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 JoVE Biology

Generación de células madre pluripotentes inducidas por reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón con un factor de transcripción Cuatro, doxiciclina inducible sistema de transducción de lentivirales

1, 1, 1, 2

1Stemgent, 2Whitehead Institute for Biomedical Research, MIT - Massachusetts Institute of Technology

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    El Inducible Stemgent Dox ratón TF Set Lentivirus puede reprogramar fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) de células madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células. Aquí se demuestra el protocolo para la expresión de DOX-inducible de los factores de la transcripción del ratón reprogramación Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc para generar iPS colonias que expresan marcadores comunes MES pluripotencia.

    Date Published: 11/13/2009, Issue 33; doi: 10.3791/1447

    Cite this Article

    Hamilton, B., Feng, Q., Ye, M., Welstead, G. G. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System. J. Vis. Exp. (33), e1447, doi:10.3791/1447 (2009).

    Abstract

    El uso de un conjunto definido de factores de transcripción y las condiciones de cultivo celular, Yamanaka y sus colegas demostraron que los retrovirus mediada por la entrega y la expresión de Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4 es capaz de inducir la pluripotencialidad en fibroblastos de ratón. 1 Informes posteriores han demostrado la utilidad de la doxiciclina (DOX) inducible sistema de entrega de lentivirus para la generación de células iPS de primaria y secundaria a partir de una variedad de otros tipos de ratón célula somática adulta. 2,3

    Madre pluripotentes inducidas (iPS) son similares a las células madre embrionarias (ES) en la morfología de las células, la proliferación y la capacidad de inducir la formación de teratoma. Ambos tipos de células se pueden utilizar como material de partida pluripotentes para la generación de células o tejidos diferenciados en la medicina regenerativa. 4-6 células iPS tienen una clara ventaja sobre células madre embrionarias, ya que muestran las características clave de células madre embrionarias sin el dilema ético de la embrión de la destrucción.

    Aquí se demuestra el protocolo para la reprogramación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), las células con la inducible Stemgent DOX Raton TF Lentivirus. También demuestran que la inducible Stemgent DOX ratón TF Set Lentivirus es capaz de expresar cada uno de los cuatro factores de transcripción en la transducción en MEFs lo que induce un estado de células madre pluripotentes que muestra los marcadores de pluripotencia característica de las células ES.

    Protocol

    trypsinize las células transducidas, centrifugar a 200 xg durante 5 minutos y resuspender en medio de cultivo ES / IPS (450 ml golpe de gracia DMEM suplementado con 50 ml de suero de células ES-calificado de ternera, 5 ml de penicilina / estreptomicina, 5 ml 200 mM L-glutamina, 0,5 ml de β-mercaptoetanol y 25 l LIF). Semilla transducidas MEF en una concentración adecuada para el tamaño de la celda placa de cultivo (en el ejemplo 2.5 x 10GFP para identificar las colonias de reprogramar. Cada experimento será diferente, pero las colonias suelen ser lo suficientemente grande como para el aislamiento de entre 16 y 22 días. Las colonias identificadas durante este período de tiempo puede ser manual aislados y trypsinized para la expansión y el análisis.

    Discussion

    Estos resultados demuestran que la inducible Stemgent DOX ratón TF Set Lentivirus se puede utilizar para generar eficientemente las colonias de iPS mediante la inducción de la expresión ectópica de transducidas factores de transcripción en fibroblastos embrionarios de ratón. En el diseño de experimentos de reprogramación, las variables se deben considerar varias para optimizar la eficiencia de la reprogramación. En primer lugar, es posible modificar la actividad del virus al objetivo proporción de células (es decir, MOI) durante la etapa de infección primaria para aumentar o disminuir la eficiencia de transducción, lo que afecta la cantidad de virus integrado en la población celular destinataria. En segundo lugar, ajustando la longitud de tiempo que las células son expuestas a DOX puede afectar la eficiencia de la generación de iPS colonia de células. En tercer lugar, la capacidad proliferativa de las células diana puede afectar la nueva programación, como las células que están en crecimiento activo y dividir son más susceptibles a la reprogramación. Por último, al modificar el protocolo para el número de células diferentes o diferentes platos de tamaño del tejido cultural, se recomienda que los números de las células diana se ajustará proporcionalmente a la superficie de la placa de cultivo.

    Disclosures

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    DOX Inducible Mouse TF Concentrated Lentifirus Set Stemgent 00-0003

    References

    1. Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676 (2006).
    2. Aoi, T., Yae, K., Nakagawa, M., Ichisaka, T., Okita, K., Takahashi, K., Chiba, T. & Yamanaka, S. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science 321, 699-702 (2008).
    3. Yu, J., Vodyanik, M.A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J.L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G.A., Ruotti, V., Stewart, R., Slukvin, I.I. & Thomson, J.A. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 318, 1917-1920 (2007).
    4. Murry, C.E. & Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell 132, 661-680 (2008).
    5. Lerou, P.H. & Daley, G.Q. Therapeutic potential of embryonic stem cells. Blood Rev. 19, 321-331 (2005).
    6. Wernig, M., Meissner, A., Foreman, R., Brambrink, T., Ku, M., Hochedlinger, K., Bernstein, B.E. & Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 448, 318-324 (2007).

    Comments

    8 Comments

    Hi, where do you guys order the anti-fade Aqua-Mount? thanks a lot!
    Reply

    Posted by: AnonymousMarch 21, 2010, 6:29 AM

    Why for Immunocytochemical Analysis for Pluripotency you do not fix in 4% paraformaldehyde
    and for Immunocytochemical Analysis of Transduction Efficiency you do fix?


    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 26, 2011, 1:14 AM

    can we download those video
    Reply

    Posted by: Yulin X.October 14, 2011, 5:25 AM

    Thank you for your comments. It is not possible to download our video content. However, as you can see in this case the video is free to view.

    Best wishes,
    Ward Parry
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 16, 2011, 5:30 PM

    what is the reason of removing dox after first exposure for twelve days?
    thank you
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 28, 2011, 7:52 AM

    Dox is removed after 1² days to ensure that all colonies that exist after 16-18 days are dependent on endogenous pluripotency factor expression and not the factors applied exogenously.
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 28, 2011, 4:08 PM

    Is it essential process?
    I think if dox is exposed continousely, pluripotency factors can express more actively...
    thank you
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 1, 2011, 3:07 AM

    It is valuable as it ensures that colonies you manually isolate are more likely to be stably reprogrammed, therefore viable for expansion. If you leave dox on and isolate colonies you will need to pick more in order to ensure that you will lines that are stable in expansion as there is a high percentage of those colonies that are dependent on ectopic/exogenous factor expression. If you ensure they are dox-independent you can pick fewer colonies to get stabl expanded lines.
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 1, 2011, 10:24 AM

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