JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You have trial access to videos in this collection until May 31, 2014.

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Neuroscience

דגם מרחק איסכמיה מוחית על ידי ספיגה תפר Endovascular של עורק המוח התיכון עכברוש

1, 1, 1, 1, 1

1Department of Neurological Surgery, School of Medicine and Public Health, University of Wisconsin-Madison

Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    אינדוקציה כירורגי של נזק מוחי איסכמי בחולדה הוא מודל בשימוש נרחב עבור מחקר שבץ. כאן אנו מדגימים את האינדוקציה של איסכמיה מוחית המוקד על ידי חסימה של עורק המוח האמצעי. ויזואליזציה של האוטם שהתקבל על ידי צביעה היסטולוגית ו דימות בתהודה מגנטית מוצג גם.

    Date Published: 2/05/2011, Issue 48; doi: 10.3791/1978

    Cite this Article

    Uluç, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Aktüre, E., Başkaya, M. K. Focal Cerebral Ischemia Model by Endovascular Suture Occlusion of the Middle Cerebral Artery in the Rat. J. Vis. Exp. (48), e1978, doi:10.3791/1978 (2011).

    Abstract

    שבץ הוא הגורם המוביל של נכות הגורם השלישי למוות בקרב מבוגרים ברחבי העולם 1. ב שבץ אדם, קיים מצב קליני משתנה מאוד; בפיתוח של מודלים בבעלי חיים של איסכמיה מוקדי, לעומת זאת, השגת שחזור של נפח האוטם המושרה בניסוי היא חיונית. החולדה היא מודל החיה בשימוש נרחב עבור שבץ בשל עלויות נמוכות יחסית בעלי חיים ועל הדמיון של זרימת הגולגולת שלו לזו של בני האדם 2,3. בבני אדם, עורק המוח האמצעי (MCA) מושפע לרוב תסמונות שבץ שיטות מרובות של MCA חסימה (MCAO) תוארו לחקות זו תסמונת קליניים במודלים של בעלי חיים. מכיוון recanalization נפוצה בעקבות שבץ חריף reperfusion, אדם לאחר תקופה של חסימה נכללה רבים של המודלים האלה. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את המודל חולף endovascular MCAO תפר בחולדה יתר לחץ דם באופן ספונטני (SHR). נימה עם ציפוי קצה סיליקון ממוקם intraluminally על המקור MCA במשך 60 דקות, ואחריו reperfusion. ראוי לציין, כי תקופת חסימה אופטימלית עשויים להשתנות זני עכברים אחרים, כגון Wistar או Sprague-Dawley. מדדים התנהגותיים כמה שבץ החולדה מוצגות. איסכמיה מרחק הוא אישר באמצעות T2 משוקלל תמונות תהודה מגנטית ועל ידי צביעת חלקים במוח עם כלוריד 2,3,5-triphenyltetrazolium (TTC) 24 שעות לאחר MCAO.

    Protocol

    MCAO דגם עכברוש

    Presurgical ההכנות

    טכניקה אספטי אמור לשמש את כל הליכי הישרדות כירורגית. לחטא את משטח העבודה כירורגית עם חומר חיטוי מסחרי ולהכין חבילות כירורגיות סטריליות של מכשירים, וילונות, גזה, מטליות, התפרים, ולהבי אזמל ידי מעוקר. מסכה כירורגית, מצנפת שיער כפפות סטריליות צריך להיות משוחק. יבש Germinator חרוז מעקר משמש גם כדי לחטא מחדש מכשירי ניתוח בין אם הליכי ניתוחים עכברוש מרובים ייעשה במהלך אחד. שמיכה Prewarm מים במקטורן homeothermic מקום תחת משטח סופג כדי למנוע היפותרמיה של עכברוש במהלך הניתוח.

    1. המקום ספונטני עכברוש יתר לחץ דם (או זן עכברים אחרים של בחירה) לתוך תא אינדוקציה לגרום הרדמה עם 5% isoflurane (מכונת הרדמה צריך להיות מוגדר O 1.0 L / 2 דקות ו - 1.0 ליטר / דקה N 2 O). התחתון כדי% 1-2 isoflurane לשמור על הרדמה.
    2. החל מלאכותית משחה דמעות בשתי העיניים.
    3. לגלח את הגרון באזור צוואר שמאל מעבר לאזור החתך פוטנציאליים באמצעות קוצץ (אוסטר A5 עם להב 10 #).
    4. החל בבטאדין לרפד גזה ולחטא את העור החל במרכז אזור הניתוח, מתפתלת החוצה. לשטוף עם תחבושת סטרילית המכילה 70% אתנול, העברת פנקס דפוס דומה. חזור על שני השלבים עבור סכום כולל של שלושה מחזורים.
    5. להזריק 0.2 מ"ל של bupivacaine 0.5% מתחת לעור לאורך באתר חתך פוטנציאליים.
    6. המקום עכברוש Stockinette כיסוי סטרילי או עם וילון כירורגי סטרילי.

