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Yang, J., Delaloye, K., Lee, U. S., Cui, J. Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes. J. Vis. Exp. (47), e2269, doi:10.3791/2269 (2011).
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल बड़े प्रवाहकत्त्व, वोल्टेज और 2 Ca + K सक्रिय + चैनलों (बी) के सक्रियण का अध्ययन करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. प्रोटोकॉल भी अन्य आयन चैनलों और neurotransmitter एक रिसेप्टर्स के लिए रिश्ता संरचना समारोह का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बीके चैनलों व्यापक रूप से विभिन्न ऊतकों में व्यक्त कर रहे हैं और चिकनी मांसपेशी संकुचन के विनियमन, भीतरी बालों की कोशिकाओं की आवृत्ति ट्यूनिंग और neurotransmitter रिहाई 2-6 के नियमन सहित कई शारीरिक कार्यों में फंसाया गया है है. बीके चैनलों झिल्ली विध्रुवण और intracellular Ca 2 + मिलीग्राम और 2 6-9 + द्वारा सक्रिय कर रहे हैं. इसलिए, प्रोटोकॉल दोनों झिल्ली वोल्टेज और intracellular समाधान को नियंत्रित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. इस प्रोटोकॉल में, बीके चैनलों के दूत शाही सेना Xenopus laevis oocytes (चरण वी छठी) 18 ° 10-13 सी पर 2-5 दिन ऊष्मायन द्वारा पीछा में अंतःक्षिप्त है. झिल्ली पैच कि एकल या एकाधिक चैनलों बीके होते अंदर बाहर विन्यास पैच दबाना 10-13 तकनीक का उपयोग के साथ excised हैं. पैच के intracellular ओर वांछित समाधान के साथ इतना है कि विभिन्न शर्तों के तहत चैनल सक्रियण जांच की जा सकती रिकॉर्डिंग के दौरान perfused है. संक्षेप में प्रस्तुत करने के लिए, बीके चैनलों के mRNA Xenopus laevis oocytes में इंजेक्शन oocyte झिल्ली पर चैनल प्रोटीन व्यक्त, पैच दबाना तकनीक नियंत्रित वोल्टेज और intracellular समाधान के तहत चैनलों के माध्यम से बहती धाराओं रिकॉर्ड के लिए उपयोग किया जाता है.
0.05 सुई - 50 एनजी दूत शाही सेना है कि इन विट्रो में Xenopus laevis oocytes (चरण वी छठी) Nanoject द्वितीय ऑटो nanoliter इंजेक्टर (Drummond वैज्ञानिक कंपनी, 3-000-204 मॉडल) का उपयोग में लिखित . प्रत्येक mRNA के लिए एक दर्जन से अधिक oocytes पर इंजेक्शन दोहराएँ.
दो बार इंजेक्शन का उपयोग oocytes कुल्ला ND-96 समाधान (96 मिमी सोडियम क्लोराइड (NaCl, श्री 58.44 छ / mol), 2 मिमी पोटेशियम क्लोराइड (KCl, श्री 74.56 छ / mol), 1.8 मिमी कैल्शियम क्लोराइड (2 CaCl • 2H 2 हे , श्री 147.02), 1 मिमी मैग्नीशियम (2 MgCl • 6 2 हे, श्री 203.31 छ / mol) क्लोराइड, 5 4 मिमी (2 hydroxyethyl) 1 piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES, श्री 238.31 छ / mol), 2.5 मिमी सोडियम पाइरूवेट (श्री 110.04 छ / mol), और 1x पेनिसिलीन स्ट्रेप्टोमाइसिन. पीएच 7.6), तो उन्हें एक संस्कृति की थाली और सेते में 18 ° जगह सी 2 + दिनों के लिए.
