Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Die Erstellung extrachromosomaler DNA-Arrays durch Mikroinjektion -- die einfachste Methode zur Erzeugung transgener Wurmstämme -- führt zu genetischen Elementen, die während der Zellteilung nicht stabil übertragen werden und daher variable Vererbungsraten und Expressionsniveaus aufweisen. Ziel der Integration des Arrays in ein Chromosom ist es, diese genetische Instabilität und Variabilität zu mindern.
Beginnen Sie dazu mit einer alterssynchronen Population von transgenen L4-Würmern, die tragen eine extrachromosomale Anordnung zuvor durch Mikroinjektion eingeführt und lassen sie zu gravid Erwachsenen wachsen. Übertragen Sie diese Erwachsenen auf neue Platten und lassen Sie sie Eier legen, bis es mindestens 30 Eier auf jeder Platte. Entfernen Sie die Erwachsenen und lassen Sie die Eier wachsen, bis sie das L4-Stadium erreichen. Dann bestrahlen Sie die Würmer mit UV-Licht. Dies verursacht zufällige Doppelstrangbrüche in der genomischen DNA, wo die DNA-Würmer Reparieren.
Nach einer nächtlichen Erholungsphase zählen Sie die Anzahl der überlebenden Würmer. Ein kleiner Prozentsatz der toten Würmer weist auf eine effiziente Bestrahlung hin. Beobachten Sie nachfolgende Generationen, um homozygote integrierte transgene Leitungen zu isolieren. Im Beispielprotokoll werden wir eine hohe Übertragungsrate extrachromosomalen Arrays mit einem fluoreszierenden Koinjektionsmarker integrieren, der im Rachen ausgedrückt ist.
- Bewerten Sie die Übertragungsrate der zu integrierenden transgenen Linie. Wählen Sie für jede transgene Linie 10 fluoreszierende Gravid-Erwachsene auf 10 separate Kulturplatten unter einem fluoreszierenden Stereoskop. Kultur der Tiere in einem Wurm-Inkubator, die auf eine Temperatur eingestellt sind, die zur Reproduktion des genetischen Hintergrunds zulässig ist.
Überwachen Sie die Nachkommen schaft jeden Tag, um zu bewerten, in welchem Entwicklungsstadium der Co-Injektionsmarker exprimiert wird und am besten beobachtet werden kann. Bewerten Sie mit der fluoreszierenden Stereoskopie die Übertragungsrate der Nachkommen, indem Sie den Prozentsatz der fluoreszierenden Nachkommen ungearten bestimmen. Für die Transgenintegration wählen Sie die transgene Linie mit der höchsten Übertragungsrate aus.
Erhalten Sie eine Population von transgenen Tieren synchronisiert in der L4 Larven-Stufe für die Integration. Wählen Sie 30 fluoreszierende gravid Erwachsene auf fünf Kulturplatten. Nachdem die Würmer Eier für drei bis vier Stunden bei 15 Grad Celsius gelegt haben, überprüfen Sie das Vorhandensein von mindestens 30 Eiern durch Platte, und dann, beseitigen Sie die Erwachsenen von den Platten.
Kultur die Tiere in einem Wurm-Inkubator, bis die Nachkommen das L4-Larvenstadium erreichen. Legen Sie jede Platte mit 15 bis 20 fluoreszierenden transgenen L4-Tieren in einen UV-Verklinker mit entfernten Deckeln. Bestrahlen Sie die Würmer.
Zur Genesung die bestrahlten Würmer über Nacht bei 15 Grad Celsius inkubieren. Prüfen Sie die Anzahl der lebenden Tiere. In unseren Händen ist eine Überlebensrate von etwa 80% bis 90% für eine effiziente Bestrahlung adaptiv. Wachsen Sie die bestrahlten Tiere bei 15 bis 25 Grad Celsius, bis die Nachkommen die Entwicklungsstufe erreicht haben, die die Beobachtung der Co-Injektionsmarker-Expression ermöglicht.