    חסימה חלוף של MCA

    1. תחת מיקרוסקופ ההפעלה, חתך קו האמצע הגחון מבוצע ואת fascia השטחית הוא גזור.
    2. מתחת fascia השטחי, יש רקמה בלוטית לשרירים שמאל ושלושה היוצרים משולש: sternohyoid, הנמצאת על קו האמצע קנה הנשימה; digastric (המזוהה בקלות עם חלק tendinous מבריק לבן שלה); ולבסוף, השריר sternomastoid.
    3. דיסקציה חריפה ובוטה זהירות מתבצע בתוך המשולש כדי לזהות את העורק הראשי (דיסקציה קהה בלעדי עשוי להיות מועדף על ידי חלק למזער נזק לרקמות מקרי). עורקי התרדמה חיצוני, פנימי משותף (ECA, ICA, המרכז לאמנות עכשווית) נחשפים. העורק הראשי הוא גדול לעין פולסים. העצב התועה נראה זורם לאורך הפן לרוחב של שני עורקי הראש המשותף פנימיים הוא ניתח בחריפות את עורקי הראש נפוצים פנימי.
    4. שני סניפים ECA הם גזור אז בחריפות, את הסניף הראשון הכותרת מדיאלית ואת הסניף השני הכותרת רוחבית. ענפים שניהם צרוב וחותכים, אשר מאפשר בקלות רבה יותר בגיוס כלי גדול יותר.
    5. ECA הוא גזור עכשיו יותר rostrally. עצם הלשון ניתן נתקל והדבר יגביל את מידת לנתיחה מקורי. בעורק התרדמה החיצוני נקשר כמו distally האפשרי עם תפר 6-0 משי.
    6. תפר עוד 6-0 משי מונחת ברישול סביב ECA ליד הסתעפות עם הרשפ"ת. הקפד לא כדי לחסום את כלי כמו תפר intraluminal לשמש חסימה יהיה עובר כאן בשלב מאוחר יותר.
    7. קליפים Microsurgical ממוקמות על עורקי הראש נפוצים פנימי ליד הסתעפות.
    8. Arteriotomy חלקית הראשונית נוצרת בין שני לתפור עניבות משי על עורק הצוואר חיצוני.
    9. להכניס 2.2 -3.0 ס"מ אורך של תפר monofilament ניילון 4-0, עם 2.0 ס"מ שריטה מ מעוגל קצהו סיליקון מצופה, לתוך לומן ECA מטה לכיוון המרכז לאמנות עכשווית שבה קליפ microsurgical ממוקם. תפרים אלה זמינים מסחרית (Doccol קורפ, Redlands, קליפורניה, ארה"ב). חותכים את החלק הנותר של ECA (באתר של arteriotomy החלקי) לשחרר את הגדם ולמקם את הגדם מתחת הסתעפות של ECA ויק"א, זה יהיה בקלות רבה יותר לאפשר תפר intraluminal להחליק לתוך ICA.
    10. הדק את תפר משי סביב הגדם ECA כדי לאבטח את תפר ניילון intraluminal ולמנוע דימום, ולאחר מכן להסיר את הסרטון כלי הדם של ICA. פתח את הסיכה לפני הסרת לאט זה כדי לבדוק אם הדימום.
    11. המשך קידום תפר ניילון מ ECA כדי ICA לומן על עורק המוח האמצעי (MCA). אורך זה הוא בדרך כלל 18-20 מ"מ הסיבה הצבת שריטה תפר לפני הכניסה. לאחר באורך משתנה של תפר ניילון מוכנס, התנגדות יורגשו. אם זה קורה עם הרבה תפר ניילון הנוכחי עדיין מחוץ הספינה, מעידה על כך תפר צפוי להיכנס עורק pterygopalatine (ראה הערה להלן). משוך לאחור עקומת תפר מעט להמשיך לאורך הרשפ"ת, אשר ירוצו יותר מדיאלית. בנוסף, דיסקציה המוצא של PPA ניתן לעשות כדי להמחיש טוב יותר את הנתיבשל החוט intraluminal. המשך להכניס את תפר ניילון עד ההתנגדות היא הרגישה ואחרי עמדה 2 ס"מ מפותל. בשלב זה, תפר intraluminal חסם את מקורם של MCA. MCA חסימה יכולה להיות מאושרת על ידי ניטור הפחתה בזרימת הדם במוח האזורית באמצעות flowmeter לייזר דופלר (ראה טבלה חומרים ממקור אחד ציוד). כמו כן לציין כי מקורו של העורק pterygopalatine הנחה של הרשפ"ת יכול להיות קשור ישירות לדרך, אם העדיף, על מנת למנוע מקרי אינטובציה של כלי זה עם תפר intraluminal.
    12. הפעל את שעון העצר חסימה שיא הזמן להתחיל.
    13. הסר את microclip מן המרכז לאמנות עכשווית.
    14. סגירת החתך (הדרמיס, מרפד carnosus, שכבות רקמה תת עורית) במהירות עם תפר 3-0 משי (דפוס מתמשך פשוט יקל על פתיחתו מחדש של reperfusion) ובזהירות המקום חולדה בכלוב התאוששות. בדוק את רצפת כלוב סביב האף והפה חופשיים החומר מצעים התאוששות לפקח מן ההרדמה.

    שחזור זרימת הדם MCA (reperfusion)

    1. זמן קצר לפני תקופת חסימה צריכה להסתיים, להרדים מחדש את העכברוש, לחטא את האתר חתך בבטאדין אתנול ו 70% (3 מחזורים, כמו קודם) ולפתוח מחדש את החתך על ידי הסרת התפרים הסגירה.
    2. מניחים microclip על המרכז לאמנות עכשווית, כמו קודם.
    3. למשוך את תפר occluding חלקית של ICA עד סוף תפר גלוי דרך ICA. לא לגמרי להסיר את תפר של ICA / ECA!
    4. מניחים microclip על ICA מעל בסוף תפר intraluminal.
    5. להסיר לחלוטין את תפר occluding בחוזקה לקשור את הגדם ECA. שיא סוף חסימה (להתחיל reperfusion) זמן.
    6. הסר את microclip של ICA.
    7. הסר את microclip מן המרכז לאמנות עכשווית.
    8. לחלח את האזור עם מספר טיפות של תמיסת מלח סטרילית לסגור את החתך שכבות (הדרמיס, מרפד carnosus, רקמה תת עורית) עם תפר 3-0 באמצעות דפוס משי קטע פשוט.
    9. ניהול 0.05 מ"ג / ק"ג עצירות (או משכך כאבים אחר המתאים שלאחר הניתוח שלהלן הנחיות מוסדיים שלך) לחלל הצפק.
    10. הזרק 5cc של intraperitoneally מלוחים prewarmed. זה יספק לחות בשלב ההתאוששות.
    11. צג התאוששות של חולדה מן ההרדמה.
    12. אחרי החולדה התאוששה, מבחן אינדיקציה התנהגותית של אוטם ידי החזקת את העכברוש בזנבו והתבוננות אם עכברוש יכול לפנות לשני הצדדים. קרלינג לצד אחד בלבד צפוי. קשקשים הניקוד פשוט יכול לשמש כדי להקליט תפקוד הראשונית שלאחר האוטם behavorial (ראה דיון).
    13. זריקות נוספות של עצירות (מינון כמו לעיל) יש לתת כל 6 עד 8 שעות במשך 24 שעות של הקלה בכאב. הרחבת כאבים אם החיה מראה סימנים של אי נוחות.

    נציג תוצאות

    איור 1
    באיור 1. חסימה של עורק המוח האמצעי על ידי תפר endovascular. דיאגרמה פשוטה של מערכת הדם גולגולת של עכברוש מוצג עם תפר סיליקון מצופה intraluminal occluding מקורם של MCA. OA וענפים ST מעל ECA שמאל כבר ligated ועניבה תפר סביב הגדם ECA מחזיקה תפר intraluminal במקום. ACA, עורק המוח הקדמי: BA, basilar העורק; המרכז לאמנות עכשווית, העורק הראשי משותפת; ECA, חיצוני עורק התרדמה, ICA, עורק התרדמה הפנימי, MCA, עורק המוח האמצעי, OA, עורק העורפית, PCA, עורק המוח האחורי; PComA, האחורי תקשורת העורק; PPA, עורק pterygopalatine: ST, עורק התריס מעולה. איור עיבוד סאסאקי et al. 4 ולי 3.

    איור 2
    איור 2. נציג תהודה מגנטית סעיפים העטרה של המוח עכברוש 24 שעות לאחר חלוף MCAO 1 שעה. בצקת מוחית המלווה איסכמיה היא מוקד דמיינו T2 משוקלל תמונות MRI. אזור האוטם מופיע hyperintense (בהיר) על תמונות T2. דפוסי האוטם דומים ניתן לראות יותר עם ​​טכניקות מתקדמות כגון MRI-הדמיה דיפוזיה משוקלל מקדם דיפוזיה לכאורה מיפוי 5.

    איור 3
    איור 3. סעיפים העטרה נציג של המוח עכברוש מוכתם TTC 24 שעות לאחר חלוף MCAO 1 שעה. מכתים TTC מגלה לבן (בלא כתם) infarcted אזורים בקליפת המוח בסטריאטום ב עכברוש זהה לזה שמוצג באיור 2. שים לב כי הדפוס הכללי של נגעים איסכמיים מוקד דומה לזה לראות את T2 משוקלל בתמונות MRI, אם כי באזור האוטם הסופי נקבע בהיסטולוגיה עשוי להיות מעט קטן יותר מאשר הפגיעה T2.

    Discussion

    מודלים מכרסם של איסכמיה מוחית יכולה להיות מסווגת העולמי או מוקדי הפיך כמו או בלתי הפיך. אנו משתמשים במודל הפיך איסכמיה מוקד על מנת לחקות את הפגיעה reperfusion שעלול להתרחש recanalization הבאים לחולי שבץ אדם. בעוד חולדה מניות היתרון של מחזור הגולגולת דומה האדם, את זרימת נרחב בטחונות תוך גולגולתי עקב מעגל של וויליס leptomeningeal anastomoses תוצאות בכמויות האוטם עקבי 6. אנו משתמשים עכברוש יתר לחץ דם באופן ספונטני (SHR) זן בגלל גודל האוטם הוא יותר SHRs חשופים איסכמיה מוחית מוקד לעומת חולדות normotensive 7-10. אינדוקציה שבץ SHRs גם עקבית יותר ועלול ליצור תמותה נמוך יותר מאשר זנים נפוצים אחרים 11. בנוסף, פרמטרים פיזיולוגיים יש לעקוב לאורך כל הניתוח, מפני תנודות יכול להוסיף ההשתנות בכמויות האוטם; פרמטרים אלו כוללים לחץ דם עורקי O 2 ו-CO 2 רמות, היפותרמיה, ועל היפרגליקמיה, אשר יכול להחמיר פגיעה איסכמית 2,12 . היפותרמיה הוא מדאיג במיוחד משום שהוא יכול להפחית את מידת פגיעה עצבית איסכמית, ולכן הצבת חולדה על כרית חימום thermoregulatory במהלך הניתוח היא חיונית.

    אנו מעסיקים מוכן מסחרית סיליקון מצופה התפרים בהליך זה בניסיון להגדיל עקביות בגודל האוטם 13-15. באופן מסורתי, התפרים intraluminal להשתמש כדי לחסום את MCA הוכנו על ידי להבה עיגול טיפ 3-0 ניילון תפר או באמצעות אקדח דבק חם את קצה המעיל תפר עם דבק קטן חרוז 16. נהלים אלה לייצר התפרים בקטרים ​​קצה שונות, ובכך, עשויה לדרוש מספר ניסיונות על חסימה לפני מציאת תפר התואמת את קוטר כלי שיט של עכברוש נתון. וריאציות נוספות על השיטה MCAO המתואר וידאו זה כוללים חסימה דיסטלי יותר, חוסך את הענפים lenticulostriate כדי להיות אוטם קורטיקלי טהור 17, חסימה זמנית של השפעת MCA ו ipsilateral העורק הראשי משותף להפחית את זרימת הדם בטחונות 6,9.

    ההשפעות תפקודית של שבץ ניתן להעריך באמצעות מגוון של בדיקות התנהגותיות, שבו חסרים משימות ספציפיות באים לידי ביטוי בהיקף מניה פשוטה. לדוגמה, פיתחה Bederson et al. לדירוג 18 חולדות נוירולוגיות ציון על מידת כיפוף forelimb במצב גוף גבוה, עמידות אסימטרית לדחוף לרוחב, והתנהגות שדה פתוח מקיף. חולדות הן הארכת forelimbs על הרצפה כאשר מוגבה לא מציג גירעונות אחרים דורגו "Normal (0)", ואילו בחולדות עם כיפוף forelimb הנגדי רק סווגו עם "הגירעונות מתונה (1)". "חמור 2 כיתה" חולדות מוצגת התנגדות ירד בצד הנגדי לכוח לרוחב ו - "חמור בדרגה 3" חולדות עוסקת בנוסף מסתובבים התנהגויות. גירעונות התנהגותיים ציון נמוך נצפו תמיד בכיתה גבוהה הבא (למשל, כיתה 2 ו -3 בעלי חיים מוצג גם כיפוף forelimb) ועשרות אלה היו חזוי של ההבדלים בגודל האוטם 18. לכן, כגון מערכת ניקוד פשוטה מאפשר הערכה מהירה, וכמותיות עקבית של הגירעונות פונקציונלי משבץ.

    מדידה של היקף אוטם מוחי נעשה בדרך כלל על ידי צביעה היסטולוגית עבור נזק לרקמות באמצעות TTC, סגול cresyl (Nissl כתם) או hematoxylin ו eosin. תהודה מגנטית טכניקות, כולל דיפוזיה משוקלל MRI כדי להמחיש את האוטם בנקודות זמן מוקדם אחרי חסימה, לאפשר לקביעת נפח האוטם ב עכברוש בנפרד ללא צורך קצירת רקמות. זה חשוב במיוחד במחקרים שמטרתם לקבוע את יעילות הטיפול neuroprotective בעקבות שבץ; הדמיה את העכברוש לאחר MCAO אבל הממשל טיפול לפני נותן אמון החוקר כי כל חיות הניסוי ובקרה מנוסה משיכות דומה להתחיל, הפחתת תופעות בלבול של השתנות ב אינדוקציה שבץ.

    Disclosures

    המחברים אין אינטרסים מנוגדים לחשוף.
    פרוטוקול זה אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת השתמש בבית הספר באוניברסיטת ויסקונסין במדיסון לרפואה לבריאות הציבור פועלת לפי המכון הלאומי לבריאות הנחיות לשימוש בחיות מעבדה.

    Acknowledgements

    אנו מודים בית ראוך של אוניברסיטת ויסקונסין חיה קטנה הדמיה מתקן עבור דימות בתהודה מגנטית. המחלקה לכירורגיה נוירולוגיות באוניברסיטת ויסקונסין במדיסון סיפק מימון עבור עבודה זו.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    4-0 Nylon suture Doccol Corporation 2-3 mm silicon coating length, 0.39 mm tip diameter
    Spontaneously hypertensive rats Charles River Laboratories 290-300 g, male
    Gaymar T/Pump thermoregulatory pump and pads Gaymar Industries
    Vetroson V-10 bipolar electrosurgical unit Summit Hill Laboratories
    Germinator 500 glass bead sterilizer CellPoint Scientific
    Vasamedics Bpm2Laserflo blood perfusion monitor TSI Inc.

    References

    1. van Gijn, J. & Dennis, M. S. Issues and answers in stroke care. Lancet 352 Suppl 3, SIII23-27 (1998).
    2. Macrae, I. M. New models of focal cerebral ischaemia. British Journal of Clinical Pharmacology 34, 302 (1992).
    3. Lee, R. M. Morphology of cerebral arteries. Pharmacol Ther 66, 149-173 (1995).
    4. Sasaki, M., Honmou, O. & Kocsis, J. D. A rat middle cerebral artery occlusion model and intravenous cellular delivery. Methods Mol Biol 549, 187-195, doi:10.1007/978-1-60327-931-4_13 (2009).
    5. Bråtane, B. T., Bastan, B., Fisher, M., Bouley, J. & Henninger, N. Ischemic lesion volume determination on diffusion weighted images vs. apparent diffusion coefficient maps. Brain Res 1279, 182-188, doi:10.1016/j.brainres.2009.05.002 (2009).
    6. Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H. & Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke 17, 738-743 (1986).
    7. Dogan, A., Başkaya, M. K., Rao, V. L., Rao, A. M. & Dempsey, R. J. Intraluminal suture occlusion of the middle cerebral artery in Spontaneously Hypertensive rats. Neurol Res 20, 265-270 (1998).
    8. Ogata, J., Fujishima, M., Morotomi, Y. & Omae, T. Cerebral infarction following bilateral carotid artery ligation in normotensive and spontaneously hypertensive rats: a pathological study. Stroke 7, 54-60 (1976).
    9. Brint, S., Jacewicz, M., Kiessling, M., Tanabe, J. & Pulsinelli, W. Focal brain ischemia in the rat: methods for reproducible neocortical infarction using tandem occlusion of the distal middle cerebral and ipsilateral common carotid arteries. J Cereb Blood Flow Metab 8, 474-485 (1988).
    10. Duverger, D. & MacKenzie, E. T. The quantification of cerebral infarction following focal ischemia in the rat: influence of strain, arterial pressure, blood glucose concentration, and age. J Cereb Blood Flow Metab 8, 449-461 (1988).
    11. Coyle, P. Different susceptibilities to cerebral infarction in spontaneously hypertensive (SHR) and normotensive Sprague-Dawley rats. Stroke 17, 520-525 (1986).
    12. Slivka, A. P. Hypertension and hyperglycemia in experimental stroke. Brain Res 562, 66-70 (1991).
    13. Bouley, J., Fisher, M. & Henninger, N. Comparison between coated vs. uncoated suture middle cerebral artery occlusion in the rat as assessed by perfusion/diffusion weighted imaging. Neurosci Lett 412, 185-190, doi:10.1016/j.neulet.2006.11.003 (2007).
    14. Schmid-Elsaesser, R., Zausinger, S., Hungerhuber, E., Baethmann, A. & Reulen, H. J. A critical reevaluation of the intraluminal thread model of focal cerebral ischemia: evidence of inadvertent premature reperfusion and subarachnoid hemorrhage in rats by laser-Doppler flowmetry. Stroke 29, 2162-2170 (1998).
    15. Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H. & Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods 156, 161-165, doi:10.1016/j.jneumeth.2006.02.017 (2006).
    16. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S. & Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke 20, 84-91 (1989).
    17. Shigeno, T., McCulloch, J., Graham, D. I., Mendelow, A. D. & Teasdale, G. M. Pure cortical ischemia versus striatal ischemia. Circulatory, metabolic, and neuropathologic consequences. Surgical neurology 24, 47-51 (1985).
    18. Bederson, J. B. et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke 17, 472-476 (1986).

    Comments

    35 Comments

    how do make a ²-3 mm silicon coating length, 0.39 mm tip diameter and how do put it on in the surure
    Reply

    Posted by: AnonymousMay 10, 2011, 6:24 PM

    We custom order 4-0 nylon sutures with 0.39 mm tip diameter and ²-3mm silicon coating length from Doccol Corporation ( http://www.doccol.com). Use their "My Special Design" option to customize coating length and tip diameter from their choices. You may need to try several sizes for your strain and size of rat. These values are what work best for us with SHRs in the ²80-300g range.
    Reply

    Posted by: AnonymousMay 10, 2011, 6:48 PM

    Could you please provide the information on the cauterizer used during the procedure
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 22, 2011, 2:30 PM

    Here is the link to the manufacturer's site:

    http://www.summithilllaboratories.com/products_electro.htm
    Reply

    Posted by: AnonymousJune 22, 2011, 4:57 PM

    which software do you use and how to determine the volume of the infarction?
    kind regards
    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 19, 2011, 6:14 PM

    We use the admittedly tedious method of drawing regions of interest in ImageJ software to measure infarct areas. We use the indirect measurement of infarct volume instead of directly measuring the infarct lesion to avoid the complications that arise from edema-induced changes in brain volume following stroke.

    The indirect formula is: ([contralateral hemisphere healthy area] minus [ipsilateral hemisphere healthy area]) times [slice thickness]; sum this across all of the sections to get infarct volume for the whole brain. We use this same approach whether it is on MRI or tissues stained with TTC or cresyl violet.
    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 19, 2011, 6:32 PM

    very good for understanding.
    but how i save your video plz reply
    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 22, 2011, 10:32 PM

    I notice in your video (which is excellent by the way) that you are using a very basic anaesthetic rig with just the vapouriser for isoflurane. Is this what you use to perform all of your MCA occlusions? If so, can you please provide a list of equipment I need to set up the exact same rig as yours?
    Thank you very much for your time and help.
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 16, 2011, 8:50 PM

    We use a setup with an isoflurane funnel-fill vaporizer (e.g., 911103), dual gas flowmeter, 45 inch bain non-rebreathing circuit (9²1410), and rodent nosecone (9²1431). We use a ² liter induction chamber (941444). Waste gases are vented into a fume hood for exhaust. If you do not have an exhaust hood available, then you will want a waste gas scavenging system, such as activated charcoal canisters. Several companies make appropriate equipment, (including SurgiVet and VetEquip, for example) and you can get a complete system mounted onto a tabletop bracket for a research setting. I have included VetEquip part numbers in parentheses for several items [I had to order replacements recently so I had them handy ;-) ] I would contact one of the companies and they can recommend a specific system if you are starting from scratch.
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 17, 2011, 3:59 PM

    Hi Gregory, thank you very much for providing that information!
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 17, 2011, 7:49 PM

    Gregory, is there an email I can contact you on? I have spoken to the Vetquip here in Australia and they have no idea what each of the individual components you have listed are!! Apparently the nomenclature is slightly different from country to country. Apologies in advance for the hassle.
    Reply

    Posted by: AnonymousOctober 17, 2011, 9:25 PM

    Hi Gregory,

    I have tried emailing you at the address you provided in the above post but it bounced? I have more questions re MCA occlusions. Could you possibly email me at michelle.chen@southernhealth.org.au?

    Thanking you kindly
    Reply

    Posted by: AnonymousMarch 14, 2012, 7:18 AM

    thanks for your excellent experiment.. but could you tell me kindly how can i get this video??
    Reply

    Posted by: AnonymousDecember 17, 2011, 11:34 AM

    This artical is really great .
    Reply

    Posted by: shen m.July 30, 2012, 8:30 PM

    thanke you for the video. Can you give me a reference please, where I can buy a microvascular clips, that you use. Thanke you!
    Reply

    Posted by: margarita B.October 3, 2012, 8:42 AM

    We use Mizuho Sugita AVM microclips (07-93² series; straight blades come in different lengths; we use 3mm or 4 mm) and clipholder. See the link for contact info to get a sales rep:

    http://www.mizuho.com/contact
    Reply

    Posted by: Gregory K.October 3, 2012, 7:24 PM

    Thank you for your share.My first question is that what is the aim for coagulation of ST artery and Occipital artery?Because the limitation ,we use 4 suture to ligation ST artery and Occipital artery,but bleeding is contineous ,not as your description in video,do you have some idea about the reason?
    Thanks for you help!
    Reply

    Posted by: janne l.November 27, 2012, 10:57 AM

    Good afternoon. I am not the author of the video, but I work with the same model. Perhaps The reason is that the blood pressure in these arteries is high and diamert of vessel is very small and your ligatures just come off? I gust can suggest using bipolar coagulation- it is very fast and easy-takes ²-5 seconds to one artery and prevents any bleeding.In Russia this device сost $ 1,000.
    Reply

    Posted by: margarita B.February 14, 2013, 8:41 AM

    Yes, we too use the bipolar. It is easy and effective and we don't experience any issues with bleeding of the ST and OA.
    Reply

    Posted by: Gregory K.February 14, 2013, 4:32 PM

    Good afternoon, colleagues.
    I've been working on this model and I am having the following problems: using rats weighing ²50-300 g and filaments Filament size 4-0, diameter 0.19 mm, length 30 mm; diameter with coating 0.39 + / - 0.0² mm; coating length 3 - 4 mm DOCCOL in rats is not formed area of stroke or it is extremely low. Tell me, what is it can be connected?
    Thanks for the reply.
    Margaret
    Reply

    Posted by: margarita B.February 14, 2013, 8:33 AM

    There is some variability inherent in the model. As such, you may find it necessary to perform a series of pilot experiments using sutures of different sizes. Doccol allows you to customize the silicon tip diameter and coating length. We use shorter coating length because it is easier to manipulate the suture during entry into the ECA and rerouting into the ICA. Longer coating would presumably give you a bigger margin of error in suture placement at the MCA origin while still occluding the vessel.
    Note that several other factors may come into play as well. Stroke size and reproducibility can vary with rat strain. While many people have had success with Sprague Dawley rats, the experience in our department has been that spontaneously hypertensive rats more consistently show stroke lesions. Even with SHRs, however, there can be some variability. Keeping the animals warm during surgery and recovery is also important. Hypothermia is neuroprotective. Room drafts can chill an animal post-ischemia enough to noticeably reduce infarct size (as a colleague of ours recently can testify).
    Good luck!
    Reply

    Posted by: Gregory K.February 14, 2013, 4:29 PM

    thank you very much for your reply.
    How the length of the silicone coating influences the variability of stroke?
    What length and diamert coverage you would be advised to rats weighing ²80-350 grams? line WISTAR
    Thank you!
    Reply

    Posted by: margarita B.February 26, 2013, 6:14 AM

    That is something that you will have to test yourself. We don't use Wistar rats (although SHRs are derived from Wistar Kyoto rats). We tried a few different silicon diameters and lengths in pilot experiments but didn't do enough numbers to be able to make definitive comparisons. Once we found that we were getting infarcts, we stuck with .39mm diameter, ²-3 mm length for our ²80-300 g SHRs. Our surgeons preferred the shorter coating length for a bit easier bending when advancing the suture from the ECA into the ICA but a longer coating (e.g. 4-5mm) may give a larger "margin of error" in terms of suture placement blocking the MCA.
    Reply

    Posted by: Gregory K.February 28, 2013, 5:46 PM

    Good afternoon. tell me please, what formula and application you use to calculate the volume of stroke using brain slices?
    Thank you!
    Reply

    Posted by: margarita B.April 4, 2013, 5:02 PM

    We use indirect lesion area measurement, summed across all sections analyzed to get an infarct volume. By indirect, I mean that we measure the healthy non-lesioned area and infer the lesioned area by subtraction. Please see comment number 6 above.

    Thanks.
    Reply

    Posted by: Gregory K.April 4, 2013, 5:50 PM

    Hi, pls is it important to shave the hair off the incision site, as i have watched other videos on jove with the hair not shaved. The Autoclips, bipolar coagulator all appear to be expensive, pls can you itemize a replacement for a low cost mcao produre. How best do you think a student can learn and perfect this procedure, as ethics can only approve less than 10 wistar rats for the pilot study.

    Thanks Alex
    Reply

    Posted by: Olusiji A.June 3, 2013, 8:36 AM

    Shaving the incision site is a part of proper aseptic surgical technique and will be desired by most institutional ACUCs I believe. To reduce expense, you can tie off vessels with suture in place of using a bipolar coagulator. Microvascular clips are expensive, unfortunately. There is no substitute for practice to attain proficiency. You may consider performing the procedure on both left and right sides with the first couple of rats to increase your opportunities at learning the technique with fewer rats.
    Reply

    Posted by: Gregory K.June 3, 2013, 4:30 PM

    Great Insight! Thanks
    Reply

    Posted by: Olusiji A.June 4, 2013, 4:59 AM

    Hello, please how many times can i expect to re-use a reusable silicon coated suture from doccol....Can 5 reusable silicon coated sutures be sufficient for reuse with 102 rats...Thanks
    Reply

    Posted by: Olusiji A.July 4, 2013, 11:26 AM

    The number of times you can reuse a "reuseable" suture will vary depending on it physical condition. We have most often gotten 2 or 3 uses per suture without complaint, occasionally more. Sutures that have been used too many times, however, can lose their silicon tip inside the vessel (!) or potentially increase the risk of hemorrhage if the silicon coating is no longer nice and smooth. I would say that there is very little chance that you'd get >20 uses per suture!
    Reply

    Posted by: Gregory K.August 19, 2013, 3:55 PM

    hello every body, i am experiencing a problem while inducing stroke through MCAO. i am using nylon silk with manually rounded tip by heat for blocking Middle cerebral artry. some times luckily i easily inserted this silk into the middle artry, while many times i failed because the silk fail to insert , facing resistance from pterygopalatine artery. i don't know what to do, i search a lot how i should locate the artry so that i should easily inserted without facing any problem. your kind help will be greatly appreciated. one thing there is no problem with the nylon silk and rounded tip, becoz i kept the tip diameter approximately low, so that it easily pass the Middle artry once it inserted.
    Reply

    Posted by: Fawad ali s.August 17, 2013, 4:14 AM

    You may consider dipping your suture in a heparin solution to reduce the likelihood of the suture sticking to the endovascular surfaces. We have done this in the past to try reduce the risk of hemorrhage when removing flame-round sutures (prior to using the silicon-coated sutures that we employ currently). This is just a guess, but an indirect benefit may also be that it might be a little easier to position within the artery and so avoid the PTA. Perhaps your best bet would be to extend the exposure during surgery high enough to visual the PTA branchpoint if this continues to be a problem.
    Reply

    Posted by: Gregory K.August 19, 2013, 4:03 PM

    Hello all, please i need a confirmation to the protocol from literatures i find online as to measuring infarct volume. Here are my questions:

    1. When sacrificing the animal (rat) for TTC staining, do we perform whole body perfusion fixation to fix the brain tissue, what i read from most articles is not that explanatory (Example :- After 24 h of reperfusion, the animal is euthanized using an overdose of Anesthesia followed by cervical dislocation and decapitated to remove the brain carefully.)

    2. To lower the extent of infarct variability between animals, i am considering or tying off the right CCA with a suture prior to occluding the MCA and only to remove the suture from CCA after reperfusion. Do you think doing will not significantly compromise the pathophysiological of the MCAO-reperfusion stroke model and if it will help reduces variability as i hope.

    Thanks a lot
    Olusiji Alex
    Reply

    Posted by: Olusiji A.April 10, 2014, 3:43 AM

    Hi Alex,

    Determining infarct volume histologically is most commonly done using either TTC or cresyl violet staining, (although some people may still use H&E, as well). Staining with TTC requires fresh UNFIXED brain tissue because the conversion of the TTC substrate to a red formazan product in healthy tissues is carried out by mitochondrial dehydrogenases; cell death in the infarct leads to inactive enzymes and no red conversion in those areas. Fixation would destroy the enzymatic activity throughout the brain so you wouldn't get good red staining.

    If you want to stain fixed tissue, then cresyl violet (Nissl) staining can be used. This stains nucleic acids (esp. RNA) and works well to give neural tissues a nice purple color. In areas of neuronal cell death, the staining becomes much lighter. Fixation is done by transcardially perfusing the brain in situ with freshly prepared 4% paraformaldehyde or other fixative prior to extraction and then followed by additional post-fixing of the brain in 4% PFA overnight. We section (35 um) on a freezing microtome and mount every 6th or 7th slice for CV staining. Step by step protocols for CV staining should be widely available online or send me a email and I can send you ours directly.

    gckujoth [at] wisc [dot] edu

    As far as question 2, is the right CCA ipsilateral or contralateral to the MCA you are occluding? We occlude the left MCA, so by "tying off the right CCA" I interpret that as blocking the contralateral CCA but I am not sure if that is what you are asking.

    In any case, bilateral CCA occlusion is performed in the literature, sometimes in combination with MCAO and sometimes with exposure to hypoxia (via a hypoxia chamber). To me, that makes it a different model because you now have a global ischemia component. That is a valid model, certainly, as global ischemia/hypoxia occurs in other medical scenarios.

    If you meant to leave the ipsilateral CCA tied off during the period of MCA occlusion, then yes, you might be more successful at creating unilateral infarcts but the size of the lesions could potentially be larger and you again lose the "focal" nature of the model.

    Differences in the efficacy of the posterior circulation among rat strains will still be a factor in these variations involving CCA occlusion.

    You can probably find just about any occlusion variation you can imagine in the literature. The important thing would be to be consistent in your model among all the animals that you are trying to compare within a given study.

    Greg
    Reply

    Posted by: Gregory K.April 22, 2014, 4:17 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter