The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
This article is a part of JoVE General. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.
You do not have access to any JoVE content through your current IP address.
IP: 50.17.109.248, User IP: 50.17.109.248, User IP Hex: 840003064
Current Access Through Your Registered Email Address
You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please sign in or create an account with your institutional email address to access this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
Unable to load video. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
An unexpected error occurred. Please check your Internet connection and reload this page. If the problem continues, please let us know and we'll try to help.
यूरिया पन्ना या यूरिया polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing 6-8 एम यूरिया, जो माध्यमिक डीएनए या शाही सेना संरचनाओं denatures और एक polyacrylamide जेल आणविक भार के आधार पर मैट्रिक्स में उनकी जुदाई के लिए प्रयोग किया जाता है रोजगार. 2 से 500 अड्डों के बीच टुकड़े, लंबाई के रूप में एक एकल nucleotide के रूप में छोटे मतभेदों के साथ, इस विधि 1 का उपयोग कर अलग किया जा सकता है. नमूने के प्रवास चुना acrylamide एकाग्रता पर निर्भर है. Polyacrylamide की एक उच्च प्रतिशत कम आणविक वजन टुकड़े का निराकरण करता है. ° सी जेल चलाने के दौरान यूरिया और 45-55 के तापमान के संयोजन असंरचित डीएनए या शाही सेना अणु की जुदाई के लिए अनुमति देता है.
सामान्य में इस विधि का विश्लेषण करने के लिए या एकल असहाय डीएनए या शाही सेना के टुकड़े, जैसे संश्लेषित या लेबल oligonucleotides या उत्पादों एंजाइमी दरार प्रतिक्रियाओं से शुद्ध की आवश्यकता है.
हम इस वीडियो लेख में बताते हैं कैसे तैयार करने और denaturing यूरिया polyacrylamide जैल चला. तकनीकी सुझावों, मूल प्रोटोकॉल 1,2 करने के लिए इसके अलावा में शामिल हैं.
इस प्रयोगात्मक प्रक्रिया के लिए पूर्ण और विस्तृत पाठ प्रोटोकॉल आण्विक जीवविज्ञान में वर्तमान प्रोटोकॉल में उपलब्ध है. जेल सैंडविच की विधानसभा के लिए और जेल तंत्र के लिए विस्तृत कदम दर कदम निर्देश BioRad 3 वेबसाइट पर पाया जा सकता है .
आवश्यक उपकरण: ग्लास प्लेटें (आंतरिक और बाहरी) 10 सेमी सेल: 10.1 x 7.3 सेमी (आंतरिक प्लेट), 10.1 x 8.2 सेमी (बाहरी थाली) BioRad, 20 सेमी सेल: 20 BioRad x 20 सेमी (आंतरिक प्लेट), 20 x 22.3 सेमी (बाहरी थाली), 0.5-1.5 मिमी जेल कंघी और spacers जेल कास्टिंग स्टैंड ढक्कन और केबल के साथ जेल तंत्र हाई वोल्टेज बिजली की आपूर्ति ताप ब्लॉक या नहाने के पानी सीरम विज्ञानी pipettes और पिपेट सहायता पिपेट और विंदुक युक्तियाँ जेल ड्रायर या स्कैनर
अभिकर्मकों और समाधान यूरिया (ultrapure) 40% polyacrylamide समाधान (29:1) X 10 TBE समाधान (बफर Tris borate, EDTA) विआयनीकृत, आसुत पानी TEMED 30% (w / v) अमोनियम persulfate समाधान 0.5 x TBE समाधान Formamide EDTA Xylene cyanol Bromphenol नीले मेथनॉल इथेनॉल
आयतन
50 मिलीलीटर
60 मिलीलीटर
10 मिलीलीटर
Acrylamide एकाग्रता
10%
12.5%
15%
10%
12.5%
15%
10%
12.5%
15%
ग्राम यूरिया
24
24
24
28.8
28.8
28.8
4.8
4.8
4.8
मिलीलीटर 40% Acryl (29:1)
12.5
15.625
18.75
15
18.75
22.5
2.5
3.125
3.75
उल 30% ए पी एस
166
166
166
199.2
199.2
199.2
33
33
33
उल TEMED
20
20
20
24
24
24
4
4
4
10 एक्स TBE
5
5
5
6
6
6
1
1
1
विआयनीकृत, आसुत जल के साथ मात्रा भरें
तालिका 1: एकल असहाय oligonucleotides हल करने के लिए विभिन्न acrylamide सांद्रता और मात्रा के लिए आवश्यक अभिकर्मकों और समाधान
जेल सैंडविच विधानसभा और तैयारी जेल
निर्माताओं विवरण के अनुसार जेल इकट्ठा है और जेल कास्टिंग कक्ष 3 में जेल ठीक है. 0.5-1.5 मिमी मोटी spacers का उपयोग करें.
आण्विक जीव विज्ञान में वर्तमान प्रोटोकॉल के अनुसार उपयुक्त polyacrylamide समाधान तैयार या के रूप में तालिका 1 में सूचीबद्ध है. एक 20 सेमी की denaturing acrylamide जेल के लिए x 22 x 1.5 मिमी सेमी, जेल समाधान के 60 मिलीलीटर और एक 10.1 x 8.2 सेमी के लिए x 1 मिमी जेल 5 मिलीलीटर जेल समाधान के लिए पर्याप्त है. बड़ा जैल जब उम्मीद उत्पादों / बैंड कुछ अड्डों में से एक सीमा के भीतर कर रहे हैं उपयोग किया जाता है, तो एक एकल nucleotide के एक अंतर के साथ एक लंबे समय तक जेल बैंड को हल करेंगे. यदि उम्मीद बैंड 10 से अधिक nucleotides में अलग है, छोटे जैल टुकड़े को हल करने के लिए उपयुक्त हो जाएगा. Polyacrylamide का प्रतिशत है कि तुम्हारी जुदाई आवश्यकताओं सूट चुनें, एक उच्च polyacrylamide सांद्रता कम आणविक भार टुकड़े को हल करेंगे. Acrylamide का वांछित राशि के साथ ultrapure यूरिया और मिश्रण का प्रयोग करें. जेल मिश्रण TBE बफर जोड़ें 0.5-1 एक्स TBE के अंतिम एकाग्रता और विआयनीकृत, आसुत जल के साथ मात्रा को भरने के लिए. 20 सेकंड के लिए माइक्रोवेव में समाधान और हीट धीरे मिश्रण. बड़ा जेल संस्करणों इस कदम दोहराएँ जब तक समाधान हाथ गर्म है.
जेल तुरंत एक सीरम वैज्ञानिक विंदुक और दो गिलास प्लेट के बीच एक स्वचालित विंदुक सहायता का उपयोग कर डालो. हवाई बुलबुले शुरू करने से बचें. कंघी डालें और 30-60 मिनट के लिए जेल polymerize चलो.
वैद्युतकणसंचलन तंत्र सेट और जेल prerun
कास्टिंग चैम्बर और 3 निर्देश बनाती अनुसार जेल तंत्र को विधानसभा से जेल उतरना.
कम बफर चैम्बर बुद्धि चल रहा है (0.5-1 एक्स TBE) बफर कि गिलास प्लेट उप जाएगा भरेंमर्ज किए गए बफर के साथ 2-3 सेमी. ऊपरी बफर चैम्बर भरें बफर चलाने के साथ जेल के शीर्ष करने के लिए.
ध्यान कंघी को हटाने और एक विंदुक और जेल का उपयोग सुझावों लोड हो रहा है के द्वारा चल रहे बफर के साथ कुओं कुल्ला.
एक उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति के लिए जेल प्रणाली और केबल में प्लग के ढक्कन संलग्न. इससे पहले कि आप अपने नमूनों को लोड कर सकते हैं आप कम से कम 30 मिनट के लिए जेल prerun जेल गर्मी और जेल से शेष यूरिया को हटाने की है. अधिकतम तापमान 45-55 के बीच होना चाहिए डिग्री सेल्सियस से बचने के 60 से अधिक तापमान डिग्री सेल्सियस के रूप में बैंड धब्बा या गिलास प्लेट दरार सकता है. Prerun (15-25 जेल प्रति डब्ल्यू) के लिए निरंतर वाट चुनें.
नमूना तैयार
बीच में अपने नमूने तैयार. इसलिए, 2 एक्स जेल लोड हो रहा है अपने नमूने के मिश्रण की उचित राशि जोड़ें. लोड हो रहा है मिश्रण आमतौर पर 90% formamide है, 0.5% EDTA, 0.1% xylene cyanol और 0.1% bromphenol नीले रंग शामिल हैं.
इससे पहले नमूने जेल पर लोड किया जा सकता है, नमूने गर्मी 70-90 ° C के बीच कुछ मिनट के लिए नमूने हीटिंग द्वारा विकृत किया जाना चाहिए.
लोड और चलाने जेल
जब prerun समाप्त हो गया है, ढक्कन को हटा दें और अच्छी तरह के रूप में पहले के रूप में यूरिया कुओं में leached है में वर्णित जेब कुल्ला.
जेब से नीचे से नमूने सावधानी से लागू करें. हवाई बुलबुले शुरू करने से बचें. बफर लोड हो रहा है खाली जेब के लिए लागू किया जा चलाने के दौरान बराबर स्थिति बनाए रखने है.
ढक्कन इकट्ठा और निरंतर वाट जेल चलाने के लिए 55 की एक जेल का तापमान बनाए रखने ° prerun करने के लिए इसी तरह सी. मार्कर रंगों के प्रवास निरीक्षण डाई सामने तक जेल की कम अंत पर पहुंच गया. रन अवधि प्रयुक्त acrylamide का प्रतिशत, बफर और जेल मोटाई के ईओण ताकत पर निर्भर है. एक रन 2-4 घंटे के बीच पिछले कर सकते हैं. जेल के तापमान पर जाँच करें. एक जेल थर्मामीटर को चलाने के दौरान सही तापमान पर नजर रखने में मदद कर सकते हैं.
