JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Arabic was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

التجمع ، وضبط واستخدام المجهر حقل قرب Apertureless الأشعة تحت الحمراء للتصوير البروتين

1, 2, 3, 1, 1

1Department of Chemistry, University of Toronto, 2Department of Chemistry, University of Wisconsin, 3Department of Chemistry, Duke University

Article
    Downloads Comments Metrics

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    This article is a part of   JoVE Biology. If you think this article would be useful for your research, please recommend JoVE to your institution's librarian.

    Recommend JoVE to Your Librarian

    Current Access Through Your IP Address

    You do not have access to any JoVE content through your current IP address.

    IP: 54.91.159.232, User IP: 54.91.159.232, User IP Hex: 911974376

    Current Access Through Your Registered Email Address

    You aren't signed into JoVE. If your institution subscribes to JoVE, please or create an account with your institutional email address to access this content.

     

    Summary

    وصفت جمعية المجهر nearfield الأشعة تحت الحمراء للتصوير المجاميع البروتين.

    Date Published: 11/25/2009, Issue 33; doi: 10.3791/1581

    Cite this Article

    Paulite, M., Fakhraai, Z., Akhremitchev, B. B., Mueller, K., Walker, G. C. Assembly, Tuning and Use of an Apertureless Near Field Infrared Microscope for Protein Imaging. J. Vis. Exp. (33), e1581, doi:10.3791/1581 (2009).

    Abstract

    هذه الورقة تهدف إلى إرشاد القارئ في تجميع وتشغيل المجهر القريب من الأشعة تحت الحمراء للتصوير الميداني أبعد حد الانكسار. وapertureless قرب الميدان المجهر هو ضوء نثر من نوع الصك الذي يتيح أطياف الأشعة تحت الحمراء في القرار حوالي 20 نانومتر. وهناك قائمة كاملة من العناصر ، وبروتوكول خطوة بخطوة للاستخدام. وتناقش الأخطاء الشائعة في تجميع وضبط الصك. وقدم ممثل مجموعة البيانات التي تظهر بنية الثانوية لييف اميلويد.

    Protocol

    الخلفية :

    Apertureless المجهري مسبار الأشعة تحت الحمراء القريبة من الحقل عروض عالية القرار التصوير المكاني. وهو تقنية جديدة نسبيا التي متناثرة شعاع الحادث الأشعة تحت الحمراء من قبل طرف حاد القوة الذرية (AFM) المجهري تتأرجح على تردد الرنين للناتئ على مقربة من العينة. وكشف عن الأشعة تحت الحمراء يجمع الضوء المتناثرة وdemodulated في هذه تردد الرنين أو التوافقيات والخمسين. بهذه الطريقة ، يمكن تخفيض مبعثر خلفية الحادث شعاع الليزر يركز على ما تبقى من سطح العينة ، ويمكن التوصل إلى حل المكانية ما هو أبعد من الحد حيود الضوء للحصول على النقيض من الأشعة تحت الحمراء مع النانو ط القرار المكانية والثاني والثالث . منذ قمة غيض فؤاد أصغر بكثير من مجالات تركيز شعاع الليزر ، وعلى ضوء متناثرة ضعيفة. يتم تعيين من أجل تعزيز هذا المجال متناثرة ، يستخدم متجانسة التقارن الكشف حيث يتم إضافة حقل مرجع إلى حقل متناثرة جمعها والتخلص النسبي لتلك المجالات التي تدخل أقصى البناء يحدث في كاشف. كثافة نثر ومن ثم يتناسب مع حجم الرابع مرجع الحقل الكهربائي والخامس والسادس. مسألة هامة في مجال التصوير القريب هو تجنب القطع الأثرية التي تنتجها ض اقتراح من طرف فؤاد السابع والثامن والتاسع والعاشر ، والحادي عشر. ويمكن تخفيض هذه المشكلة مع التعديل المناسب للمرحلة متجانسة التقارن الميزات الطبوغرافية واستبعاد كبيرة ، كما يتضح من قبل مولر وآخرون ومن ثم استخدام هذه التقنية بشكل صحيح للحصول على الطيف تناثر المواد التجريبية مع دقة المكاني لأقل من 30 نانومتر 15 . وقد تم استخدام بالقرب من الميدان المجهري للمواد البيولوجية أثبتت سابقا ، ولا سيما بالنسبة للجزيئات مثل فسيفساء التبغ فيروس الثاني عشر والثالث عشر كولاي البكتيريا.

