Eletroforese de gel bidimensional

Eletroforese de gel bidimensional, ou 2D, é uma técnica que utiliza dois métodos distintos de separação que podem separar milhares de proteínas de uma única mistura. Uma das técnicas, SDS-PAGE ou sódio dodecyl sulfate poliacrilamida gel electrophoresis, não pode separar totalmente misturas complexas sozinhas. A eletroforese de gel 2D acopla o SDS-PAGE a um segundo método, foco isoelétrico ou IEF, que se separa com base em pontos isoelétricos, permitindo a resolução de potencialmente todas as proteínas em um lise celular. Este vídeo mostrará os princípios da eletroforese de gel 2D, um procedimento geral e algumas de suas aplicações biomédicas.

A eletroforese de gel 2D começa com o IEF como a primeira dimensão. Toda proteína tem um valor de pH, chamado de ponto isoelétrico ou i PI, onde a carga líquida é zero. Quando uma proteína é submetida a um campo elétrico, ela se move em direção ao eletrodo com carga oposta. Amostras de interesse são carregadas em gradiente de pH imobilizado, ou IPG, tiras que têm amfolitos incorporados, moléculas contendo grupos ácidos e básicos. Um campo elétrico é então aplicado na tira de gradiente de pH, fazendo com que as proteínas migrem até atingirem o valor do pH que corresponde ao seu iPI, onde perdem sua carga líquida.

Antes de executar a segunda dimensão, as proteínas incorporadas são tratadas com SDS, desnaturando-as e fornecendo uma carga negativa uniforme. Uma vez concluídas, as tiras IPG são colocadas em um gel de poliacrilamida. Um campo elétrico aplicado atrai as proteínas em direção ao ânodo, com proteínas maiores movendo-se mais lentamente através do gel.

Uma vez que a mistura de proteínas tenha sido separada de acordo com o iDO e o peso molecular, o mapa proteome é visualizado usando manchas, e proteínas de interesse são identificadas.

Agora que discutimos os princípios da eletroforese em gel 2D, vamos passar por cima de um procedimento laboratorial típico.

Antes que o experimento possa ser realizado, as proteínas devem ser solubilizadas na mídia. A solubilização da amostra é obtida pela desagregação de proteínas com uma combinação de agentes chaotrópicos para interromper interações de ligação de hidrogênio, detergentes noniônicos para evitar a alteração da carga das proteínas, reduzindo os agentes para quebrar ligações de desulfida e tampões. Para remover proteínas abundantes e outras moléculas, o material é extraído sequencialmente por centrifugação e coleta da pelota resultante; seguida do tratamento com endonuclease, enzima usada para consumir qualquer DNA que interferisse no experimento.

Uma vez solubilizadas as proteínas, as tiras de IPG são preparadas enxaguando com uma solução de limpeza de tiras e deixadas de cabeça para baixo para secar. Cada tira é então atribuída a um número de suporte de tira. Uma vez pronto, o extrato celular é carregado nas tiras em um movimento lento e deslizante do negativo para o lado positivo. Para fins de reidratação, o papel de mancha úmida é colocado em cima do eletrodo e sob as tiras de gel; as tiras IPG são então forradas no instrumento IEF. Uma alta corrente elétrica é aplicada, e as proteínas começam a migrar.

Após a conclusão da primeira dimensão, o gel para SDS-PAGE é preparado em um aparelho de fundição. As tiras IPG são tratadas colocando-as de frente para baixo no buffer de equilíbrio contendo SDS. A unidade de eletroforese é readied com a adição de tampão de eletroforese. As tiras de IPG tratadas são coletadas com pinças, colocadas em cima das placas de gel, e seladas com solução de vedação de agarose. Uma fonte de tensão então aplica um campo elétrico, que é mantido até que as proteínas em movimento mais rápido estejam a 1 cm da parte inferior do gel.

Após a conclusão da eletroforese, as proteínas devem ser visualizadas. Tradicionalmente, isso é realizado por coloração com nitrato azul coomassie ou prata. Proteínas de interesse podem ser transferidas do gel, e analisadas pela análise de manchas ocidentais.

Uma segunda abordagem de identificação envolve a excisão das proteínas do gel, digerindo-as, do que analisá-las por espectrometria de massa.

Agora que revisamos um procedimento, vamos ver alguns dos usos para eletroforese em gel 2D.

Um dos usos mais comuns para essa técnica é a identificação de moléculas envolvidas na iniciação e progressão da doença. A eletroforese de gel 2D, juntamente com a espectrometria de massa, pode detectar a regulação de proteínas específicas em áreas doentes em comparação com as saudáveis.

Além disso, a eletroforese de gel 2D é útil para acompanhar o progresso da resposta dos pacientes a uma potencial droga terapêutica. Os espécimes podem ser retirados de pacientes em vários momentos após a administração do tratamento. Desta forma, a eletroforese de gel 2D aliada à análise de manchas ocidentais ou espectrometria de massa, pode detectar proteínas associadas a respostas negativas, como inflamação; ou a ausência de proteínas em um estado aliviado.

Outro uso para eletroforese de gel 2D está no estudo da estrutura e função proteica após modificação pós-transacional, ou PTM, que são adições a proteínas após sua tradução de mRNA. Os PTM's podem regular uma variedade de funções, incluindo sinalização proteica, expressão genética ou causar danos oxidativos. A eletroforese de gel 2D é sensível a modificações como metilação ou acetilação, que podem causar uma mudança no II, bem como no peso molecular.

Você acabou de assistir o vídeo de JoVE sobre eletroforese em gel 2D. Este vídeo descreveu os princípios da técnica, um procedimento experimental típico, e várias de suas aplicações no campo da biomedicina.

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