을 줄이기 위해 70 %의 에탄올과 해부를위한 강아지를 닦아냅니다.
- 신속하게 가위 날카로운 쌍 (이 단계는 동영상에 표시되지 않습니다)와 새끼 목을 베다. 간단히 초과 혈액을 유출하기 위해 멸균 거즈에 대한 살균 집게를 사용하여 머리를 잡아.
- 최대 직면하고있는 복부 측면과 당신을 향한 지향 꼬리 끝에있는 해부 패드에 머리를 놓으십시오. 절단 기관은 쉽게 볼 수 있습니다. 패드에 입천장하지만 한 핀을 밀어와 패드로 절단기도하지만 두 번째 핀을 눌러 다음 방법으로 해부 패드로 잘린 머리를 확보하기 위해 멸균 주사기의 바늘을 사용합니다. 해부 현미경으로 패드를 장소와 절개를 시작합니다.
- 두 포셉 (각 손에 한)기도 주위 치워 피부와 지방을 사용하여 너무 깊이 가지 않도록주의한다. 이렇게하면 기관의 양쪽에 서로 거의 평행 실행 근육의 한 켤레를 노출합니다. 참고 : 해부하는 동안, 당신이 추위 멸균 PBS 또는 추위, 과도한 혈액을 멀리 세척하고 지역 깨끗하고 촉촉한 유지 살균, 파스퇴르 피펫과 함께 제공되는 혈청 무료 RPMI 1640 배지와 관개해야합니다. 이것은에 따라 단 한 번 이상 할 수 있습니다 얼마나 빠른 걸로 작동합니다. 경험 해부학자 들어, 신경 한 켤레를 해부하다에만 대해 두 3 분 걸립니다.
- 첫 번째 측면에있는 근육을 절단하고 제거하는 포셉을 사용합니다.
- 근육이 제거되면, 경동맥이 표시됩니다. 종종 그것은 밝은 분홍빛이 도는하고 혈액을 포함하고 있습니다. 그것은 당신이 주변에서 볼 수있는 다른 혈관보다 색상의 가벼운 나타날 수 있으며 이런 이유 경동맥 바로 눈에 띄지 않을 수도 있습니다. 이 동맥은 "Y"모양의 리본 생겼는지으로기도와 bifurcates 함께 실행됩니다. 이 분기점은 중요한 이정표이며이있는 한, 그것은 SCG를 찾을 상대적으로 쉽게됩니다.
- 가장 꼬리 끝에있는 동맥을 끊어와 포셉 (상대방이 여전히 연결된)를 약간 들어올려. 일단 이렇게, 당신은 thr 느슨하게 단지 분기점의 시점에서 동맥에 붙어 있으며 조직의 아몬드 모양, 광택 찾고 작은 질량을 가지고 볼 수 있습니다사전 및 / 또는 사후 ganglionic connectives EAD 같은. 이것은 우수한 경추 신경절이다. 부드럽게 감기, 혈청 무료 RPMI 1640 매체를 포함하는 작은 문화 요리 (35 ㎜)에과 장소를 분리하는 반면에 포셉의 두 번째 쌍을 사용합니다.
- 다음, 같은 프로토콜을 다음과 같은 기관의 다른 측면에 신경을 압축을 풉니다.
3. 신경 청소 :
- 일단 모든 신경이 밖으로 해부되었습니다, 그들은 최대한 관계없는 조직을 해제해야합니다.
- 해부 현미경 아래에서, 당신은 신경이 경동맥, FAT 또는 기타 조직의 조각을 첨부 것을 볼 수 있습니다. 이러한 불필요한 물질을 멀리 애타게 각 손에 집게와 함께 작동합니다. 장소는 RPMI 1640 매체를 포함, 살균 15ml 원뿔, 폴리 프로필렌 튜브에 신경을 청소.
- 사전 및 / 또는 사후 ganglionic connectives도 멀리 줄어들 수 있습니다. 각 신경절은 약 1 만 뉴런 있습니다. 뉴런은 도금되면, 그들은 neurites를 regrow 것입니다.
4. 교감 신경의 문화를 구축 :
- 이분에 대한 200xg에 신경을 원심과 뜨는 폐기하십시오.
- 0.25 %의 트립신 솔루션의 0.5-1 ML에 신경을 Resuspend. 30 분 37 ˚ C waterbath이나 보육에 놓습니다. 이것은 신경의 세포를 떼어 놓다 도움이 될 것입니다.
- 30 분 후에 밖으로 희석 2 분 200xg에서 트립신과 원심 분리기를 무력화하기 위해 완전한 중간의 10 ML를 추가합니다.
- 뜨는 최종 중간 2 ML에 resuspend 폐기하십시오.
- 더욱 불을 광택 유리 파스투레 피펫으로 신경을 위아래 triturating하여 세포를 떼어 놓다. 신경 20 번 씹다하고 몇 분 동안 얼음에 튜브를 놓으십시오.
- 한편, (약 3분의 2 1 / 2mm 지름) 자리가 좁아하기 위해 더 많은 화재 - 폴란드어 피펫. 그것이 냉각까지 몇 분 기다려 20 배 더 신경을 씹다. 계속으로, 매체는 점차적으로 cloudier 세포 dissociated되고있다는 것을 나타내는 될 것입니다. 한 두 번 더 세포 분열시키다 얼마나 잘에 따라이 단계를 반복합니다. 시간 후, 당신은 모든 신경은 뉴런에 dissociated하고 더 완전한 신경은 튜브에서 볼 수없는 것을 통지합니다. 교제를 끊다되지 않습니다 일부 조직 물질이있을 수 있습니다. 이 시점에서 어떤 undissociated 파편이 바닥에 해결 할 수 있도록 튜브가 몇 분 동안 얼음에 앉아 보자. 이제 조심스럽게 다른 튜브에서 최고의 장소에서 거의 모든 매체를 수집합니다. 당신이 undissociated 파편을 수집하지 않도록하기 위해 튜브의 하단에있는 약 50 μl를 떠나. dissociated 세포를 포함하는 튜브에 최종 매체를 더 추가 :이 볼륨 문화 플레이트 하나가 문화에 신경을 사용하는의 종류에 따라 다릅니다. 예를 들면 다음과 같습니다 잘 따라 최종 매체의 0.5 ML에 잘 당 24 잘 요리가 직업이있다면, 그때 플레이트 0.5 신경 (물론 당 ~ 10,000 뉴런). 전형적인 쥐 쓰레기는 24 신경 줄 래요 12 새끼,로 구성되어 있습니다. 이 종자 일 24 잘 플레이트 및 최종 중간의 총 부피 12 ML입니다 충분하다. 참고 : 신경이 문화에 제공됩니다 glia와 다른 세포 유형의 작은 인구에도 포함되어 있습니다. 최종 매체 Uridine/5-FDU를 사용하면 자신의 확산을 방지하고 그들의 죽음을 촉진합니다.
- 피드 세포 신선한 RPMI 1퍼센트 말 혈청 + NGF와 uridine/5-FDU과 함께 매체의 2 / 3를 대체하여 모든 48시간. 참고 : 처음에는 문화가없이 neurites와 둥근 모양 교감 신경이 포함되어 있습니다. 짧은 neurites는 절개 후 보이는 24 시간이되고 점차적으로 밀도가 더 시간이 지남에 따라 분기가됩니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
우리는 우리의 문화 스프 라그 돌리 쥐를 사용합니다.
신경 청소 때 시간과주의를 가져가라. 모든 파편, 혈관과 지방을 제거합니다. 이 단계는 더 많거나 적은 균일한과 관계없는 세포 종류의 무료 문화 확보에 중요합니다. uridine/5-FDU의 추가는 크게 문화를 오염 나머지 (mitotic) 이외의 연결을 세포를 제거하거나 적어도 증식을 억제합니다.
또한, 분리 단계 동안 인내심을하고는 접시에 씨앗되면 그들이 큰 대단히 짧은 시간에 발견되지 않도록 신경을 분리하는 시간을 가지십시오. 세포 큰 대단히 짧은 시간을 갖는 것은 좋은 실험 결과를 얻을 수 없습니다. 예를 들어, 대형 대단히 짧은 어려운 뉴런이 transfected 또는 감염 될 수 있도록합니다. Immunostaining도 방해 할 수 있으며 뉴런을 계산 필요한 모든 실험뿐만 아니라, 수행하기 어려울 것입니다.
