Zebrafish 상악 바벌의 연구 방법

LeClair, E. E., Topczewski, J. Methods for the Study of the Zebrafish Maxillary Barbel. J. Vis. Exp. (33), e1558, doi:10.3791/1558 (2009).

Barbels는 어류, 파충류와 양서류에서 발견 피부 감각 부속됩니다. zebrafish, Danio rerio는 barbels - 짧은 코에 한쌍과 긴 상악 쌍 이쌍을 개발하고 있습니다. 바벌 조직은 피부 세포, 땀샘, 입맛, melanocytes, 순환기 혈관과 감각 신경을 포함한 ectodermal, mesodermal 및 신경 크레스트 원산지 세포를 포함하고 있습니다. 대부분의 성인 조직과는 달리, 턱의 수염은 우리가 수명주기 전반에 걸쳐 이러한 조직 유형의 개발 및 유지 보수를 시각화 수 있도록 광학 분명하다.

이 동영상은 상악 바벌 (약 일개월 후 수정을 시작)의 조기 개발을 보여줍니다 및 성인 돌출부 (> 삼개월 후 수정)의 재생을 유도하는 외과 프로토콜을 보여줍니다. 간단히, anesthetized 물고기의 왼쪽 상악의 수염은 maxilla의 꼬리 가장자리에 단지 말초 살균 포셉로 고가이다. 좋아, 멸균 스프링 가위는 절단 평면에 대한 해부 랜드마크를 설립,이 수준에서 바벌 샤프트를 잘라 포셉에 대한 위치입니다. 재생 성장하고, contralateral 바벌에 비해이 비행기와 관련하여 측정할 수 있습니다. 바벌 조직이 부상 2 주 이내에 최대한의 regrowth에 도달, 빠르게 다시 생성합니다.

재생 바벌을 분석하는 기술은 표준 DNA 전기 영동 젤의 우물에서 barbels의 일치하는 쌍 (재생 및 컨트롤)를 해부하고 삽입 등이 있습니다. 임베디드 표본이 편리 총 형태학 및 morphometry위한 stereomicroscope 아래 사진되며, 사전 등 파라핀의 조직학으로 하류 애플 리케이션에 몇 주 동안 저장 cryosectioning 및 / 또는 전체 탑재 immunohistochemistry 수 있습니다. zebrafish의 유전자 컨텍스트 내에서 다중 셀 유형의 재생 능력을 학습에 대한 생체내 조직 시스템의 소설로 상악 바벌 수립 이러한 방법.

Zebrafish 축산

Zebrafish는 표준 방법 ^1에 따라 위치해와 reared 수 있습니다. 후반 애벌레 기간 과거 zebrafish의 발달 단계는 꼬리 지느러미 (posteriormost hypural 판)의 기지로 윗입술의 anteriormost 시점에서 자사의 표준 길이 (SL) 또는 밀리미터에서 직선 거리로 측정할 수 ^2. 약 개월 게시물 수정 (10-12밀리미터 SL)에서, 비강과 상악 동의 barbels는 각각의 후각 구덩이 근처와 maxillae의 뒷부분 모서리 등 투명 상피 봉오리를 나타납니다. zebrafish가 성숙으로, barbels가 좁은, 수염 같은 부속으로 연장. 상악 바벌가 큰 (2-3 ㎜)과 조작하기 쉬운이기 때문에, 우리의 프로토콜에만이 특정 부위요 적용, 유사한 기술, 그러나, 작은 코와 수염 적응 수 있습니다.

바벌 클리핑

1. 시스템 물에 산도 7.0에 버퍼 (에틸 3 aminobenzoate methanesulfonate) 0.015 % MS - 222에 침수하여 원하는 단계 (예., 1.5-2.5 cm SL ~ 3~6개월 포스트 - 수정)에서 성인 zebrafish을 마취시키다. 수영 동작 그만 때까지 관찰하고 길 환기가 느린 일반됩니다. 물고기의 크기에 따라 완료 마취 약 2~5분 걸립니다.
2. 수족관 엄마랑 사용하여 배양 접시에있는 서부 유럽 표준시 종이 타월에 접혀 조각 한 번에 1-3 물고기를 전송합니다. 무딘 주걱을 사용하여, 동양 그들이 서로 왼쪽 측면쪽으로 평행하게되도록 물고기. 절차를 수행하는 동안 피부와 아가미가 촉촉한 유지까지 operculum으로 몸 전체를 덮고 물고기 (길도 포함)의 꼬리 부분에 젖은 종이 타월을 접어 부분입니다.
3. 머리 지역을 밝히는 낮은 앵글 입사 광을 사용하여 stereomicroscope 아래의 페트리 접시를 볼 수 있습니다. maxilla의 사후 복부 코너 (그림 1)에서 protrudes 왼쪽 턱의 수염의 기본에 중점을두고 있습니다.
   
