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 JoVE Neuroscience

含量测定β-淀粉样蛋白的毒性,使用转基因 C。线虫模型

1, 1,2

1Institute for Behavioral Genetics, University of Colorado, 2Integrative Physiology, University of Colorado

Article
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    Summary

    Cite this Article

    Dostal, V., Link, C. D. Assaying β-amyloid Toxicity using a Transgenic C. elegans Model. J. Vis. Exp. (44), e2252, doi:10.3791/2252 (2010).

    Abstract

    积累的β-淀粉样肽(Aβ)一般认为是阿尔茨海默氏病的诱导,但目前仍不清楚有关的机制(S)的毒性。 Aβ是还交存肌注包涵体肌炎,严重的人类性肌病。激烈的研究线虫线虫可以transgenically设计,以表达人类的Aβ。根据对组织或对Aβ表达的时机,转基因蠕虫可以很容易衡量的,对Aβ毒性的一个读出的表型。例如,泛神经元Aβ的表达的转基因蠕虫的缺陷是联想学习(杜新志等,2009年),而同构肌肉特异性表达的转基因蠕虫显示一个渐进的,年龄依赖的麻痹表型(Cohen等链接,1995年; 2006年)。一个特别有用的C。线虫模型采用了一个温度敏感突变的mRNA监视系统工程师肌肉温度诱导Aβ的转基因表达,在重现瘫痪表型后,温度升档( 链接等,2003) 。治疗计数器在此模型中Aβ的毒性[例如,一个保护性基因( 哈桑等人,2009年)的表达,或置身于银杏叶提取物(吴等 ,2006)]再现改变温度升档,这些转基因引起的瘫痪率蠕虫。在这里,我们描述了我们的协议,在这种转基因 C.测量瘫痪率线虫模型,特别注意实验变量,可以影响这个测量。

    Protocol

    1)准备瘫痪检测线虫生长介质板。

    麻痹检测执行标准线虫的生长介质(NGM)常规 C板线虫的繁殖和遗传学(Stiernagle 2006年)。

    1. 高压灭菌的NGM的溶液中含有氯化钠,蛋白胨琼脂和一个锥形瓶中,并添加适当的数额无菌氯化钙 2,尿嘧啶,胆固醇硫酸镁1M 1M KPO 4 。分装10毫升的液体NGM到每60毫米× 15毫米培养皿。允许NGM,以巩固在室温下过夜。
    2. 如果测试化合物/提取,分装提取的影响到每个板块和使用吊具均匀地分布在板面的提取物。允许提取物在室温下过夜干燥。超过1毫升的量将需要更多的时间来干。
    3. 每盘现货250μL 大肠杆菌菌株 OP5O生长在LB培养基过夜光密度为0.4-0.6。使细菌在室温下干燥过夜。

    相关变量

    板块的时代已经瘫痪检测的一个显着的影响,年纪较大的板块往往要干出。使用板浇瘫痪检测一周内。对于理想的效果,倒板前3-4天开始同步蠕虫人口以下(2)]。对于任何实验,只能使用同一批次浇板。

    改变大小的草坪(即发现与传播)和/或细菌的类型,也将改变蠕虫的行为。可以使用替代性大肠杆菌麻痹检测作为食物来源(例如,用于喂养RNAi实验的HT115株),但可以改变瘫痪的动力学,因此需要适当的内部控制大肠杆菌

    2)年龄同步蠕虫种群的制备

    应变CL4176(SMG - 1(cc546 TS)我; dvIs27 [MYO - 3 /Aβ的小基因+ ROL - 6(su1006)标记基因] X是最常用的化验Aβ引起的瘫痪,这种菌株和其他转基因模型可用。为一个象征性的费用从线虫遗传学中心 (http://www.cbs.umn.edu/CGC/)的学术研究。

    1. 为了最大限度地测试人群的年龄,最好是开始一个同步的亲代同步。一周前发起的试验人群的麻痹检测,使用铂金蠕虫选择器将其转移到了10厘米NGM的传播与OP50板为2小时蛋20-30妊娠的成年人躺在在16℃(CL4176宽松的温度)。取出妊娠的成年人,并让后代成长为7天,届时他们将“第二天”妊娠成人。
    2. (第一天)第二天妊娠成人准备的年龄同步测试人群。对于每一个实验条件的对象是50-75年龄同步蠕虫生成一式三份板。使用铂金蠕虫选择器,转移到60毫米(10毫升体积)与OP50发现NGM板的第2天的妊娠成人10-12。允许蠕虫在16 ° C打下鸡蛋2个小时,然后摘掉成年人,让鸡蛋孵化,成长在16 ° C。在这一点上是最好的人谁也不会得分板代码,所以射手将是盲目的实验条件。

    相关变量

    产卵时,胚胎发育阶段(〜26细胞阶段的最佳条件下的野生型蠕虫)是一个成人的年龄和营养的功能。如果用于编写测试人口的妊娠成年人老年人或饿死,稍后阶段鸡蛋将被解雇,减少了人口的年龄和重现性麻痹动力学同步。这是比单无菌(即,只有OP50细菌)用于文化(微生物污染物会严重影响这个实验),重现性是最高的,如果一式三份板有类似的蠕虫。

    3)转基因诱导和瘫痪检测

    1. (3天)至25日的上移板打下° C 48小时后同步鸡蛋;蠕虫应在第三幼虫阶段(L3)。板应安排无堆叠在25℃孵化器,以允许所有板块在同一时间达到25℃。
    2. (4天)开始的蠕虫瘫痪(株CL4176)得分在18-20小时后开始的升档。此时,在人群中的所有蠕虫应该已经达到第四幼虫(L4)的阶段。继续在两个小时的的增量得分,直到每个板块上的所有蠕虫瘫痪。原因不明,瘫痪甚至整个车身长度:头部区域的最后一部分是蠕虫停止移动。因此,W最近发起瘫痪奥姆斯不能转化跨板,但可以将他们的头上,从而左右他们的前清除细菌和清除细菌留下了“光环”。这些蠕虫都会成为完全瘫痪,因此晕蠕虫被归类为瘫痪。有些蠕虫不会有光晕,但也不会显示自发的运动,这些都是刺激与蠕虫选择器进行测试。如果打了招呼的蠕虫无法接受一个完整的体波传播后打回原形,也取得了瘫痪。为了有效地得分,这是最简单的方法,使他们不会被无意rescored未来的得分期间,将瘫痪的蠕虫板unspotted部门。 (这也可以让错误分类的蠕虫展示运动,让得分校正)。
    3. 要生成一个瘫痪曲线,在每个时间点的蠕虫病毒在每个尚未瘫痪板的一小部分是转换为百分比,以及平均“unparalyzed”的比例是绘制免受升档启动时间。 (阴谋以这种方式的理由是,由此产生的曲线是正式类似的生存曲线,从而可以使用标准的非参数生存统计分析。)

    相关变量

    必须发生之前,他们到达瘫痪中期L4阶段发起,MYO - 3启动子的发育调控,并大大减少了在后期L4或成虫表达的转基因myo-3/Aβ蠕虫升档。同样,这种基因的表达被阻塞,如果蠕虫成为饿死,因此至关重要的是,蠕虫是整个实验过程中精心喂养。我们从来没有看到一个瘫痪的蠕虫病毒,在任何条件下恢复,和升档12-16小时后,所有CL4176蠕虫会瘫痪,即使它们下移至16 ° C。 CL4176应变,足够的转基因表达的上调导致瘫痪可以发生在较低温度下(即,在20-25℃),虽然瘫痪的时间将被改变。瘫痪率取决于使用特定的转基因株(我们已经构建了更快和更慢的CL4176率myo-3/Aβ株),所以替代株得分窗口可能需要进行调整。

    4)代表性的成果

    在图1所示为CL4176麻痹曲线的情节,都未经处理和暴露6.27毫米咖啡因(NGM板终浓度)。在一个高度统计学意义延迟约4小时,我们在此模型中,抑制Aβ的毒性指示瘫痪的治疗效果。在图2所示是一个独立的实验,化验cafestol,咖啡中发现的另一种化合物的影响。此图是典型的治疗,不影响Aβ的毒性。请注意,在两个实验中的一半左右未经处理的CL4176人口瘫痪24小时,并瘫痪28小时完成。这是典型的时限控制CL4176人口瘫痪。从这个时机的重大偏差的环境条件的改变或自发的转基因拷贝缺失的指示。 (CL4176包含一个集成的染色体myo-3/Aβ基因的多个副本的转基因阵列,尽管这种转基因阵列通常是相当稳定,任何传播的应变温度> 16 ° C将选择经历了罕见的蠕虫自发的转基因删除,导致变种,会减少Aβ的表达和较慢的瘫痪结果。)

    图1
    图1。麻痹应变CL4176蠕虫未经处理或暴露到6.27毫米咖啡因(Sigma公司)的曲线 。表明次启动温度上移。误差线=扫描电镜

    图2
    图2。麻痹CL4176蠕虫接触到0.48毫米cafestol(Sigma公司)的曲线 。误差线=扫描电镜

    Discussion

    我们所描述的协议,可以有效地用于检测Aβ的毒性化合物影响。发布的例子包括:银杏叶提取物成分的影响(吴等 ,2006)和利血平(Arya等人,2009年)。已对在其他系统中的Aβ的毒性保护的化合物也显示,在此模型中的保护(例如,美金刚,我们未发表的结果)。建立这种模式的一个重要理由是,发达的遗传和分子工具 C 线虫可以用来调查对Aβ毒性机制。因此,Aβ的毒性作用的特定的突变可以被检测(例如,减少胰岛素样信号引入DAF - 2功能丧失突变,FLOREZ - 麦克卢尔等 。2007年生效),而这种模式也可以用来检查过度表达的转基因(Fonte酒店等,2008)的影响。最近,我们已经取得了广泛使用这种模式,检查单中Aβ的氨基酸替换(未发表数据)的毒性的影响。

    这里描述的转基因模型分析的急性Aβ的表达肌肉细胞功能的影响。在麻痹肌肉细胞和它们的肌的时候是完好的;瘫痪的表型是不是肌肉细胞死亡的结果。然而,(〜48小时后最初的升档)后瘫痪肌肉的完整性和最终死亡的蠕虫有一个击穿。我们没有调查这下游的Aβ表达影响,或用作毒性标志。

    这里描述的诱导Aβ的表达模式是没有适当的调查治疗方法,调节β-淀粉样蛋白形成本身。虽然同构的Aβ表达形式易被察觉淀粉样蛋白沉积的转基因蠕虫( 仙子等人1998年; Link 等人,2001年),与诱导的Aβ表达的转基因蠕虫很少有淀粉样蛋白沉积,并出现瘫痪的表型淀粉蛋白沉积 (德雷克等独立。 2003年)。我们的研究结果是一致的观点,急性毒性诱导的Aβ表达的可溶性低聚物Aβ的积累,而不是淀粉样蛋白沉积的结果。

    Disclosures

    没有利益冲突的声明。

    Acknowledgements

    我们要感谢帮助开发协议,在这里,特别是杜松子酒Fonte酒店,谁开发的原程序的链接实验室的现任和前任成员。这项工作已经从美国国立卫生研究院(AG12423)和阿尔茨海默氏症协会(ZENITH奖)的奖项,以民盟的支持

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    NaCl (6g) Sigma-Aldrich S9888
    Agar (40g) Sigma-Aldrich A7002
    Peptone (5g) Sigma-Aldrich P0556
    ddH2O (2L)
    1M CaCl2 (2mL) 147.02mg/mL in ddH2O
    Uracil (2mL) 2mg/mL in ddH2O
    Cholesterol (2mL) 5mg/mL in ethanol (do not autoclave)
    1M MgSO4 (2mL) 246.5mg/mL in ddH2O
    1M KPO4 (50mL) 98mg KH2PO4.mL, 48mg K2HPO4/mL in ddH2O, pH
    Erlenmeyer Flask VWR international

    References

    1. Arya, U., Dwivedi, H. & Subramaniam, J. R. Reserpine ameliorates Abeta toxicity in the Alzheimer's disease model in Caenorhabditis elegans. Exp Gerontol 44, 462-6 (2009).
    2. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W. & Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science 313, 1604-10 (2006).
    3. Dosanjh, L. E., Brown, M. K., Rao, G., Link, C. D. & Luo, Y. Behavioral phenotyping of a transgenic C. elegans expressing neuronal amyloid-beta. J Alzheimers Dis (2009).
    4. Drake, J., Link, C. D. & Butterfield, D. A. Oxidative stress precedes fibrillar deposition of Alzheimer's disease amyloid beta-peptide (1-42) in a transgenic Caenorhabditis elegans model. Neurobiol Aging 24, 415-20 (2003).
    5. Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J. & Link, C. D. In vivo aggregation of beta-amyloid peptide variants. J Neurochem 71, 1616-25 (1998).
    6. Florez-McClure, M. L., Hohsfield, L. A., Fonte, G., Bealor, M. T. & Link, C. D. Decreased insulin-receptor signaling promotes the autophagic degradation of beta-amyloid peptide in C. elegans. Autophagy 3, 569-80 (2007).
    7. Fonte, V. et al. Suppression of in vivo beta-amyloid peptide toxicity by overexpression of the HSP-16.2 small chaperone protein. J Biol Chem 283, 784-91 (2008).
    8. Hassan, W. M., Merin, D. A., Fonte, V. & Link, C. D. AIP-1 ameliorates beta-amyloid peptide toxicity in a Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model. Hum Mol Genet 18, 2739-47 (2009).
    9. Link, C. D. Expression of human beta-amyloid peptide in transgenic Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 9368-72 (1995).
    10. Link, C. D. et al. Gene expression analysis in a transgenic Caenorhabditis elegans Alzheimer's disease model. Neurobiol Aging 24, 397-413 (2003).
    11. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook, 1-11 (2006).
    12. Wu, Y. et al. Amyloid-beta-induced pathological behaviors are suppressed by Ginkgo biloba extract EGb 761 and ginkgolides in transgenic Caenorhabditis elegans. J Neurosci 26, 13102-13 (2006).

    Comments

    1 Comment

    Is it possible to use dyes/indicators once the worm has been termed paralyzed, or possibly during the progress of paralysis? Thank you for your answer as well as your very informative video and protocol.
    Reply

    Posted by: Alex T.March 19, 2013, 6:00 PM

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