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 JoVE Biology

Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​con il NanoDrop 2000c Spettrofotometro

1, 1, 1

1Thermo Scientific NanoDrop Products

Article
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    Summary

    Campioni microvolumi sono quantificati da un sistema spettrofotometro che utilizza naturale tensione superficiale di conservare i campioni senza l'uso di cuvette o capillari. La gamma dinamica di concentrazioni di proteine ​​e la velocità con cui possono essere misurati sono notevolmente aumentata con questo metodo.

    Date Published: 11/04/2009, Issue 33; doi: 10.3791/1610

    Cite this Article

    Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (33), e1610, doi:10.3791/1610 (2009).

    Abstract

    Spettrofotometria tradizionale richiede ponendo i campioni in cuvette o capillari. Questo è spesso impraticabile a causa del volume campione limitato spesso utilizzati per l'analisi delle proteine. La Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spettrofotometro risolve questo problema con un innovativo sistema di ritenzione del campione che tiene campioni microvolumi tra due superfici di misura utilizzando le proprietà di tensione superficiale dei liquidi, consentendo la quantificazione di campioni in volumi più bassi 0,5-2 microlitri. L'eliminazione di cuvette o capillari consente di modificare in tempo reale lunghezza del percorso, che riduce il tempo di misura mentre aumentando notevolmente la gamma dinamica delle concentrazioni di proteine ​​che possono essere misurati. La necessità di diluizioni è anche eliminata, e preparati per la quantificazione del campione sono relativamente facili come le superfici di misurazione può essere semplicemente cancellato con laboratorio pulire. In questo articolo video presenta le modifiche ai metodi tradizionali di proteine ​​concentrazione determinazione per la quantificazione degli importi microvolumi di proteine ​​utilizzando A280 letture di assorbanza o il saggio colorimetrico BCA

    Protocol

    I. Il NanoDrop 2000c spettrofotometro

    NanoDrop tecnologia si basa su un innovativo sistema di ritenzione di esempio che utilizza la tensione superficiale di tenere e misurare campioni microvolumi tra due piedistalli ottico senza l'uso di cuvette o capillari. Il NanoDrop 2000c spettrofotometro utilizza questa tecnologia per misurare rapidamente e facilmente 0,5-2 ml di gocce proteine, DNA, RNA, e altre biomolecole. Questa capacità è diventato sempre più importante come si evolvono continuamente le tecniche molecolari di utilizzare piccole quantità di materiale per l'analisi. L'ideale spettrofotometro microvolumi per le condizioni in cui è limitato campione. Tuttavia, la facilità d'uso, ciclo di misura veloce e, e gamma di concentrazione estesa anche fare lo spettrofotometro adatto quando grandi quantità di campione sono disponibili. Il ciclo di misura è inoltre notevolmente ridotto, aiutando gli scienziati aumentare l'efficienza per tutta la loro flussi di lavoro.

    Il microsample è posizionato direttamente sulla parte superiore della superficie di rilevamento e una colonna di liquido si crea tra le estremità delle fibre ottiche dalla tensione superficiale. Questa colonna liquida forma un percorso verticale ottico. Una lampada flash allo xeno fornisce la fonte di luce e uno spettrometro utilizza un CCD lineare viene utilizzato per analizzare la luce che passa attraverso il campione.

    Rimozione dei dispositivi di contenimento tradizionali come cuvette dal sistema presenta diversi vantaggi: piccole quantità di campione sono necessari per la misura, la pulizia richiede semplicemente strofinando le superfici ottiche con un laboratorio pulire, e la lunghezza del percorso può essere modificato in tempo reale durante la misurazione.

    Il 2000c NanoDrop determina la lunghezza ottimale percorso automaticamente (1 mm a 0,05 mm), fornendo la più ampia gamma di misure possibili concentrazione proteica senza diluizioni. Accorciando la lunghezza del percorso, più alte concentrazioni di proteine ​​può essere misurata. Questo rimuove efficacemente la necessità di effettuare diluizioni dei campioni più proteine. Ad esempio, il 2000c NanoDrop in grado di misurare le concentrazioni di BSA alto come 400 mg / ml.

    Il NanoDrop 2000c spettrofotometro è uno spettrofotometro spettro per misurare la densità ottica di DNA, RNA, proteine ​​e altre biomolecole. Questo protocollo video sarà incentrato sulla misurazione delle proteine.