    في هذا التقرير ، إلا أننا توضيح تجميع مثل جهاز التصوير ملف. نقدم أيضا المعلومات الثانوية هيكل ييفات أميلويد يتكون من جزء من الببتيد # 21-31 β 2 م حصلت عليها الحقل القريب من الأشعة تحت الحمراء apertureless المجهر (ANSIM). وتجمع بالقرب من الميدان الصور بالتزامن مع التضاريس ، وتمكن من اكتشاف وجمع من الطيف تناثر ييفات الفردية.

    لدينا apertureless قرب الميدان المسح بالأشعة تحت الحمراء المجهر (ANSIM) هو جهاز قياسات محلية الصنع. يظهر التخطيطي للمخطط تجريبي في الإعداد 1. ويستخدم مجهر فؤاد (المتعدد ، Veeco الآلات ، وسانتا باربرا ، كاليفورنيا) لقياس تضاريس العينة وكذلك إنتاج ونثر قرب الميدان تعزيز التضمين في الطرف تردد الذبذبة. يتم استخدام التنصت على وضع والبلاتين المغلفة NSC14/Ti-Pt الكابولي (MicroMasch واستونيا) لتعزيز تناثر المستمر ، ليزر تحت الحمراء الانضباطي (نطاق التردد : 2000 إلى 1600 سم -1 سم -1 ، ليزر غاز ثاني أكسيد الكربون PL3 ، ادنبره الآلات وبريطانيا العظمى) بالقرب من السطح. ويستخدم الليزر الهليوم نيون (ميليس Griot ، البوكيرك ، نيو مكسيكو) حقل كدليل للأشعة تحت الحمراء غير المرئية. يتم نشر ضوء الليزر تحت الحمراء نحو العدسة بعد اجتياز عاكس ZnSe جزئية. وتركز ثم وضعها على قمة الطرف فؤاد تتأرجح ، مع استقطاب شعاع مواز لمحور طويلة من التحقيق. ثم يضاف للإشعاع الأشعة تحت الحمراء التي جمعتها عدسة إشارة إلى مرجع متجانسة التقارن. ويستخدم مرآة paraboloidal لتركيز الأشعة تحت الحمراء على جهاز الكشف عن الزئبق تلوريد الكادميوم الأشعة تحت الحمراء (MCT) (Graseby الأشعة تحت الحمراء ، وأورلاندو ، فلوريدا). ويستخدم برنامج تشغيل بيزو (Thorlabs ، نيوتن ، نيوجيرسي) لتعظيم إشارة الكشف عن طريق تصحيح مرحلة ضوء متجانسة التقارن. تلصق بحزم معظم المكونات البصرية المذكورة أعلاه على منصة وتحول في المواقف أو XY Z باستخدام مرحلة متعدية. تبث الكسر المتردد للإشارة إلى الكشف عن تأمين في مكبر للصوت (نموذج SR844 الترددات اللاسلكية ، وأنظمة ستانفورد للأبحاث ، سانيفيل كاليفورنيا) التي demodulates إشارة في الطرف تردد الذبذبة. ويلاحظ شدة تبعثر كما غيض فؤاد بفحص عينات من السطح ويتم الحصول على بيانات التضاريس بشكل متزامن. البرمجيات المستخدمة لجمع البيانات والصورة V5.31r1 Nanoscope (Veeco الآلات ، وسانتا باربرا ، كاليفورنيا).

