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 JoVE Biology

クーマシー有機溶媒および酢酸のないG - 250でゲル中のタンパク質の染色

1, 1

1Protein Expression and Purification Core Facility, EMBL Heidelberg

Article
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    Summary

    クマシーブリリアントブルー(CBB)ポリアクリルアミドゲル中でのG - 250によるタンパク質染色用の短いプロトコルは、CBBと古典的な染色の手順のように有機溶剤または酢酸を使用せずに記述されています。

    Date Published: 8/14/2009, Issue 30; doi: 10.3791/1350

    Cite this Article

    Lawrence, A., Besir, H. Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid. J. Vis. Exp. (30), e1350, doi:10.3791/1350 (2009).

    Abstract

    クマシーブリリアントブルー(CBB)、有毒で引火性の有機溶媒(メタノール、エタノールまたは2 - プロパノール)と酢酸の高い内容を持つソリューションを使用して古典的なタンパク質染色のプロトコールで染色し、SDS泳動後のゲル中のタンパク質の脱色、固定のために使用されています- PAGE。頻繁に使用されている短い時間のために電子レンジでの染色溶液を加熱し、手続きのスピードアップに。有毒または有害なメタノール、エタノールまたは2 - プロパノール及び安全性の考慮のために避けるべきラボにおける酢酸の強いにおいの蒸発でこれは通常、結果。もともとEM Wondrak(US2001046709(A1)、US6319720(B1))によって2つの特許出願で公開プロトコルでは、染色液の代替物はないの有機溶媒や酸が使用されていないで説明されています。 CBBは、蒸留水に溶解している(CBB G - 250リットル当たり60 - 80mg)、35 mMの塩酸は、染色液中の唯一の他の化合物として追加されます。ゲルのCBBのstaningは、蒸留水でゲルのSDS - PAGEと徹底した洗浄の後に行われます。洗浄および染色工程中にゲルを加熱することにより、プロセスをより速く仕上げることができるとは有毒または有害なcompundsは蒸発されていません。タンパク質の染色は、溶液を染色でゲルを加熱した後、1分以内にすでに発生し、完全に染色されたタンパク質に影響を与えずに、蒸留水で染色したゲルの長期にわたる洗浄によって完全に脱色され若干青色の背景色の15-30分後に開発されていますバンド。

    Protocol

    パート1:CBB染色液の調製

    1. CBB G - 250の60〜80 mgを2〜4時間攪拌することにより二回蒸留水1リットルに溶解されています。最後に、濃塩酸3mlを別分間攪拌しながら濃い青色溶液に添加し、後で使用するために暗所に保存されます。解決策は、その染色の効率を失うことなく、数ヶ月に数週間まで保存することができます。
    2. 濃塩酸は、換気フードの下に使用される通常のケアのウントに取り扱ってください。最終的な解決策は、pH約2になる、手袋を使用する必要があると皮膚との接触を避けるべきであるように。

    パート2:SDS - PAGE

    1. タンパク質サンプルの適切なアリコートは1 ×ローディングバッファーの最終濃度になるようにバッファーをロードすると混合されています。我々は、125mmのTris/H3PO4(25 ° CでpH 7.5)を、2mMのEDTA、4%SDS、200mmのDTT、0.02%ブロモフェノールブルー、50%グリセロールで2 ×ローディングバッファーを使用。 SDS - PAGEのための他のローディングバッファも同様に使用できます。
    2. タンパク質サンプルをロードする前に、約5分間加熱する。一方、ゲル電気泳動槽は、実行用に準備されます。我々はX細胞SureLockで©ビス - トリスゲル(Invitrogen)® MES -バッファ付きミニ細胞(Invitrogen)を実行しているバッファが、その他のゲルや電気泳動システムとしても使用することができるプレキャスト4-12%NuPAGEを使用してください。
    3. タンパク質サンプルは、220Vで50分間実行ゲル電気泳動でロードされます。