   그림 1.
4. 단단히 maxilla의 가장자리에 약간 말초 바벌의 샤프트를 파악. 바벌 샤프트를 강화하고 포셉 단 근위 미세 밀고 스프링 가위의 문턱을 삽입합니다. 가위는 안정 포셉에 감동하실 수 있습니다. 최첨단의 maxilla의 가장자리에 도달 때까지 바벌의 축을 따라 가위의 문턱을 슬라이드. 바벌 샤프트 잘리는 가위를 닫습니다. 절단 바벌, 아직까지 포셉에 사로잡혔다는 고정 또는 추가 관찰을 위해 제거할 수 있습니다.
5. 즉시 표면 곰팡이 감염을 제어하는​​ 파란색 메틸렌 한 방울을 포함하는 청소 시스템 물 (~ 500 ML)의 작은 수조에 물고기를 전송합니다. 물고기가 하루 복구할 수 있습니다. 다음날 아침, 양육 시스템에 물고기를 반환합니다. 바벌 재생 2 주 후에 최대한입니다.

일치하는 바벌의 쌍을 아가르 퍼가기

1. 적절한 안락사 기술로 물고기를 모아 4 ° C에서 밤새 교반과 호수 (PBS)를 버퍼 4퍼센트 50 ML 튜브 paraformaldehyde - 인산염의 수정. 정착액 볼륨은 조직의 최소 10 배 볼륨해야합니다. 고정 후, 승인된 용기에 paraformaldehyde 폐기물의 처분과 PBS의 여러 변화에 철저하게 조직을 씻어.
2. 2 % 250 ML 유리 플라스크 150 ML에서 준비 아가로 오스 (T _M ~ 37 ° C) 증류수 인치 완전히 녹아까지 전자 레인지 또는 뜨거운 접시와 열, 주기적으로 agitating. 50-60 ° C의 물을 욕조에 녹은 솔루션을 평형.
3. 단단히 버퍼 챔버의 측면에 대해, 작은 gasketed 젤 곰팡이 (~ 100 ML 젤 볼륨 10 × 10cm) 배치하여 표준 젤 전기 영동 장비를 조립. 2-4 작은 이빨 샘플 빗 (4 X 1.5 mm)을 추가합니다.
4. 수준의 표면에 아주 얕은 우물을 형성 빗의 기반을 커버 그냥 금형에 녹아 아가로 오스를 부어. 즉시 온수 욕조에 다시 남은 아가로 오스를 넣어, 이것은 조직을 (9-12 단계) 포함 나중에 사용됩니다. 아가로 오스와 같은 온도로 피펫을 유지 술병에 긴 유리 파스퇴르 피펫 놔.
5. 20-30분에 대한 강화로 젤을 허용합니다. 빗를 제거한 후 버퍼 챔버에서 강화된 젤이 들어있는 겔 곰팡이를 제거합니다. 겔가 슬라이드되지 않도록 단단히 실험실 테이프로 겔 금형의 열린 측면을 테이프. 추가 아가로 오스가 (단계 13) 나중에 추가될 수 있도록이 테이프는 아가로 오스의 표면 여러 mm를 확장해야합니다.
6. stereomicroscope의 무대에 겔 금형을 놓습니다. 빈 우물을 확대하고 초점에 가장자리를 가져.
7. 잘 인접 아가로 오스의 표면에, 물 또는 고정 바벌의 표본 (예, 재생 및 제어)가 포함된 버퍼의 드롭을 피펫. UsiNG는 잘으로 촉촉한 표본을 드래그하여 아래로 밀어, 곤충 핀을 구부 러. 동양 바벌 샤프트의 서로 평행하고 잘의 반대 긴 가장자리에 대한 정렬. 표면 장력 위치에서 조직을 보유 도움이 될 것입니다.
8. 언제 포함 준비, 훌륭한 피펫 팁 또는 우물에서 여분 액체를 제거하는 실험실 조직의 모서리를 사용합니다. 조직가 건조하게하지 빨리 이렇게 작동합니다.
9. 예열 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 장소에서 바벌 조직을 봉인하기 위해 표본과 주변의 신선한 녹은 아가로 오스를 피펫. 너무 많이 넣다하지 마십시오. 아가로 오스는 견고하게하기 전에, 곤충 핀 지난 분을 조정합니다.
10. 잘 옆의 숫자 종이 표본 레이블을 장소와 아가로 오스의 작은 방울로를 확보.
11. 반복 표본의 각 잘 10을 통해 6 단계를 반복합니다.
12. 이미지 보정을위한 원하는 경우, 인쇄 마이크로 미터 규모 (예, 함께 종이를 삽입 http://incompetech.com/graphpaper/multiwidth/ 잘 빈의 맨 아래에). 우물의 바닥에 종이를 평평하게하고 따뜻한 아가로 오스로 커버.
13. 표본 모두 포함된 후, 젤의 표면은 아가로 오스의 경화 방울과 함께 불규칙한 것입니다. 평평한 표면에 젤을 놓고 상부 표면이 균일 때까지 부드럽게 녹아 추가 아가로 오스에 부어. 부드러운 표면을 얻기 위해 필요한 아가로 오스의 가장 작은 양을 사용하고 너무 아가로 오스는 전송 - 가벼운 사진을 흐릿하게 것입니다. 하든이 상위 계층을 허용합니다.
14. 젤 이제 각 바벌 쌍을위한 총 형태를 기록 stereomicroscope의 무대 사진 수 있습니다. 이미지 보정은 임베디드 마이크로 미터 규모를 사진 촬영하여 얻을 수 있습니다.
15. 전체 젤은 서부 유럽 표준시 종이 타올에 싸여 몇 주 동안 4 명이 한 비닐 봉투에 봉인 저장할 수 있습니다.
16. 자세한 분석을 위해, barbels의 일치하는 쌍을 포함하는 한천 블록은 메스 또는 레이저 블레이드로 젤 도려낸 수 있으며, 파라핀의 조직학에 대한 처리 또는 표준 방법에 의해 ^3,4 cryosectioning. 또는 개인 barbels는 물에 씻어서 잘 바늘과 아가로 오스 밖 해부 및 기타 다운 스트림 응용 프로그램 (예 : 전체 마운트 immunohistochemistry 또는 공촛점 현미경)을 처리할 수 있습니다.