    Scheme1
    مخطط 1

    الشكل 1 -- يبين أجزاء من نظام التصوير التي تستخدم التجمع ونحن سوف يصف
    figure1

    0) الجدول البصرية
    1) قاعدة فؤاد MM
    2) من ماسح فؤاد MM
    3) ارتفاع اللوح البصرية
    (13 "× 18" س 3 / 8 "، Thorlabs)
    4) المرايا التوجيهية (مطلية بالذهب ، 1 "ديا).
    6) بصري عاكس مكعب جزئية ث / ZnSe
    7) أنبوب البصرية المستخدمة لتأمين الإعداد على منصة رفع (17)
    8) هدف IR
    (FL 16 ملم ، NA 0.28 في إيلينغ)
    9) أنبوب بصري للضوء الخلفية متناثرة جمعها
    10) مكعب ث / خارج المحور مرآة paraboloidal
    (90 درجة مئوية ، FL 5 "، يانوس)
    11) مكعب لعقد لوحة قه @ 45 درجة
    12 العدسة ميكروسكوب) (X10)
    13) XY المرحلة شنت الثقب (0.5 ملم)
    14) الأشعة تحت الحمراء للكشف عن MCT (Graseby الأشعة تحت الحمراء)
    15) الأشعة تحت الحمراء للكشف عن preamp (AC و DC)
    16) XY المرحلة لتحريك الموقف شعاع
    17) الجدول إعلاء لتركيز شعاع
    18) Z - المرحلة لموقف كاشف الأشعة تحت الحمراء
    19) X - المرحلة لموقف كاشف الأشعة تحت الحمراء

    الشكل 1

    أولا الجمعية الأولي من الإعداد البصرية

    التجمع خطوة I.1

    التجمع الإعداد الضوئية وضبط المرايا مع وموقف الهليوم النيون موازية شعاع (HeNe) الى طاولة الضوئية (0) في الارتفاع الصحيح نحو (H) فوق اللوح البصرية (3) والمسافة (D) من مركز الماسح الضوئي (2).

    يمكن أن يكون هذا الارتفاع المقدر H و D المسافة من الارتفاع (H1) من العينة على رأس الماسح الضوئي (2) من الجدول البصرية ، وزاوية المرجوة من وقوع (α) ، وارتفاع أعلى اللوح فوق الطاولة البصرية (ح) ، هندسية أحجام من المكعب الضوئية والأشعة تحت الحمراء الهدف (6 و 8 في الشكل 1) وبعد عمل الأشعة تحت الحمراء للهدف جميع معا ، وهنا د = 1 "+2" +2 ")

    الشكل 2
    الشكل 2

    H = H1 + د * الخطيئة (α) ، ح

    D = د * كوس (α)

    التجمع خطوة I.2

    الشكل 3
    الشكل 3

    الشكل 3 : بدون beamsplitter في المكعب (5) والبصرية مع أنبوب ممدود في الطرف الآخر من المكعب (6) مباشرة وني شعاع من خلال قزحية العين تعلق في نهايات الأنابيب.

    التجمع خطوة I.3

    الشكل 4
    الشكل 4

    الشكل 4 : مع الماسح الضوئي (2) إزالة أنبوب طويل إرفاق البصرية مع القزحية في نهاية بدلا من الهدف الأشعة تحت الحمراء. إدراج عاكس ZnSe جزئية لتوجيه شعاع في اتجاه عينة عن طريق السفر إلى أسفل أنبوب طويل البصرية. وينبغي أن يتم تنظيمها عاكس ZnSe جزئية بحيث شعاع HeNe يضرب سطح عاكس للجبهة في وسط هندسي من المكعب البصرية عقد عاكس جزئية.

    الشكل 5
    الشكل 5

    الشكل 5 : من خلال تناوب جزئية العاكس ، وتوجيه شعاع من خلال قزحية HeNe الإخراج مغلقة. منذ جبل العاكس جزئية لا لأنه عقد عمودي بالضبط ، هناك نوعان من مسامير مثبتة التكيف المنزل ، والسماح لحركة عمودية من شعاع. استخدام هذه إذا لزم الأمر.

    الشكل 6
    الشكل 6

    التجمع خطوة I.4

    الشكل 6. جبل المرآة paraboloidal مع - O الحلقات المطاطية في المكعب الضوئية (انظر 1 ، الشكل 5). من خلال تشديد الخناق ، ضغط O - الخواتم ، والسماح للتكيف المرآة.