    II. Microvolumi Concentrazione Determinazione delle proteine ​​Utilizzando A280 Misure Assorbanza

    a. Principio di A280 Misure

    Il metodo A280 proteina è applicabile a proteine ​​purificate che contengono triptofano, tirosina, fenilalanina o residui di cisteina-cisteina legami disolfuro e assorbanza esporre a 280 nm. Questo metodo utilizza il valore di assorbanza A280 in combinazione con il coefficiente di estinzione di massa o il coefficiente di estinzione molare per calcolare la concentrazione della proteina purificata. Il vantaggio di diretto A280 misure è che la generazione di una curva standard non è necessario per determinare la concentrazione di proteine. Se il campione è una soluzione proteica non caratterizzato, lisato cellulare, o l'estratto di proteina grezza, quindi utilizzando uno dei metodi colorimetrici preconfigurato disponibile sul 2000/2000c NanoDrop, come ad esempio BCA, Pierce 660 nm, Bradford, Lowry e saggi, è raccomandata.

    b. Microvolumi Proteine ​​A280 Misure - Avvio

    1. Selezionare l'applicazione A280 proteine ​​dal menu principale.
    2. Seleziona il tipo di campione da misurare dal menu a discesa. L'impostazione predefinita è consigliata per la maggior parte delle miscele di proteine ​​sconosciute in cui 1 Abs = 1 mg / mL. Se misura una proteina precedentemente caratterizzata purificata, allora o il coefficiente di estinzione di massa o coefficiente di estinzione molare e peso molecolare possono essere inseriti per determinare la concentrazione di proteine ​​più preciso.
    3. Scegliere l'unità di concentrazione dal menu a discesa.

    c. Microvolumi Proteine ​​Misure A280 - Blanking

    1. Stabilire il bianco con un buffer adeguato. E 'importante utilizzare il buffer in cui viene sospesa la proteina. Il buffer utilizzato deve essere lo stesso pH e di una forza simile ionica come la soluzione del campione. Nota: buffer RIPA contribuire assorbanza troppo a 280 nm e sono quindi incompatibili con le misure dirette proteine ​​A280. Per le proteine ​​sospese in un buffer RIPA, si consiglia di concentrazione proteica essere determinata usando un test tampone compatibile RIPA colorimetriche.
    2. Pipettare 2 ml di soluzione appropriata di chiusura sul piedistallo in basso, abbassare il braccio e fare clic su Vuoto.
    3. Pulire la soluzione del bianco dal piedistalli inferiore e superiore con un laboratorio panno asciutto.

    d. Microvolumi Proteine ​​Misure A280 di misura

    Considerazioni importanti: L'omogeneità del campione è estremamenteimportante, in quanto tale un piccolo volume che viene misurato. Per garantire che i campioni siano omogenei, mescolare delicatamente ma accuratamente i campioni immediatamente prima di assumere una aliquota per la misurazione. Evitare l'introduzione di bolle durante la miscelazione e pipettaggio.

    A causa della variabilità della tensione superficiale tra le diverse proteine, si consiglia di carico 2 ml di campioni per assicurare un'adeguata formazione colonna. Utilizzare sempre bassi puntali di ritenzione. Per caricare un campione, toccare la punta della pipetta sulla superficie inferiore piedistallo ottica mentre espellere la soluzione per evitare che la soluzione di aderire alla parte esterna della punta della pipetta. Espellere inferiore all'importo totale del campione per evitare scoppio e l'introduzione di bolle nel campione.

    1. Immettere un ID campione nel campo appropriato, carico 2 l di primo campione come descritto per la Misura vuoto e fare clic. Una nuova aliquota 2μL del campione dovrebbe essere utilizzato per ogni misura.
    2. Rimuovere il campione dal piedistalli inferiore e superiore con un laboratorio panno asciutto.

    e. Microvolumi Proteine ​​A280 Misure di pulizia

    Un normale e privo di lanugine, pulire laboratorio è spesso sufficiente per pulire i piedistalli ottica tra le misurazioni.

    f. Fare Proteine ​​A280 Misure Ricondizionamento

    Soluzioni e reagenti contenenti tensioattivi può uncondition le superfici di misura piedistallo nel corso del tempo, impedendo la colonna di liquido campione di forma. Un appiattimento della goccia sul piedistallo più basso è indicativo della superficie ottica diventa incondizionato. Se le proprietà di superficie sono stati compromessi, ricondizionamento i piedistalli è importante garantire colonna formazione del campione. In questo caso, lucidare le superfici ottiche con forza usando laboratorio pulire o utilizzare Compound NanoDrop piedistallo Ricondizionamento (PR-1) come indicato.

    III. Microvolumi Concentrazione Determinazione proteine ​​mediante test colorimetrici

    a. Principio di rilevamento colorimetrico

    Lo spettrofotometro NanoDrop 2000c può essere utilizzato anche per misurare soluzioni di proteine ​​non caratterizzato, lisati di cellule, proteine ​​ed estratti grezzi mediante test colorimetrici.

    Metodi colorimetrici sono metodi indiretti che richiedono l'interazione di una tintura con la componente proteica del campione per la produzione di un nuovo complesso che assorbe la luce nella gamma di lunghezze d'onda visibili.

    Lo spettrofotometro NanoDrop 2000c ha diversi test colorimetrici pre-configurati tra cui BCA, Pierce 660, Bradford, Lowry e metodi. Il test BCA sarà dimostrato come un test colorimetrico esempio utilizzando uno spettrofotometro microvolumi. (Screenshot)

    L'(acido Bicinchoninic) BCA test è un metodo comune colorimetrico spesso utilizzato per soluzioni di proteine ​​diluite e proteine ​​in presenza di componenti che sono significativi UV (280 nm) assorbanza. A differenza del metodo A280 proteine, il metodo BCA Protein richiede che una curva standard essere generato prima di concentrazioni di proteine ​​del campione può essere misurata.

    Il metodo utilizza acido bicinchoninic (BCA) come reagenti di rilevamento. Il Cu-BCA chelato formano in presenza di proteine ​​è misurata a 562 nm e normalizzato a 750 nm.

    b. Microvolumi BCA saggio Misure BCA saggio Preparazione

    1. I reagenti necessari sono contenuti nel kit riducente compatibile (Thermo Scientific gatto Pierce non 23250..): Reagente BCA A, B reagente BCA, reagente compatibilità, buffer di ricostituzione, e albumina (BSA) standard.
    2. Equilibrare tutte le proteine ​​sconosciute e gli standard di proteine ​​a temperatura ambiente e mescolare accuratamente.
    3. Preparare abbastanza fresca reagente di lavoro per gli standard ed i campioni da misurare con un rapporto di 50:1 di reagente A: B
    4. Per l'analisi micro, utilizzare un rapporto 1:1 di reagente di lavoro a campione. Aggiungere 10 ml di reagente di lavoro a ciascuna provetta con tubi sufficiente a coprire tutti i campioni e standard. Per l'alta gamma test, utilizzare un rapporto di 20:01 di reagente di lavoro a campione. Aggiungere 190 ml di reagente di lavoro a ciascuna provetta con tubi sufficiente a coprire tutti i campioni e standard. Fare riferimento alla BCA Pierce corredo della documentazione per stabilire quale rapporto è adatto per i vostri campioni.
    5. Aggiungere 10 ml di standard o campione per ciascun tubo contenente reagente. Mescolate bene delicatamente vortex.
    6. Incubare le provette a 37 ° C per 30 minuti.
    7. Lasciare le reazioni a temperatura ambiente (~ 10 minuti).

    c. Microvolumi Misure saggio BCA Generazione Curva Standard

    1. Selezionare il metodo BCA Protein dal menu principale. Se la finestra di verifica lunghezza d'onda appare, assicurarsi che il braccio è basso.
    2. Immettere i valori per ogni concentrazione standard nella tabella riquadro di destra. Il software permette di riferimento e fino a 7 additstandard ionale. Il riferimento e / o norme devono essere misurate in replica.
      Nota: Il requisito minimo per la generazione di curva standard è la misura di due standard o la misura del riferimento zero e almeno uno standard. Si raccomanda che gli standard aggiuntivi essere inclusi come necessario per coprire il previsto intervallo di concentrazione test.
    3. Stabilire un vuoto. Il vuoto per test colorimetrici è generalmente deionizzata H 2 O.
    4. Pipettare 2 ml di dH 2 O sul piedistallo in basso, abbassare il braccio e fare clic su Vuoto. Solo un vuoto necessario per coprire tutte le successive misurazioni di riferimento e standard.
    5. Stabilire il riferimento pipettando un'aliquota di 2 microlitri contenente solo reagente di lavoro e di buffer con nessuna proteina sul piedistallo più basso. Abbassare il braccio e Misura clic.
    6. Nella scheda standard, evidenziare lo standard desiderato e Pipettare 2 ml di standard desiderato sul piedistallo più basso. Abbassare il braccio e Misura clic. Ripetere la procedura per tutte le norme. Assicurati di misurare tutti gli standard prima di campioni di misura. Per visualizzare curva standard fare clic su Visualizza Curva Standard.

    d. Microvolumi Misure Assay BCA 2 Misure proteine ​​microlitri

    1. Dopo tutti gli standard sono stati misurati, fare clic sul pulsante Campioni. Inserire l'ID del campione. Carico 2 l di campione sul piedistallo più basso e fare clic su Misura. Una nuova aliquota 2 l di campione deve essere utilizzato per ogni misurazione.
    2. Pulire il campione dal piedistalli inferiore e superiore con un laboratorio panno asciutto.

    e. Microvolumi Misure di analisi BCA di pulizia e ricondizionamento

    Effettuare la pulizia e ricondizionamento, come descritto nella diretto A280 misurazioni dell'assorbanza.

    Rappresentante dei risultati:

    Determinazione delle proteine ​​microvolumi concentrazione è effettuata sia da un diretto A280 misura o un saggio colorimetrico indiretto. L'A280 esempio di misura determina la concentrazione di proteine ​​in base al coefficiente di estinzione della proteina di interesse. Il test colorimetrico BCA esempio determina la concentrazione di proteine ​​a base di una curva standard di concentrazioni di proteina nota.

    Discussion

    Quantificazione microvolumi utilizza le proprietà intrinseche tensione superficiale di un campione a formare una colonna di liquido tra due superfici di misura. L'assenza di un dispositivo di contenimento, la lunghezza del percorso permette di modificare in tempo reale, essenzialmente eliminando la necessità di eseguire diluizioni. Questa capacità aumenta notevolmente la gamma dinamica delle concentrazioni di proteine, nonché la velocità di misura. Utilizzando quantità minime di campione, un gran numero di campioni possono essere analizzati rapidamente e con precisione, permettendo agli scienziati di prendere più misure e ottenere il controllo di qualità migliore. Inoltre, e, se necessario, i campioni preziosi possono essere recuperati dopo l'assunzione di una misura. Quando questi piccoli volumi vengono misurati, l'omogeneità del campione è estremamente importante per evitare gli errori di campionamento. Bassa puntali di conservazione deve essere sempre usato per i campioni di carico e le punte dovrebbe essere cambiato tra il campione replica. Le superfici piedistallo devono essere puliti e condizionati a garantire i risultati più accurati. Infine, lo spettrofotometro microvolumi è ideale quando campione è limitato, tuttavia, la facilità d'uso, velocità e ampia gamma dinamica dello spettrometro lo rendono adatto campione quando è abbondante.

    Disclosures

    Gli autori sono dipendenti di Thermo Fisher Scientific che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    NanoDrop 2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific, Inc.
    Laboratory wipes
    Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific, Inc. 23250 Reducing agent compatible
    PR-1 Reconditioning Kit Thermo Fisher Scientific, Inc.

    References

    1. Aitken, A. and Learmonth, M. Protein determination by UV absorption. In Protein Protocols Handbook (J.M. Walker, ed). Springer, Secaucus, N.J. (1996).
    2. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254 (1976).
    3. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A., and Randall, R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275 (1951).
    4. Reisner, A.H., Nemes, P., and Bucholtz, C. Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels. Anal. Biochem. 64: 509-516 (1975).
    5. Simonian, M.H. and Smith, J.A. Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration. Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17 ( 2006).
    6. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., and Klenk, D.C. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150: 76-85 (1985).
    7. Stoscheck, C.M. Quantitation of protein. Meth. Enzymol. 182: 50-68 (1990).

    Comments

    12 Comments

    Hi,
    Could you please tell me how to measure enzyme kinetics in this nanodrop ²000c spec. ?
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 26, 2009, 2:38 PM

    Hi Hemalatha,
    The NanoDrop ²000c software has a kinetics module that allows users to make time-based kinetic measurements with a cuvette. In this module it will output absorbance vs. time data that is easily exported into microsoft excel. For specific questions about enzyme kinetics please contact info@nanodrop.com. Thank you for your interest.
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 28, 2009, 12:58 PM

    Hi,
    Could you please send/publish the graph chart obtained/ or that represents the RNA/DNA/ Protein measured from a sample?
    It would be very helpful for our protein purity.
    And how can we assess that our protein's purity from nanodrop? Is there any graph for those pure protein samples?
    Waiting for your response.
    Reply

    Posted by: Tirth G.November 19, 2010, 12:01 PM

    The user's manuals for each NanoDrop instrument show representative spectra for the chromophores mentioned in the inquiry. These manuals may be accessed via the following links:

    NanoDrop ²000c: www.nanodrop.com/Library/NanoDrop ²000 User Manual.pdf
    NanoDrop 8000: www.nanodrop.com/Library/nd-8000-v².² -users-manual-8.5 x 11.pdf
    NanoDrop 3300: www.nanodrop.com/Library/nd-3300 ².7-users-manual-8.5x11.pdf

    Thank you
    Reply

    Posted by: Philippe D.November 23, 2010, 10:56 AM

    Could you provide details regarding the limit of detection for each protocol, please?
    The time is impoved and it is possible to detect higher amounts of proteins without dilution. However is the nanodrops system suitable for detecting very low amounts of total proteins? One cannot exclude the possibility that this system is more sensitive than classcial ones...
    Reply

    Posted by: AnonymousMay 12, 2011, 10:27 PM

    Paul,
    The limit of detection for the A²80 protein measurement will ultimately depend on the E1% value of your specific protein. In addition, it will also depend on if you use the microvolume pedestal or a 10 mm cuvette. For example, the lower detection limit for BSA will be 0.1 mg/mL for the pedestal and approximately 0.0² mg/mL when using a 10 mm quartz cuvette.Please note that the Nanodrop ²000c is the model which has the feature for using conventional cuvettes in addition to the microvolume pedestal.

    The BCA colorimetric assay uses either a ²0:1 reagent to sample ratio or a 1:1 reagent to sample ratio which have detection limits of ²00 ug/mL and 10 ug/mL respectively. If you have any further questions please go to http://www.nanodrop.com for more information or contact us at info@nanodrop.com and we will be glad to assist you.
    Reply

    Posted by: Liz G.June 16, 2011, 11:42 AM

    Can the nanodrop also be used for determination of a proteins molar extinction cŒfficient, if a protein solution with known concentration is provided? The protein amino acid sequence and Mw is known, and the protein amount/concentration is known from amino acid analysis. Is this application described in the manual or in an application not?
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 27, 2011, 8:25 AM

    Indeed a wonderful post. I have been studying the chromatography, spectroscopy etc. and do look over the web for latest and informative stuff and just landed on your blog. Thanks for writing such good posts and as I have subscribed to your blog, I do expect that you will be posting nice stuff like this on a regular basis.
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 6, 2011, 3:34 AM

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    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 15, 2011, 8:13 AM

    Hi,
    can the nanodrop also be used for determination of a protein concentration at wavelengths: A²15, A²²5, A3²0 nm or another UV- and visible wavelengths?
    Waiting for your response.
    Reply

    Posted by: AnonymousMarch 27, 2012, 8:37 AM

    The NanoDrop ²000/²000c has the capability to measure absorbance at any wavelength between 190 ²11; 840 nm.

    Using a NanoDrop ²000/²000c you could use the UV-Vis module to select the specific wavelength you would like to measure, but we have found that defining a custom method would be a much better way to proceed, especially for samples that may have a large salt concentration at a wavelength other than the wavelengths of interest.

    A technical note that describes using custom methods for protein quantification can be found here: http://www.nanodrop.com/Library/A²05%²0Proteins%²0&%²0Peptides%²0Custom%²0Method.pdf
    Please contact our technical support with any questions at ²11; info@nanodrop.com
    Reply

    Posted by: Russell D.May 21, 2012, 11:12 AM

    How dŒs this instrument account for stray light?
    Reply

    Posted by: Kenneth W.September 25, 2012, 11:06 AM

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