जेल प्रक्रिया
जब डाई सामने जेल के अंत तक पहुँच गया है कम बफर चैम्बर के जेल से बाहर डाल दिया. कक्ष से जेल निकालें और clamps ढीला. दूर spacers खींचो और ध्यान से गिलास प्लेट स्वांग रचना. यदि आवश्यक हो दूर ही जेल हिस्सा युक्त ऊपरी कटौती.
ध्यान से एक डिश में जेल निर्धारण समाधान (TBE अधिक 5-10% मेथनॉल और इथेनॉल का एक ही एकाग्रता) के साथ जेल हस्तांतरण. 5-10 मिनट के लिए समाधान में जेल छोड़ दो और बफर दो बार बदलने के.
जेल आगे प्रसंस्करण के लिए एक वैक्यूम जेल ड्रायर या जेल की प्रत्यक्ष स्कैनिंग का उपयोग कर तैयार है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
बैंड तीखेपन कई कारकों पर निर्भर करता है. नमूना तेज बैंड के लिए लोड की मात्रा के रूप में संभव के रूप में छोटे यानी 1-5 μl के बीच आदर्श होना चाहिए. हालांकि, ऊपर से 15 μl लोड किया जा सकता है जो अभी भी स्वीकार्य संकल्प सुनिश्चित करता है. तेज बैंड में कम नमूना मात्रा परिणाम.
बैंड की गुणवत्ता भी जेल की मोटाई पर निर्भर है. जैसे .75 मिमी पतली जैल, 1.5 मिमी मोटी जैल से बेहतर परिणाम दिखाते हैं.
बैंड के आकार को भी जेल लोड करने के दौरान प्रभावित किया जा सकता है, अगर नमूना जेल जेब में समान रूप से लागू नहीं किया है. लोड हो रहा है बफर में 10% ग्लिसरॉल सहित जेल लोड हो रहा है और अच्छी तरह से अधिक आसानी से में डूब नमूना के दौरान मदद करता है.
एक अन्य संभावित समस्या यह है कि नमूना लोड हो रहा है बफर के साथ जुड़ा हुआ है होते हैं, अगर उम्मीद उत्पाद (ओं) लोड हो रहा रंगों में से एक के रूप में एक ही स्तर पर चलाता है. इसके अलावा, अगर फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग किया जाता है, कुछ रंगों को एक समान तरंगदैर्ध्य पर एक फ्लोरोसेंट संकेत दिखा. यदि यह है कि एक डाई या सभी रंगों को हटाने के मामले में इस समस्या को हल कर सकते हैं. तो यह एक आकार मानक के रूप में एक खाली अच्छी तरह से में डाई युक्त नमूना चलाने के लिए सलाह दी जाती है.
रन की शुरुआत में कम वोल्टेज भी तेज बैंड मिल में मदद करता है, के रूप में नमूना जेल सामने आसानी से प्रवेश करती है और यह है कि जेल जेब उच्च वोल्टेज के कारण पतन से बचा जाता है. एक छोटी कम प्रतिशत जेल stacking acrylamide (4%) एक ही बैंड sharpening प्रभाव हो सकता है.
अक्सर समस्या का सामना करना पड़ा जेल "मुस्कुरा" है, जो वैद्युतकणसंचलन के दौरान जेल के माध्यम से असमान गर्मी वितरण की वजह से है. यदि जेल बफर से घिरा हुआ है, निर्भर करता है जो जेल प्रणाली कार्यरत है, एक धातु की थाली के गिलास प्लेट के लिए संलग्न एक बराबर गर्मी वितरण का समर्थन करता है और काफी हद तक जेल गुणवत्ता बढ़ा सकते हैं.
जैल के लिए बड़ा गिलास प्लेट के Silanizing की सलाह दी है, क्योंकि यह बहुत चलाने के बाद जैल की हैंडलिंग में सुधार, के रूप जैल गिलास प्लेट के लिए छड़ी करने के लिए करते हैं.
Denaturing यूरिया polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (यूरिया पृष्ठ) विश्लेषण करने के लिए या एकल असहाय डीएनए या शाही सेना के टुकड़े के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूने radionucleotide या फ्लोरोसेंट लेबल अलग करने के लिए उपयोगी है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Maniatis, T., Jeffrey, A., van deSande, H. Chain length determination of small double- and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry. 14 (17) : 3787-94 (1975).
Albright, L.M., Slatko, B. E. Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. Curr Protoc Nucleic Acid Chem. Appendix 3:Appendix 3B. DOI: 10.1002/0471142700.nca03bs00 (2001).
Excellent! We are looking for a electrophoresis uniit which can run 20 cm (W) X 25 cm (L) denaturing gels. Could you please suggest vendors from who we could purchase those apparatus.
Dr. Pradeepkumar, IIT Bombay
1
ReplyPosted by: PradeepkumarNovember 20, 2009, 5:15 AM