    الشكل 7 الشكل 7

    مع المرايا إضافية (ويرد احد على الشكل 7) توجيه شعاع HeNe في الاتجاه المعاكس ، كما هو موضح في الشكل 7. ضبط لتمرير شعاع من خلال قزحية العين المستخدمة سابقا. وسيتم استخدام هذا التردد لضبط المرآة paraboloidal.

    الشكل 8
    الشكل 8

    الشكل 8 : مرآة وضعت في paraboloidal المكعب البصرية (10) يعكس الضوء نحو موقف كاشف. مسامير التكيف توجيه شعاع من خلال الثقب وضعها في إخراج مكعب (11) ، والذي سيعقد في (GE) الجرمانيوم النافذة. بعد ضبطها من خلال الثقب شعاع ، ضع د MCTetector قريبة من الثقب. ضبط الموقف من هذه الأشعة تحت الحمراء للكشف عن انه ني شعاع على عنصر الاستشعار عن بعد للكشف. نقل كاشف ملم بنسبة 2 ~ (سيتم تحويل IR شعاع بنسبة إطار قه).

    التجمع خطوة I.5

    الشكل 9
    الشكل 9

    الرقم 9 : إدراج جبل مع نافذة قه في المكعب البصرية (11). المضاد للانعكاس (AR) مغلفة قه نافذة بمثابة فلتر الأشعة تحت الحمراء والملاحظات تصاريح المرئي للناتئ والعينة. إرفاق العدسة (12). التواء زاوية مكعب (11) فيما يتعلق مكعب (10) يسمح احد لنقطة العدسة في الاتجاه المطلوب. عن طريق تناوب جبل إطار قه ، يتم توجيه شعاع HeNe خلال منتصف العدسة.

    الرقم 10
    الرقم 10

    الرقم 10 : توصيل IR الهدف (8) وفؤاد الماسح الضوئي (2). إرفاق beamstop إلى نهاية الإخراج من أنبوب البصرية (5). استخدام مرشح الحماية عند عرض شعاع HeNe من خلال العدسة. الموقف عينة على الماسح الضوئي وتوجيه شعاع HeNe من خلال أنبوب الإدخال الضوئية (5). تأكد من أن شعاع HeNe واسعة بما يكفي ليمتد من beamstop. يستخدم beamstop بسبب Cassegrain الهدف ، الذي يجمع سوى ضوء الواردة من المحيط الخارجي للشعاع. عن طريق ضبط الخيط من العدسة ويتم الحصول على صورة حادة من شعاع HeNe ركزت على العينة.

    التجمع خطوة I.6

    مطلوب تسوية النهائية للمرآة paraboloidal. يتم استبدال الثقب الإخراج مع القزحية في تنسيق الموقف من المرآة paraboloidal. إزالة الإطار قه وكاشف الأشعة تحت الحمراء (علامة موقف كاشف الأشعة تحت الحمراء!). إرفاق عدسة إضافية بعد القزحية على طول التنسيق التقريبية للعدسة من القزحية. في هذه اللحظة يجب أن تكون مرئية تعزية تعمل من خلال العدسة. ضبط الموقف من المرآة إلى مركز paraboloidal نهاية غيض من خلال قزحية مغلقة. لاحظ أنه عندما يتركز بشكل صحيح شعاع HeNe على طرف ، فإنه يجعل البريق الساطع بين التلميح وانعكاس ذلك على سطح العينة. إعادة إرفاق نافذة قه ؛ تعديله لملاءمة الملاحظة البصرية للتعزية. استبدال القزحية مع الثقب وتذكر أنه يجب أن تحول الثقب المستخدمة للكشف عن الأشعة تحت الحمراء خارج المركز بسبب النزوح شعاع الأشعة تحت الحمراء من خلال النافذة قه. مكان كاشف الأشعة تحت الحمراء في موقف ملحوظة سابقا.

    أخيرا ، ويوجه شعاع الأشعة تحت الحمراء بحيث يسافر مع شعاع HeNe مرئية تستخدم لضبط.
    الآن كل شيء يجب أن يكون جاهزا للتكيف الروتينية.

    التعديل الروتيني :

    خطوة التعديل A.1 :

    المواءمة مع HeNe - بالليزر

    انه من الاسهل لمحاذاة مع HeNe مرئية (632nm) من الأشعة تحت الحمراء غير المرئية مع (حوالي 6μm).

    مسار HeNe من الحزم والأشعة تحت الحمراء معا في المرآة tiltable. إذا كان يميل إلى أسفل هذه المرآة يمكن تمرير HeNe ، إذا كانت المرآة هي في موقف شعاع IR يكاثر إلى الإعداد القريبة من الميدان. لمحاذاة واحدة من الحزم فقط ، واستخدام اثنين من المرايا وليس في المسار المشترك مع الآخرين وتقع أمام المرآة tiltable. إذا كنت قد انتقلت عن طريق الخطأ مرآة أخرى ، أول محاولة لتحقيق هذه المرآة في العودة إلى موقفها القديم.

    A.1.1. الخشنة محاذاة مع اثنين من مرايا

    استخدام المرايا أخريين على وشك HeNe الليزر لمحاذاة شعاع من خلال قزحية العين وعلى طول الطريق الى المرحلة القريبة من الميدان. اذا نظرتم الى الحزم في الذراع متجانسة التقارن ، ينبغي مراعاة التشكيل شعاع الإكليل مثل (بسبب مانع في أنبوب شعاع ضوئي). هذا يشير إلى أن شعاع يمر مباشرة من خلال الأنابيب.

    A1.2. التوافق مع غرامة القريبة من المرحلة الميدانية

    نعلق رئيس فؤاد وإشراك طرف ناتئ على العينة. تركيز شعاع HeNe على نهاية ناتئ التصوير. إذا كان القيام بذلك يزيح شعاع من منتصف الأنبوب المدخلات البصرية (5) خطوات ضبط تكرار A.1. وA.1.2. حتى يتركز شعاع.

    عن طريق تحريك المرحلة متعدية البصرية ، ويتم ضبط الهدف يعكس مجهر لتركيز الضوء على قمة رأس ناتئ ، حيث تنتشر عليه.

    تدوير المرآة قه تحت العدسة (الموجود في المكعب البصرية) وننظر من خلال العدسة. وتركز شعاع عند هذه النقطة (أو على جهاز كشف الأشعة تحت الحمراء عندما يتم سحبها مرآة قه من المكعب) بواسطة المرآة paraboloidal. نقل المرحلة الخلف أو إلى الأمام حتى لوحظ على صورة حادة من طرف وانعكاسها على سطح العينة. س استخدام twoهناك اتجاهات (أعلى / أسفل ويمين / يسار) لوضع غيض فؤاد تقريبا في منتصف العدسة.

    يبحث من خلال التلسكوب ، لوحظ أن ناتئ فؤاد وطرفها. مرة أخرى ، تذكر أن استخدام مرشح الحماية عند عرض شعاع HeNe. دون شعاع HeNe ، يلاحظ وجود لا تزال بعض الضوء الأحمر الذي ينبع من ضوء داخلي للتحكم عن بعد فؤاد. تحرك في المرحلة متعدية و / أو اليمين واليسار حتى أسفل الاتجاه حتى لوحظ البريق الساطع الحمراء على قمة الحافة. إذا محاذاة سيئة الى حد ما ، إلى مرحلة نقل يسار فؤاد والتحرك إلى اليمين ببطء. مراقبة انعكاس الحمراء تتحرك عبر سطح العينة العاكسة. إذا كان لا يزال هو انعكاس أحمر لا تراعى ، وتترجم هذه المرحلة إلى اليسار مرة أخرى والتحرك بطريقة تصل إلى أسفل. ترجمة إبقاء اليسار واليمين ، حتى تصل إلى أسفل لوحظ البريق الأحمر كما كنت تركيز شعاع HeNe على قمة الطرف فؤاد.