2. छिड़काव प्रणाली की तैयारी
स्वचालित ValveLink 16 छिड़काव प्रणाली का चित्रण. छिड़काव प्रणाली दबाव नाइट्रोजन का उपयोग करता छिड़काव समाधान समाधान जलाशयों से बाहर धक्का है, छिड़काव tubings के माध्यम से, और छिड़काव पेंसिल और टिप करने के लिए. छिड़काव समाधान के प्रत्येक धारा के प्रवाह के एक जलाशय वाल्व और एक इलेक्ट्रॉनिक वाल्व द्वारा नियंत्रित है. इस प्रोटोकॉल में, जलाशयों में दबाव और बर्बादी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दबाव रिलीज तंत्र कलेक्टर के रूप में कार्य नहीं है. (चित्र विक्रेता वेबसाइट http://www.autom8.com से अनुकूलित)
छिड़काव पेंसिल tubings कनेक्ट. इलेक्ट्रॉनिक वाल्व नियंत्रक पर मुड़ें और इलेक्ट्रॉनिक वाल्व खुला.
करने के लिए विश्वास दिलाता हूं कि छिड़काव और पेंसिल tubings रोकना और हवाई बुलबुले के लिए स्वतंत्र हैं, प्रत्येक विआयनीकृत जल से भर सिरिंज का उपयोग कर टयूबिंग के माध्यम से धक्का विआयनीकृत जल (डीआई).
समाधान जलाशयों tubings कनेक्ट और गैस के दबाव नाइट्रोजन को लागू करने के लिए सिलेंडर वाल्व खुला.
जलाशय वाल्व ओपन के लिए जलाशय समाधान के साथ टयूबिंग को भरने के लिए. जलाशय वाल्व झाड़ समाधान में बुलबुले दूर अगर जरूरत है. वाल्व बंद के बाद टयूबिंग समाधान के साथ भरा है.
पानी के साथ छिड़काव टिप भरें और यह छिड़काव पेंसिल पर पेंच. किसी भी बुलबुले नहीं जाल जब टिप जोड़ने के लिए सावधान रहें.
छिड़काव स्नान क्ले मॉडलिंग का उपयोग चरण के लिए पेंसिल को ठीक करें. सुनिश्चित करें कि छिड़काव टिप स्नान अंतरिक्ष में है. छिड़काव प्रणाली अब सेट कर दिया जाता है.
स्नान में डि पानी जोड़ें. सुनिश्चित करें कि छिड़काव टिप पानी में डूबे हुए है.
टेस्ट कि प्रत्येक छिड़काव समाधान छिड़काव टिप का सही ढंग से बाहर आता है. इलेक्ट्रॉनिक अपशिष्ट कलेक्टर के टयूबिंग से जुड़ा वाल्व बंद करो और एक समय पर छिड़काव समाधान (140 मिमी पोटेशियम हीड्राकसीड (KOH, वाल्व के लिए खोलने के एम 56.1 छ / mol r), 20 4 मिमी - (2 hydroxyethyl) -1 - piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES, एम आर 238.31 छ / mol), 2 मिमी पोटेशियम क्लोराइड (KCl, एम आर 74.56 छ / mol), 1 मिमी ईथीलीन (2 aminoethylether) glycol-बीआईएस - एन, एन, एन, N' tetraacetic एसिड (EGTA, एम आर 380.35 छ / mol), पीएच methanesulfonic एसिड (3 Meso, एम आर 96.1 छ / mol), 2 Ca द्वारा 7.1-7.2 के लिए निकाला जाता है + या Mg2 + इच्छित एकाग्रता के लिए जोड़ा है जब जरूरत थी) . खुर्दबीन के तहत, छिड़काव तरल पदार्थ छिड़काव टिप से बाहर आने के विमान का पालन करें. छिड़काव के समाधान के लिए वाल्व बंद करो और बर्बाद कलेक्टर के लिए वाल्व खुला. छिड़काव जेट लगभग गायब हो जाना चाहिए. सभी छिड़काव समाधान के लिए एक ही परीक्षण दोहराएँ.
जब आप सत्यापित किया है कि सभी छिड़काव समाधान सही ढंग से प्रवाह, डि में नहाने के समाधान के साथ स्नान (140 मिमी पोटेशियम हीड्राकसीड (KOH, पानी की जगह एम 56.1 छ / mol नि.), 20 4 मिमी (2 hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES, एम आर 238.31 छ / mol), 2 मिमी पोटेशियम क्लोराइड (KCl, एम आर 74.56 छ / mol), पीएच 7.1-7.2 methanesulfonic एसिड (3 Meso, एम आर 96.1 छ / mol)) द्वारा निकाला जाता है.
3. पैच Clamping
Recoat AgCl साथ एजी रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड से पहले हर पैच सत्र clamping. सबसे पहले, पिपेट धारक और कम से कम 15 मिनट के लिए एक ताजा ब्लीच युक्त शीशी में बिजली तार की नोक आधा डूब से बिजली तार हटा दें. यह जमा AgCl के तार पर एक परत.
विआयनीकृत जल के साथ बिजली तार कुल्ला और सूखी दाग. फिर एजी / AgCl इलेक्ट्रोड वापस स्थापित पिपेट धारक में.
Headstage स्नान इलेक्ट्रोड (संदर्भ) कनेक्ट और स्नान में यह जगह. यह रिकॉर्डिंग के लिए इलेक्ट्रोड तैयार करता है.
अब डाटा अधिग्रहण के लिए तैयार है. आपके कंप्यूटर पर मुड़ें और हार्डवेयर कुंजी आपके कंप्यूटर के प्रिंटर पोर्ट में प्लग. हार्डवेयर कुंजी के लिए आप का उपयोग करने के लिए डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर, जो HEKA नाड़ी खामियों को दूर किया जाना चाहिए.
प्रवर्धक पर स्विच (Axon उपकरण, AXOपैच 200B) और शुरू HEKA पल्स. प्रोटोकॉल फ़ाइल को लोड और विन्यास सेटिंग्स समायोजित ऐसे प्रोत्साहन स्केल के रूप में. विन्यास सेटिंग्स समायोजित करने के लिए लक्ष्य को विश्वास दिलाता हूं कि परीक्षण की क्षमता वास्तव में आदेश की क्षमता के बराबर है. यह डाटा अधिग्रहण उपकरण बनाती है.
Oocytes तैयार. डूब विपठ्ठन समाधान में oocyte (200 मिमी एन - मिथाइल - डी glucamine (NMG, एम आर 195.22 छ / mol), 200 मिमी (aspartate कोई कश्मीर +) KCl (एम आर 133.1 छ / mol), 2 मिमी पोटेशियम क्लोराइड ( , एम 74.56 छ / mol r), 10 मिमी ईथीलीन glycol बीआईएस (2 - aminoethylether) एन, एन, एन, N'tetraacetic एसिड (EGTA, एम 380.35 छ / mol r), 1 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड (MgCl • 2 6 2 हे, एम 203.31 छ / mol नि.), 10 4 मिमी (2 hydroxyethyl) 1 piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES, एम आर 238.31 छ / mol), पीएच 7.4 सोडियम हीड्राकसीड द्वारा निकाला जाता है (NaOH, एम 40.0 छ / mol r) 5 के लिए - 10 मिनट विपठ्ठन समाधान प्लाज्मा झिल्ली जो vitelline झिल्ली पट्टी करने के लिए यह संभव बनाता है से vitelline झिल्ली detaches.
धीरे संदंश के दो जोड़े का उपयोग oocyte से vitelline झिल्ली पट्टी. एक devitellinized oocyte अत्यंत नाजुक और आवश्यक के रूप में में छोटा रूप में इसलिए ले जाया जा चाहिए है.
देखभाल करने के लिए हवा या बुलबुले devitellinized oocyte उजागर रोकने के लिए, पर्याप्त समाधान के लिए स्नान करने के लिए oocyte हस्तांतरण के साथ भरा एक गिलास विंदुक का उपयोग करें. यह रिकॉर्डिंग के लिए oocyte तैयार करता है.
पैच pipettes तैयार. P-97 ज्वलंत / ब्राउन micropipette डांड़ी Sutter में एक गिलास केशिका ट्यूब (VWR इंटरनेशनल, बिल्ली 53432-921 #) डालने के बाद गिलास pipettes खींचो. निरीक्षण खुर्दबीन के नीचे pipettes टिप आकार और खोलने के व्यास का निर्धारण. खोलने व्यास 2-4 micrometers होना चाहिए.
रिकॉर्डिंग के दौरान capacitive वर्तमान को कम करने और एक चिकनी टिप, कोट मोम के साथ टिप सुनिश्चित और फिर इसे आग पॉलिश.
(2 hydroxyethyl) 1 piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES एम आर - विंदुक समाधान (140 मिमी पोटेशियम हीड्राकसीड (KOH, एम आर 56.1 छ / mol), 20 4 मिमी के अंदर विंदुक की नोक रखकर विंदुक टिप भरें 238.31 छ / mol), 2 मिमी पोटेशियम क्लोराइड (KCl, एम आर 74.56 छ / mol), 2 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड (2 MgCl • 6 2 हे, एम आर 203.31 छ / mol), पीएच methanesulfonic द्वारा 7.1-7.2 से निकाला जाता है एसिड (3 Meso, एम आर 96.1 छ / mol)) और सवार ड्राइंग. इस टिप wets.
विंदुक एक सिरिंज का उपयोग कर समाधान के साथ 1 / 3 पूर्ण विंदुक भरें और इलेक्ट्रोड / एजी AgCl अंदर और विंदुक समाधान के साथ संपर्क के साथ विंदुक धारक में पिपेट जगह है. इस पैच विंदुक तैयार करता है.
तैयार oocyte से अंदर बाहर एक पैच उत्पाद खुर्दबीन के नीचे oocyte की स्पष्ट बढ़त मिल. पैच विंदुक जोड़तोड़ का उपयोग oocyte के लिए करीब ले जाएँ. विंदुक के सीरियल प्रतिरोध का रिकार्ड है. पैच विंदुक के आदर्श श्रृंखला प्रतिरोध MΩ 1-1.5 के बीच जब विंदुक समाधान के साथ भरा है और स्नान समाधान में डूबे हुए है.
धीरे धीरे जब तक प्रतिरोध लगभग युगल oocyte के खिलाफ विंदुक धक्का.
झिल्ली को मुँह से जो विंदुक धारक के लिए जुड़ा हुआ है जब तक मुहर giga ओम प्राप्त है एक चूषण ट्यूब के माध्यम से कोमल चूषण लागू. वोल्टेज -30 एम वी पर यह मिनट के एक जोड़े के लिए धारण करके पैच स्थिर.
एक पैच के अंदर बाहर आबकारी जल्दी विंदुक आगे oocyte में धक्का और फिर धीरे से इसे बाहर खींच करके पैच प्राप्त करने के लिए.
अंदर - बाहर पैच अब clamping के लिए तैयार है. छिड़काव टिप के उद्घाटन के बारे में 100 माइक्रोन से अंदर - बाहर पैच दूर पकड़े विंदुक ले जाएँ.
अपशिष्ट इकट्ठा करने के लिए इलेक्ट्रॉनिक वाल्व बंद करें और वांछित छिड़काव समाधान के लिए जलाशय वाल्व खोलने
पैच भर धाराओं रिकॉर्डिंग शुरू करो. वोल्टेज और छिड़काव के रूप में वांछित समाधान बदलें.
जब आप रिकॉर्डिंग खत्म हो रहे हैं, विआयनीकृत जल के माध्यम से धक्का मोज़री से बचने द्वारा छिड़काव tubings पेंसिल, और टिप साफ.
4. प्रतिनिधि परिणाम
पैच दबाना के लिए oocytes की तैयारी के दौरान विपठ्ठन समाधान के 5-10 मिनट के इलाज के प्लाज्मा झिल्ली है, जो संभव बनाता है vitelline झिल्ली विपठ्ठन से vitelline झिल्ली अलग होगा.
पैच विंदुक के आदर्श श्रृंखला प्रतिरोध MΩ 1-1.5 के बीच जब विंदुक समाधान के साथ भरा है और स्नान समाधान में डूबे हुए है.
जंगली प्रकार एक oocyte झिल्ली पैच पर बीके चैनलों के एक प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग है. 50 mV से 50 mV के वेतन वृद्धि के साथ 200 mV वोल्टेज बढ़ जाती है के दूसरे चरण के बाईं शीर्ष पर, वर्ग तरंगों पैच के लिए लागू वोल्टेज से संकेत मिलता है. नीचे इसी वर्तमान निशान जब छिड़काव समाधान नाममात्र 0 2 Ca + (मुक्त [ca 2 +] के बारे में 0.5 एनएम) है. मेंवर्तमान आयाम के क्रीज इंगित करता है कि बीके चैनलों के खुले संभावना वोल्टेज के साथ बढ़ जाती है. सही तरफ, एक ही पैच 1.0 सुक्ष्ममापी 2 Ca के साथ perfused है जब एक ही वोल्टेज प्रोटोकॉल के साथ लागू होता है. वर्तमान आयाम एक ही वोल्टेज के तहत और अधिक बढ़ जाती है, यह दर्शाता है कि खुले संभावना [2 Ca +] के साथ बढ़ जाती है.
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oocyte अभिव्यक्ति प्रणाली वोल्टेज पर निर्भर आयन अंतर्जात चैनलों की अपेक्षाकृत कम पृष्ठभूमि के कारण चैनलों के electrophysiological लक्षण वर्णन के लिए आदर्श है. इसके अलावा, के बाद से यह एक क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली है, यह इन चैनलों के mutagenesis के अध्ययन प्रदर्शन का एक कारगर तरीका प्रदान करता है. हालांकि, यह नोट किया जाना चाहिए कि oocyte अभिव्यक्ति प्रणाली में है कि स्तनधारी कोशिकाओं से अलग है, इस प्रकार बाद translational और अलग अलग सब यूनिटों के साथ संशोधन संघ में मतभेद हो सकता है. इसके अलावा, लिपिड एकाग्रता दो कोशिकाओं जो चैनल के कार्यात्मक संपत्तियों को प्रभावित कर सकता है के बीच भिन्न हो सकती है.
छिड़काव tubings पेंसिल, और टिप डि पानी के साथ रोकना बचने के प्रयोग के बाद हर बार साफ किया जाना चाहिए. हमेशा ताजा ब्लीच का उपयोग करने के लिए एजी बिजली तार का इलाज करने के लिए सुनिश्चित करें AgCl के साथ लेपित है, अन्यथा रिकॉर्डिंग गलत हो जाएगा. डाटा अधिग्रहण के लिए विन्यास सेटिंग्स समायोजित करें ताकि परीक्षण क्षमता वास्तव में आदेश की क्षमता के बराबर है. यह उपयोगी हो सकता है रखने के लिए पैच साफ pipettes तो एक ढक्कन का उपयोग करने के लिए उन्हें गंदगी और उन्हें उपयोग करने से पहले ही आग पॉलिश से बचाने होगा.
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यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य R01-HL70393 और JCJC R01-NS060706 अनुदान के संस्थान के द्वारा समर्थित किया गया स्पेन्सर टी. Olin बंदोबस्ती पर बायोमेडिकल इंजीनियरिंग के एक प्रोफेसर है.
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