zebrafish 턱의 수염은 zebrafish 여​​러 세포 유형의 성장, 유지 보수 및 재생을 공부 underutilized 조직 시스템입니다. 바벌의 돌출부가 더 인간 아날로그가 없다지만, 그것이 포함하고있는 세포 종류 고도 그것이 가능한 광학 명확하고 해부학적인 몸의 구조도 단순 원통형 구조로 피부 땀샘, melanocytes, 순환기 혈관과 신경을 연구하고, 보존하고 있습니다. 잘 공부 꼬리 지느러미와 마찬가지로, 바벌 조직이 절단하여 재생을 유도하실 수 있습니다. 해부 학적 랜드마크로 maxilla의 경계를 사용하여 절단 평면은 바벌 regrowth의 측정을 용이하게, 정확하게 삽입할 수 있습니다. 경험 교환 원을 연결 하시려면, 각각의 수술은 단 몇 초 정도 걸립니다. 복구는 신속하고, 우리는 지금까지 물고기의 행동에 아무런 단기 또는 장기 영향을 감지 없습니다. 한 상악 바벌 수영과 Zebrafish는 최대 6 개월 수술 후, 식사 및 비 수술 컨트롤처럼 효과적으로 번식하고, 조직 컬렉션의 시간을 비교 생존 있습니다. 이 수술의 생리적 영향 1) 바벌에서 실시 extraoral 입맛도 입술, 뺨과 머리 ⁵ 포함한 생선 상피의 다른 많은 부분에서 찾을 수 있기 때문에 최소한의 것으로 예측하고, 2) 차별 입맛이에 나타납니다 72 시간 내에 재생 바벌은 (레클레어 외., 게시되지 않은 데이터가 없습니다.) 이것은 상악 바벌 성인 척추의 컨텍스트 내에서 상처 치유, revascularization, 그리고 reinnervation 공부를위한 법으로서 시스템을 만듭니다.

중생의 수술 유도 후, barbels는 고정 조직의 morphometric 측정 및 / 또는 미세한 분석을위한 간격에서 수집된하실 수 있습니다. 편리, 상악 바벌는 cryosectioning 전체 마운트 immunohistochemistry, 그리고 현장에서 파라핀의 조직학 등 많은 표준 프로토콜의 응용 프로그램을 촉진 약 길이 (2-3 ㎜)와 zebrafish 배아의 직경 (1백~2백밀리미터)입니다 하이브 리다이 제이션. 함께 촬영이 기능은 턱뼈 ​​바벌 조직 수리 및 재생을 공부에 대한 생체내 모델에서 매우 가능합니다.

이러한 방법은 지원이 드폴 대학 연​​구위원회와 JT (DE016678)에 NIH / NIDCR R01 부여에 의해 제공되었다 JT의 연구실에서 연구 휴가 동안 장어에 의해 개발되었습니다. 우리는 기꺼이 캐롤라인 헌터, CMRC의 zebrafish 핵심 시설에 동물 보호 기술자와 폴리 Pawluczuk 우리 학부 실험실 조교의 노력을 인정합니다.

1. Westerfield, M. Ch. 1 General Methods for Zebrafish Care. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed., Univ. of Oregon Press, Eugene (2000).
2. Howe, J. C. Standard length: Not quite so standard. Fisheries Research (Amsterdam) 56, 1-7 (2002).
3. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J. & Zeller, R. Paraffin Embedding Tissue Samples for Sectioning. Cold Spring Harbor Protocols 6, doi:10.1101/pdb.prot4989 (2008).
4. Westerfield, M. Ch 8.3 Agar Embedding for Cryostat Sectioning of Embryos or Larvae. The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed., Univ. of Oregon Press, Eugene (2000).
5. Hansen, A., Reutter, K. & Zeiske, E. Taste bud development in the zebrafish, Danio rerio. Dev Dyn 223, 483-496, doi:10.1002/dvdy.10074 [pii]10.1002/dvdy.10074 [doi] (2002).

1 Comment

You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.