    A1.3. تداخل الحقل متجانسة التقارن مع الضوء المتناثرة

    فتح الذراع متجانسة التقارن ونظرة شاملة العدسة. وينظر الى ثلاثة أو أكثر من البقع في خط مع تناقص كثافة وهذه البقع هي نتيجة انعكاسات متعددة على الجبهة والمؤخرات البصريات مختلفة. تحرك المرآة في الذراع متجانسة التقارن بحيث المركز الثاني (من القاع وكثافة) تتداخل مع الصورة المشرقة للقمة ، الذي هو طرف فيها وانعكاسه يأتون معا.

    A1.4. موقف كاشف

    إزالة مرآة قه وشعاع HeNe يجب ان تذهب في الاتجاه حيث يقع كاشف الأشعة تحت الحمراء. وراء أنبوب بصري ، لوحظ مركزين ringlike. المركز الثاني (في الشدة) هو المكان الذي يجب ان تذهب من خلال ثقب من الحرارة احباط الحماية على وجه كاشف الأشعة تحت الحمراء. وينبغي أن ينظر إلى بقعة مع أعلى كثافة على الحدود من الحفرة.

    A1.5. تغيير واحد من عينة إلى أخرى

    بعد تغيير نموذج غيض فؤاد لم يعد في موقف نفسه بالضبط كما كان من قبل ، ولكن لا ينبغي أن يكون بعيدا جدا خارج. تبدأ الخطوة A.1.2 ، لأن الفرق هو عادة ليست كبيرة جدا.

    ملاحظة : إذا كان التوافق هو خارج ، تحقق لمعرفة ما إذا كان لا يزال شعاع HeNe يذهب من خلال قزحية العين في جميع ويخلق التألق أحمر على الطرف فؤاد. أحيانا كنت لا تلاحظ أن كنت قد لمست وانتقلت بالتالي مرآة من موقعها الأصلي. إذا محاذاة لا تزال سيئة ، للأسف إجراء محاذاة كله أن يتم الانتهاء من جديد.

    التعديل خطوة 2 : محاذاة الشعاع الأشعة تحت الحمراء

    سيتم استخدام ليزر ثاني خط مع كثافة عالية / الطاقة (لا يقل عن 100 ميغاواط) ، وهذا جعل المحاذاة أسهل. ملء كاشف مع النيتروجين السائل ، والسماح لها يوازن ما لا يقل عن 30 دقيقة.

    2.1. الخشنة محاذاة مع اثنين من مرايا

    وضع السلطة متر خلف القزحية أول من رصد قوة شعاع الأشعة تحت الحمراء واردة. المقبل ، وضبط المرآة التي تقع أمام المرآة tiltable للحصول على قراءة أعلى سلطة. تأخذ السلطة متر والاحتفاظ بها وراء قزحية العين التي هي أقرب إلى مرحلة شبه الميدانية وضبط المرآة tiltable حتى يتم الحصول على أقصى قدر من السلطة القراءة. كرر هذه الخطوة عدة مرات من أجل التكيف الأمثل.

    2.2. يراقب الإشارات 1F

    مرجع القفل في مكبر للصوت يجب تعيين لعزل تواتر غيض التردد التذبذب من خلال وضع ل1F (الهاتف) ، والذي هو تواتر التذبذب فؤاد. تعيين حجم المؤامرة مسح في وضع القوة في البرنامج Nanoscope إلى 3 ميكرون. بعد التعديل الخشنة في 2.1. ، والبحث عن الشكل الصحيح للإشارة 1F. المقبل ، تصل قيمتها في المرحلة بين الضوء المتناثرة التي جمعت من طرف والضوء homodyned متجانسة التقارن من الذراع عن طريق ضبط سائق بيزو. هذا يدفع المرآة في الذراع متجانسة التقارن عن طريق تغيير الجهد للبيزو بحيث الحد الأدنى الأولى للإشارة 1F حوالي 500 نانومتر بدءا من الصفر. لأن كل تغيير في محاذاة وتغيير طول كل من مسارات الضوء ، وبالتالي مراحلها النسبي ، وهي مرحلة يحتاج إلى تصحيح مع بيزو.

    ماذا تشاهد (إشارة 1F)؟
    سوء التوافق : وسيراعى في اثنين من المطبات على حجم ميكرون 3 مسح ض.
    متوسط ​​محاذاة : وانحناء عثرة first تبدو أكثر قليلا من مقعرة محدبة والثاني هو نتوء أصغر من الأولى.
    (تقريبا) محاذاة جيد : وسيراعى في اثنين من المطبات. عثرة الأول هو أعلى من عثرة الثانية ، والانحناء على الجانب الأيمن من عثرة الأولى سوف تكون سلبية (مقعرة).
    ما يجب القيام به من أجل المحاذاة؟
    سوء التوافق : كرر الإجراء في الخطوة 2.1 المحاذاة على النحو المطلوب. لأن شعاع قطره IR كبيرة ، ومعظم من الحزم تمرير القزحيات حتى لو لم تكن تتماشى تماما. حتى إذا لاحظ مازال اثنان المطبات ، ويمكن زيادة المبلغ للإشارة 1F بواسطة ضبط أحد أو كل من المرايا المحاذاة. مراقبة تغييرات طفيفة في انحناء عثرة الأولى. الأهم من ذلك كله ، ان نتحلى بالصبر لأن هذا هو الجزء الأكثر صعوبة في المحاذاة.
    متوسط ​​محاذاة : محاولة لضبط واحد أو كلا من المرايا محاذاة للحصول على محاذاة جيدة تقريبا. حاول تحريك المرحلة XYZ متعدية أيضا ، ولكن تعديله بزيادات صغيرة جدا.
    (تقريبا) محاذاة جيد : ضبط المرايا ، ومحاولة لزيادة الحد الأقصى للنتوء الأولى. وعادة ما تكون إشارات 1F حول 8-16 الخامس ، للقوى المدخلات المنخفضة هو أقل من ذلك. تغيير المرحلة من خلال تغيير الجهد باستخدام برنامج بيزو بحيث الحد الأدنى الأول يأتي اقرب الى الصفر. إذا كان هناك إشارة 1F كبيرة ، والتبديل مرجع القفل في مكبر للصوت لعزل إشارة 2F. ينبغي مراعاة بعض الإشارات ومحاولة تحسينه أكثر قليلا للغاية من جانب ضبط المرايا قليلا وتغيير المرحلة.

    2.3. تغيير واحد من عينة إلى أخرى

    تنفيذ الخطوة A.1.5 تحت محاذاة شعاع HeNe. إشراك طرف فؤاد ونشر شعاع الأشعة تحت الحمراء من خلال المجهر. مشاهدة إشارة 1F. إذا لوحظ تزال إشارة 1F ، وضبط المرآة tiltable وضبط المرحلة. قد لا يزال هناك إشارة جيدة إذا وبالتالي إشارة جيدة 2F يتعين مراعاتها. إذا لم يكن كذلك ، ناعما محاذاة الشعاع باستخدام الخطوة 2.2.

    ممثل النتائج :

    تحضير عينة تم تصنيعه والببتيد # 21-31 في مركز للتكنولوجيا الحيوية والهندسة الحيوية في جامعة بيتسبرغ وتنقيته (> 95 ٪) من HPLC. لتجميع ييفات اميلويد ، 0.8 ملغ من TMAO (سيغما الدريخ) أضيفت الى حل ل1 ملم # 21-31 الببتيد في الماء MΩ 18 ، مماثلة لإجراءات التي تنفذها يانغ وآخرون. الرابع عشر

    وأدلى Ultraflat ركائز الذهب الخامس عشر. أودع 40 ميكرولتر من الحل لشهر واحد القديمة (غرفة الحضانة في درجة الحرارة ، ودرجة الحموضة 5.5) لعدة دقائق على ركائز جديدة ultraflat الذهب. وتشطف أنهم مع تيار من المياه MΩ 18 ، المجففة مع تدفق الغاز وN 2 المتمركزة في صك ANSIM.

    الرقم 11 يظهر بالقرب من التضاريس والصور التي تم جمعها ميدانيا لييفات # 21-31 الببتيد. أ) الحصول على الصور الطوبوغرافية في وقت واحد مع صورتها القريبة من الحقل المقابل. التسميات تمثل ييفات الفردية وتستخدم لميزة نوع من التشكل والثانوي في كل لييف. باء وجيم) الموافق قرب الميدان الصور التي تم جمعها في اثنين wavenumbers مختلفة : 1631 و 1691 سم -1. وتبلغ مساحة كل صورة هي 1 × 1 ميكرون 2. مقياس اليسار يمثل الارتفاع ، مقياس الحق هو الحقل متناثرة من القفل في مكبر للصوت.

    الرقم 11
    الرقم 11

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Acknowledgements

    نحن نعترف بامتنان جبهة الخلاص الوطني ، NSERC ، المعاهد الوطنية للصحة ، وONR.

    References

    1. Mueller, K., Yang, X., Paulite, M., Fakhraai, Z., Gunari, N., Walker, G.C. Chemical imaging of the surface of self-assembled polystyrene-b-poly(methyl methacrylate) diblock copolymer films using apertureless near-field IR microscopy. Langmuir, 24, 6946-6951 (2008).
    2. Lahrech, A., Bachelot, R., Gleyzes, P., Boccara, A.C. Infrared-reflection-mode near-field microscopy using an apertureless probe with a resolution of lambda/600. Opt. Lett., 21, 1315-1317 (1996).
    3. Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. Performance of visible and mid-infrared scattering-type near-field optical microscopes. J. Microsc., 210, 311-314 (2003).
    4. Kim, Z.H., Leone, S.R. Polarization-selective mapping of near-field intensity and phase around gold nanoparticles using apertureless near-field microscopy. Optics Express, 16, 1733-1741 (2008).
    5. Bridger, P.M., McGill, T.C. Observation of nanometer-scale optical property discrimination by use of a near-field scanning apertureless microscope. Opt. Lett., 24, 1005-1007 (1999).
    6. Stebounova, L., Akhremitchev, B.B., Walker, G.C. Enhancement of the weak scattered signal in apertureless near-field scanning infrared microscopy. Rev. Sci. Instrum. , 74, 3670-3674 (2003).
    7. Akhremitchev, B.B., Pollack, S., Walker, G.C. Apertureless Scanning Near-Field Infrared Microscopy of a Rough Polymeric Surface. Langmuir, 17, 2774 - 2781 (2001).
    8. Hecht, B., Bielefeldt, H., Inouye, Y., Pohl, D.W., Novotny, L. Facts and Artifacts in Scanning Near-Field Optical Microscopy. J. Appl. Phys. , 81, 2492-2498 (1997).
    9. Labardi, M., Patane, S., Allegrini, M. Artifact-free near-field optical imaging by apertureless microscopy. Appl. Phys. Lett., 77, 621-623 (2000).
    10. Palanker, D.V., Simanovskii, D.M., Huie, P., Smith, T.I. On Contrast Parameters and Topographic Artifacts in Near-Field Infrared Microscopy. J. Appl. Phys., 88, 6808-6814 (2000).
    11. Akhremitchev, B.B., Sun, Y., Stebounova, L., Walker, G.C. Monolayer-Sensitive Infrared Imaging of DNA Stripes Using Apertureless Near-Field Microscopy.Langmuir, 18, 5325-5328 (2002).
    12. Brehm, M., Taubner, T., Hillenbrand, R., Keilmann, F. Infrared Spectroscopic Mapping of Single Nanoparticles and Viruses at Nanoscale Resolution. Nano Lett., 7, 1307-1310 (2006).
    13. Dazzi, A., Prazeres, R., Glotin, F., Ortega, J.M. Analysis of nano-chemical mapping performed by an AFM-based ("AFMIR") acousto-optic technique. Ultramicroscopy, 107, 1194-1200 (2007).
    14. Yang, D.S., Yip, C.M., Huang, T.H.J., Chakrabartty, A., Fraser, P.E. Manipulating the Amyloid-β Aggregation Pathway with Chemical Chaperones. J. Biol. Chem. , 274, 32970-32974 (1999).
    15. Meadows, P.Y., Walker, G.C. Force Microscopy Studies of Fibronectin Adsorption and Subsequent Cellular Adhesion to Substrates with Well-Defined Surface Chemistries. Langmuir, 21, 4096-4107 (2005).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter