Foto-Induced bryggbindningen av Oförändrad Proteiner (picup) Tillämpat på Amyloidogenic Peptides

1. Peptide förberedelse

1. Väg ~ 100-200 mikrogram frystorkad peptid med en mikrovåg och överför till märkt, kisel-belagd, låg-adsorbent mikrofugrör rör. Här använder vi den mänskliga sekvenser av Aβ40, Aβ42, kalcitonin och GRF.
2. Här använder vi peptider förbehandlade med 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) för att erhålla homogen, samlade utan förberedelser. Det här steget är nödvändigt eftersom förformade aggregat framkalla en snabb sammanställning av amyloidogenic proteiner, vilket resulterar i dålig reproducerbarhet bland experiment ^5. Andra metoder såsom filtrering och SEC kan också användas för att få sammanlagda utan förberedelser för picup ^6.
3. Att behandla peptider med HFIP, pre-kyla HFIP behållaren på is i ett dragskåp på sig tillräckligt skydd (HFIP är flyktiga och giftiga). Kylning av en 250 ml flaska vanligtvis kräver 10-15 min. Lägg HFIP att på förhand nerkylda provrör innehållande peptid lyophilizates att få en nominell peptid koncentration av 0,5 mm.
4. Sonikera peptiden lösningar i ett vattenbad sonicator i 5 minuter vid rumstemperatur.
5. Vortexa försiktigt och inkubera rören i 30 minuter vid rumstemperatur.
6. Chill rören på is (under 1 minut), och dela upp lösningarna i 10-50-l alikvoter i märkta 0,6 ml låg adsorbent rör.
7. Ta bort HFIP genom indunstning under en svag ström av kväve, eller lämna rören öppna i dragskåp över natten. För övernattning avdunstning, placera den öppna rören i ett rack och täck dem med ett stort ark med Kimwipes att undvika att damm och partiklar föroreningar.
8. TORKA UT resterande HFIP i vakuum i en frystorkning, eller en centrifugal-koncentrator i 30 min, eller i en exsiccator ansluten till ett vakuum inlopp för 2 h. Slutprodukten kommer att vara en peptid film på botten av mikrofugrör rören. Vid korrekt exsiccated kan rören förvaras lufttätt under längre perioder (månader) vid -20 eller -80 ° C.

2. Solubilizing den HFIP-behandlade peptider och foto tvärbindning

1. Innan solubilizing den HFIP behandlade peptider för förnätning reaktioner, man måste förbereda bryggbindningen och reagens härdning.
2. Väg upp ammonium persulfate (APS, herr 228,2 g / mol) och förbereda en 20 mM lösning i 10 mM natriumfosfat, pH 7,4. Blanda med hjälp av en virvel tills lösningen är klar.
3. Bered 1 mM lösning av Tris (2,2-bipyridyl) dichlororuthenium (II) hexahydrat (RuBpy Herr 748,63 g / mol) i 10 mM natriumfosfat, pH 7,4. Blanda med hjälp av en virvel och verifiera fullständig upplösning. Skydda slangen från ljus med hjälp av aluminiumfolie.
4. För SDS-PAGE analys efter bryggbindningen, är en bekväm släcka reagens 5% β-merkaptoetanol i 2 × SDS-PAGE prov buffert. Alternativt, 1 M ditiotreitol (DTT Herr 154,5 g / mol) i avjoniserat vatten eller en lämplig buffert kan användas.
5. HFIP-behandlade peptid filmer löses i utspädd NaOH och sedan natriumfosfat buffert tillsätts för att få ~ 30 koncentration mikroM peptid. Lägg till 60 mm NaOH följt av avjoniserat vatten i röret med peptid filmen så att NaOH och vatten utgör 10 och 45% av den slutliga volymen. Skrapa peptiden filmen från insidan av mikrofugrör hjälp av spetsen, blanda genom att pipettera upp och ned, och låt ligga i 5 minuter i ett vattenbad sonicator.
6. Tillsätt 45% 20 fosfat mM natriumklorid, pH 7,4, blanda genom att pipettera och centrifugera vid 16 tusen gi 10 min. Avsätt alikvoter av uncross kopplade peptider blandas med härdning reagens för negativa kontroller.
7. Justera kamerans slutare-fördröjning på 1 s. Vid högre bestrålning Ibland kan omfattande radikalreaktioner orsaka proteinnedbrytning. Ladda kamerans slutare. Bestrålning tid kan behöva optimeras när man använder metoden med ett nytt protein.
8. En typisk picup Reaktionen utförs i ett 20 l reaktion volym. Överför 18 ìl av peptiden lösningen i en tunnväggig, klar, 0,2 ml PCR-rör.
9. Till peptid lösningen, tillsätt 1 l RuBpy följt av 1 l APS och blanda reagenser genom att pipettera (den slutliga koncentrationen RuBpy och APS i reaktionsblandningen kommer att vara 0,05 och 1 mm, respektive).
10. Placera snabbt reaktionen röret inuti en 1,8-ml injektionsflaska av glas. Placera flaskan inuti bälgen bifogade framför kameran. Sätt på objektivet beskyddare och tryck på avtryckaren så att provet bestrålas för 1 s inne i bälgen.
11. Efter prov bestrålning, snabbt ta flaskan ur bälgen och PCR-röret ur flaskan. Snabbt släcka reaktionen genom att tillsätta 1 l DTT eller 10 ìl minska SIDA prov buffert. Upprepa reaktion för varje peptid delmängd.
12. Reaktionen blandningar kan nu frysas vid -20 ° C för förvaring i högst 7 dagar eller förvaras på is före analys med SDS-PAGE och silver-färgning.

3. SDS-PAGE och flisa-färgningav tvärbunden peptid produkter

1. Rutin SDS-PAGE och silver-färgning utförs för att visualisera tvärbunden peptider.
2. Belastning 5 ìl av reaktionsblandningen per bana för att få ~ 130 pmol av peptid per bana.
3. Inkludera liknande mängder uncross kopplade peptider för jämförelse. Också innehålla en standard protein stege för visuell tillnärmning av molekylvikt peptid band.
4. Kör gelen med hjälp av en standardiserad apparatur gelelektrofores. Vi använder XCell SureLock Mini-Cell system från Invitrogen och utföra silver-färgning enligt Invitrogen publicering IM-1002, Novex Pre-Cast gelelektrofores Guide.

Del 4: representativa resultat (Figur 1)

Figur 1: Silver-färgade polyakrylamidgeler visar uncross-linked (-) och foto-tvärbunden (+) GRF, kalcitonin, Aβ40 och Aβ42

SDS-PAGE och silver-färgning analyser av picup genereras-Aβ40 oligomerer visar ungefär liknande band intensitet monomer genom tetramer, följt av en kraftig minskning av det överflöd av högre oligomerer ^7. Uncross kopplade Aβ40 vandrar med Herr överensstämmer med den i monomer ^7. Aβ42 visar en tydlig fördelning oligomer storlek. Aβ42 oligomerer omfattar 2-3 grupper ^8. Den första gruppen, monomer genom trimerer, visar avtagande intensitet med ökande oligomer ordning. I den andra gruppen, är en gaussisk-liknande fördelning observerats mellan tetramer och heptamer, med ett maximum vid pentamer och hexamer. Den tredje gruppen, som inte visas här, innehåller oligomerer av herr ~ 30,000-60,000 Da ^8. Dessa högre Herr oligomerer vanligtvis observeras med hjälp av SEC-isolerad LMW Aβ42 men inte peptid beredd genom filtrering eller HFIP behandling ^6. Uncross kopplade Aβ42 producerar främst två band, en monomer band och ett brett trimerer / tetramer band, vilket är en artefakt framkallas av SDS ^5,9. Kalcitonin ger en fördelning oligomerer storlek som starkt avviker från ett monotont exponentiell minskning i regionen monomer genom tetramer, vilket tyder på preexistens dimerer, trimerer och tetramers ^7. Kontrollen polypeptid, GRF, producerar ett monotont oligomerer fördelning mellan dimer genom hexamer så att den uppenbara relativa mängderna av oligomerer minskar exponentiellt med ökande molekylmassa. I andra experiment, högre oligomerer också kan visualiseras ^7. Det exakta antalet och den relativa intensitet oligomerer band kan variera något mellan experiment beroende på den faktiska protein koncentration, mängden protein laddades på gelen och den tid som används för utveckling steg i silver-färgningsprotokollet.

Picup utvecklades ursprungligen för att studera stabila proteinkomplex ^2. Metoden tillämpades senare kvantitativ studie av metastabila församlingar amyloid protein, inklusive ^A-beta-10, prioner och sjukdom-associerade PrP ^{Sc 11} och α-synuklein ^12. De viktigaste faktorerna som måste beaktas när man utformar en picup experiment är reagensen stökiometri, bestrålning tid och provberedning förfarande. De två första frågorna kan kräva empiriska optimering, medan den senare frågan i hög grad påverkar tolkningen av experimentella data. För amyloidogenic proteiner i synnerhet kräver bestämning av storlek fördelningar av metastabila oligomerer med hjälp av aggregerad och börjar förberedelserna. Bakgrunden,, mekanism var instrumentering, protokoll, optimering, omfattning, ändringar, program och begränsningar picup omfattas i tidigare publikationer ^1,2,13. Picup kan användas för att generera stabila, lösligt protein oligomerer som efter fraktionering och rening, kan användas för strukturella studier, analyser cytotoxicitet, oligomerisering-hämning studier, och som mål för utveckling av molekylär-erkännande verktyg.