    パート3:ゲルの染色

    1. ゲルカセットを分解し、ゲルは、その後の洗浄ステップのボックスに配置されます。
    2. 蒸留水約100mlをゲルに添加し、30秒間電子レンジで加熱される。沸騰が発生する前に加熱を停止する必要があります。ゲルのボックスは、3〜5分間シェーカー上に置かれる。そしてこの洗浄ステップは、新鮮な水で二回繰り返されます。
    3. 十分なCBB染色液は、ボックス内のゲルと10秒間電子レンジで加熱ボックスをカバーするために追加されます。沸騰せず。ゲルのボックスは、染色の仕上げにシェーカーに置かれます。すでに1分後に、タンパク質のバンドが15〜30分間の後、観察することができます。染色は、ほとんどの場合、十分に強いです。
    4. 染色液はオフに注ぎ入れ、50〜100ミリリットル蒸留水は、さらにシェーカー上でゲルの明るい青の背景を脱色するために追加された。水は、必要に応じてさら​​に脱色のために新鮮な水に置き換えることができます。
    5. ゲルは、スキャン撮影や長期保存用に乾燥させることができる

    パート4:代表的な結果:

    図を参照してください。説明する手順に従って適切に染色したゲルの場合は1。

    図を参照してください。十分な長染色と残留SDSが効率的な染色を阻害する前に洗浄されていないゲル2。マーカーレーンが(*)マーカータンパク質の同量を含んでいることに注意してください。


    図。 1:タンパク質の精製の ​​サンプル(:分子量マーカー*)をロードした後に染色した代表ゲル。


    図。 2:CBB染色する前に十分な長さで洗浄されていないCBB染色したゲル。タンパク質バンドは、(マーカーのレーンの*は、図のように同量のタンパク質が含まれている点に注意。1)弱いが表示されます。

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    Discussion

    • 洗浄ステップは、タンパク質の効率的な染色のために重要です。 2分または水(<50ミリリットル)の削減量以下に削減、洗浄時間は、ゲル中の残留SDSの高い金額に起因する可能性が最も高い淡いブルーのタンパク質のバンド、になる可能性があります。
    • タンパク質は、質量分析によって分析することを予定している場合のバンドの強度が十分な強さになるまで、電子レンジで加熱ステップは、約10の各ステップで最小と拡張染色時間に延長ゲルの洗浄のための時間をスキップしてください。質量分析によるタンパク質のため、ゲルマトリックスにタンパク質の架橋におけるゲルの結果を加熱し、検出が妨げられる可能性があります。
    • 代わりに、CBB G - 250の、一Wondrakによるオリジナルプロトコルに従って、CBB R - 250を使用することができます。我々の研究室でCBB G - 250の株式を持っていたし、この染料との良好な結果を持っていたとして、我々は並ん染料側の両方を比較していない。
    • 手続きのスピードと洗浄し、染色のステップに有毒または有害な溶剤の不作為は、このプロトコルを使用するための最も重要かつ説得力のある要因です。感度は、古典的なCBB染色のプロトコールおよび商業CBB染色液の同じ範囲内にあり、発現と組換えタンパク質の精製の分野でのSDS - PAGE解析のための制限要因となっていない。

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    Disclosures

    競合する利害関係はありません。上記の手順は、もともと、EM Wondrak(Refを参照してください。)によって特許出願に掲載されました。

    Acknowledgements

    我々は、イネスRackéの技術支援に感謝したい。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Coomassie Brilliant Blue G-250 AppliChem A3480 any other CBB G-250 could be used as well
    Concentrated HCl

    References

    1. Process for fast visualization of protein. US patent. Wondrak, E. M. 6319720 (B1) (2001).
    2. Solution for fast visualization of protein. US patent. Wondrak, E. M. 2001046709 (A1) (2001).

    Comments

    11 Comments

    Hi,
    This is very clear and easy way of staining the gels. I would like to know the consequences of using acetic acid and organic solvents in staining the proteins electrophoresd using polyacrylamide gels, or what was is this method advantageous than the traditional coomassie staining using acetic acid and methanol ?
    your replies are appreciated

    regards,
    Rajesh
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 17, 2009, 2:23 AM

    Hi,
    as indicated in the article, the main factors for using this method are avoiding organic solvents and acetic acid for safety reasons and the speed of staining. This method has a lower sensitivity compared to longer protocols but for our applications the speed of staining compensates that.
    We haven't analyzed the effect of using organic solvents or acetic acid versus HCl in water, so I can't tell you if e.g. the fixation of the proteins in the gel is affected or more protein is dissolved from the gel leading to lower sensitivity. I hope this answers your questions.
    Best regards
    Hüseyin
    Reply

    Posted by: Hüseyin B.August 25, 2009, 8:14 AM

    Hi,
    May we have a pdf version of your method ?
    Also, at what temperature the solutions can be heated ?
    Is your method compatible with mass spectrometry-based micriosequencing ?

    Best regards,

    Hristo Atanassov
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 12, 2009, 10:32 AM

    Hi,
    there should be a link to the pdf-file on the page of the video. If you cant find it, please contact me at www.embl.de/services/core_facilities/pepcore/members/index.php?s_personId=4403.
    As described, we heat the gel in the microwave oven for about 10 sec so it's getting hot without boiling. I guess it's about 70-80°C.
    As you may know, you should not heat a gel in the microwave if you want to do mass spec. afterwards as you will decrease the efficiency of extraction of protein bands from the gel. Additionally, the sensitivity of this fast method is lower than for some Coomassie protocols optimized for high sensitivity so it may not be ideal for very low protein amounts (
    Reply

    Posted by: Hüseyin B.November 13, 2009, 4:16 AM

    Hi,
    there should be a link to the pdf-file on the page of the video. If you cant download it, please contact me at www.embl.de/services/core_facilities/pepcore/members/index.php?s_personId=4403.
    As described, we heat the gel in the microwave oven for about 10 sec so it's getting hot without boiling. I guess it's about 70-80°C.
    As you may know, you should not heat a gel in the microwave if you want to do mass spec. afterwards as you will decrease the efficiency of extraction of protein bands from the gel. Additionally, the sensitivity of this fast method is lower than for some Coomassie protocols optimized for high sensitivity so it may not be ideal for very low protein amounts (
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 16, 2009, 12:17 PM

    Hi,
    Thank you for this method. However, I would like to know is there some special procedure when using this method with Protein Agarose gel electrophoresis? I tried with Agarose gel but it appears the entire gel is stained permanently blue. Have you tried this method with agarose gel or modified it for such purpose?
    Thank you.
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 28, 2011, 8:48 AM

    Hi,
    we haven't tried this with agarose gels, but I'm sure you need to do some modification of the procedure. The most important one would be avoiding the microwave step for washing and staining. This would obviously damage the agarose gel. As far as I know the destaining of agarose gels can take much longer compared to poly-acrylamide gels. Not sure if due to larger pore size thus more dye inside the gel or higher affinity of the dye to agarose due to more polar structure of agarose, maybe both. I hope that helps.
    Reply

    Posted by: AnonymousSeptember 28, 2011, 10:20 AM

    Hi,
    I just want to say how I'm thankful because of sharing this very wonderful fast method by this site. It helped me to have more clear gels and to save the time.
    Thank you again!
    Hanie
    Reply

    Posted by: Hanie k.January 27, 2012, 12:46 PM

    It seems the protocol is simple and easy. I will try. If I want to make just 100mL of staining solution, I would take 6mg dye, 100mL water and 0.3mL HCL. DŒs this work?
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 13, 2012, 12:34 AM

    Hi,
    I can say, It works, especially when your protein concentration on gel lanes is high enough (according to my own experience). Give it a try!
    Be lucky
    Reply

    Posted by: Hanie k.February 14, 2012, 5:14 AM

    We are using this method but have encountered an occasional glitch... our gels are blue with negative (transparent) bands where the protein should be.... We are considering the possibility that this is the result of insufficient washing prior to staining, but this is not consistent with the gel that you have shown (which was not washed enough).

    Any suggestions would be greatly appreciated.
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 20, 2012, 10:01 AM

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