그것은 문화가 공급 아르 펜 / strep 모든 시간과 매체를 보완하기 위해 필요는 없습니다. 세포 도금 아르 펜 / strep 첫번째 시간 또한 충분합니다. 매체가 교환 때마다 매체에 신선한 uridine/5-FDU를 추가하려면 어떻게합니까.
우리는 NGF - 철수에 대한 응답으로 apoptosis를 공부 공감의 연결 문화를 사용해 왔습니다. 예를 들어, Biswas 외 인치 2007 (2) 교감 신경은 apoptosis를 추진에서 중요한 역할을 여러 분자에 대한 shRNA와 transfected되었습니다. Deckwerth 외. 1996 (5) 프로 apoptotic 유전자, 백스을 부족한 wildtype 마우스 및 마우스에서 교감 신경을 사용했습니다. 그들은이 뉴런들은이 NGF 박탈하는 경우 작동 방법에 봤어요. Biswas 외에서 그림 6. 2007 (2) Deckwerth 외에서 그림 3. 1996 (5) 표시 transfected 및 비 - transfected 공감의 연결을 문화는 각각 어떻게 보이는지.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
NZ, 동정 뉴런을 해부하고 수확에서 그녀를 훈련 연구소 회원 Subhas Biswas, 앤드류 스프 라울, 그리고 라이언 윌렛 감사하고 싶습니다. NIH - NINDS에서 교부금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Forceps, Stainless steel #5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS4976 | |
| Scissors, DEAVER straight sharp-blunt- 43mm blades - 5.5 | Tool | Roboz Surgical Instruments Co. | RS6760 | |
| RPMI 1640 w/ L-Glutamin | Reagent | Cellgro | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | SAFC Global | 12103c | |
| Donor Horse Serum | Reagent | JRH Biosciences | 12449 | Heat-inactivate by incubating in 56°C waterbath for 30 minutes. |
| Penicillin/streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Trypsin without EDTA | Reagent | Difco Laboratories | MT 25-050-CI | |
| Uridine | Reagent | Sigma-Aldrich | U3003 | |
| 5-Fluoro-5’ deoxyuridine | Reagent | Sigma-Aldrich | F-8791 | |
| NGF | Reagent | Harlan Laboratories | BT-5025 | |
| Dissection Microscope and light source | Microscope | |||
| 15 ml polypropylene tubes | Tool | BD Biosciences | 352096 | |
| Cell culture dishes | Tool | Corning |
References
- Banker, G., Goslin, K. Culturing Nerve Cells. , MIT Press. (1998).
- Biswas, S. C., Shi, Y., Sproul, A., Greene, L. A. Pro-apoptotic Bim Induction in Response to Nerve Growth Factor Deprivation Requires Simultaneous Activation of Three Different Death Signaling Pathways. The Journal of Biological Chemistry. 282 (40), 29368-29374 (2007).
- Bocchini, V., Angeletti, P. U. The Nerve Growth Factor: purification as a 30,000-molecular-weight protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (64), 787-794 (1969).
- Dechant, G. Chat in the Trophic Web: NGF Activates Ret by Inter-RTK Signaling. Neuron. 33 (2), 156-158 (2002).
- Deckwerth, T., Elliott, J. L., Knudson, C. M., Johnson, E. M., Snider, W. D., Korsmeyer, S. J. Bax is required for neuronal death after trophic factor deprivation and during development. Neuron. (17), 401-411 (1996).
- Greene, L. A. Quantitative in Vitro Studies on the Nerve Growth Factor (NGF) Requirement of Neurons - I. Sympathetic Neurons. Developmental Biology. (58), 96-105 (1977).
- Park, D. S., Morris, E. J., Padmanabhan, J., Shelanski, M. L., Geller, H. M., Greene, L. A. Cyclin-dependent kinases participate in death of neurons evoked by DNA-damaging agents. The Journal of Cell Biology. 143, No 2 457-467 (1998).
- Pierchala, B. A., Ahrens, R. C., Paden, A. J., Johnson, E. M. Nerve Growth Factor Promotes the Survival of Sympathetic Neurons through the Cooperative Function of the Protein Kinase C and Phosphatidylinositol 3-Kinase Pathways. The Journal of Cell Biology. 279, No 27 27986-27993 (2004).
