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Thakur, P., Fomina, A. F. Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (46), e2346, doi:10.3791/2346 (2010).
टी lymphocytes, 2 Ca की कमी intracellular Ca से 2 + + दुकान plasmalemmal Ca 2 के सक्रियण के लिए होता है + चैनलों, रिलीज सक्रिय कैल्शियम कैल्शियम चैनल (CRAC) कहा जाता है. CRAC चैनलों टी सेल प्रसार और जीन अभिव्यक्ति के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. गंभीर संयुक्त इम्यूनो और autoimmune 1 रोगों, 2 टी कोशिकाओं में असामान्य CRAC चैनल समारोह जोड़ा गया है. मानव टी कोशिकाओं में CRAC चैनल समारोह अध्ययन नया आणविक सामान्य प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को विनियमित तंत्र को उजागर करने और संबंधित मानव रोगों के कारणों को सुलझाना सकता है. झिल्ली धाराओं के electrophysiological रिकॉर्डिंग कार्यात्मक चैनल गुण और उनके विनियमन के सबसे सटीक आकलन प्रदान करते हैं. CRAC Jurkat टी कोशिकाओं, एक मानव लेकिमिया टी सेल लाइन में चैनल धाराओं के electrophysiological मूल्यांकन पहले 20 से अधिक वर्षों के 3 पहले प्रदर्शन किया गया था, तथापि, सामान्य मानव टी कोशिकाओं में CRAC वर्तमान माप एक चुनौती भरा काम रहता है. सामान्य टी कोशिकाओं में CRAC चैनल धाराओं रिकॉर्डिंग करने में कठिनाइयों तथ्य यह है कि रक्त व्युत्पन्न टी lymphocytes Jurkat टी कोशिकाओं की तुलना में आकार में बहुत छोटे और, इसलिए, अंतर्जात पूरे सेल CRAC धाराओं आयाम में बहुत कम हैं कर रहे हैं से बढ़ रहे हैं. यहाँ, हम एक कदम दर कदम प्रक्रिया है कि हम नियमित Ca 2 रिकॉर्ड का उपयोग + या ना + मानव टी स्वस्थ स्वयंसेवकों के परिधीय रक्त से अलग कक्षों के आराम में CRAC चैनलों के माध्यम से धाराओं. देना विधि यहाँ वर्णित Jurkat टी कोशिकाओं में CRAC धाराओं रिकॉर्डिंग और मानव टी कोशिकाओं 4-8 सक्रिय करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं से अपनाया गया था.
RosetteSep मानव टी सेल संवर्धन कॉकटेल और RosetteSep घनत्व मध्यम का प्रयोग, निर्माता के निर्देशों के अनुसार मानव रक्त के नमूनों से टी कोशिकाओं को शुद्ध. परिणामस्वरूप सेल की आबादी 95% CD3 + आराम टी कोशिकाओं को शामिल करना चाहिए. हम परिधीय रक्त UC डेविस आंतरिक समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ अनुसार स्वस्थ स्वयंसेवकों से एकत्र नमूनों से मानव टी lymphocytes शुद्ध.
अलगाव के बाद, सेल संस्कृति माध्यम में 0.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक घनत्व glutamine और HEPES साथ RPMI - १,६४० मध्यम युक्त पर आराम टी कोशिकाओं resuspend, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 2% GlutaMAX मैं, 1% 1640 RPMI के साथ पूरक विटामिन समाधान, 1% RPMI 1640 अमीनो एसिड समाधान है, 1% सोडियम पाइरूवेट, और 0.03% β-mercaptoethanol.
जगह सेल संस्कृति बोतल में सेल निलंबन और 24 घंटे तक प्रयोग करने के लिए पहले के लिए ° सी humidified इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 के साथ 37 पर बनाए रखने के.
2. रिकॉर्डिंग चैंबर तैयार
निम्नलिखित रिकॉर्डिंग कक्षों तैयार की जरूरत है: एक) सिलिकॉन O-अंगूठी, ख) दौर, 70% इथेनॉल और आसुत एच 2 हे, ग के साथ 25 मिमी साफ coverslips) Sylgard184 मिश्रित निर्माता के निर्देशों के अनुसार तैयार है, और घ ) दो 60 x 15 मिमी पेट्री डिश.
~ प्लेस एक 60x15 मिमी पेट्री डिश में 0.5 एमएल Sylgard184 मिश्रित.
Sylgard184 का उपयोग संदंश में O-अंगूठी के निचले भाग डुबकी.
O-अंगूठी के रिम से अन्य पेट्री डिश के रूप में एक स्वच्छ सतह, पर हे अंगूठी रखकर अतिरिक्त Sylgard184 निकालें.
Coverslip पर अंगूठी प्लेस और यह नीचे दबाएँ.
85 ° 40-60 मिनट के लिए या Sylgard184 जब तक सी polymerized कक्षों हीटिंग द्वारा Sylgard184 चिकित्सा.
धूल से मुक्त एक कंटेनर में स्टोर रिकॉर्डिंग कक्षों.
3. पैच pipettes तैयार
प्रयोग के दिन, एक ~ 2 सुक्ष्ममापी टिप व्यास के साथ कांच capillaries और विंदुक खींचने का उपयोग pipettes खींच. हम रेशा (1.5 मिमी और ID: 1.10 मिमी ओवर ड्राफ्ट) के साथ borosilicate टयूबिंग का उपयोग करें. एक धूल से मुक्त स्थान में स्टोर pipettes.
Sylgard184 या HIPEC R6101 सेमीकंडक्टर सुरक्षात्मक कोटिंग के साथ कोट विंदुक युक्तियाँ एक मानक प्रक्रिया 9 के अनुसार, .
धीरे प्रयोग से पहले pipettes आग पॉलिश.
4. पैच दबाना सेटअप तैयार
कॉन्फ़िगर और सॉफ्टवेयर में अपने प्रवर्धक पैच दबाना नियंत्रित gigaseal गठन के लिए मैक्रोज़ को बचाने के लिए. हम एक EPC-10 Windows XP और डाटा अधिग्रहण के लिए पल्स सॉफ्टवेयर द्वारा समर्थित एम्पलीफायर का उपयोग करें. हम "सेट अप" सेट, पुस्तिका ईपीसी-10 के अनुसार "पर सेल", और "पूरे सेल" मैक्रोज़ और उन्हें सभी प्रयोगों के लिए उपयोग.
प्रयोग करने के लिए पहले स्नान समाधान और विंदुक तालिका 1 में सूचीबद्ध समाधान तैयार है और 4 ° C में उन्हें 1 सप्ताह के लिए दुकान.
रसायन
स्नान समाधान (मिमी)
पिपेट समाधान (मिमी)
# 1
# 2
# 3
CH 3 अतः ना 3
130
110
125
-
NaCl
2
4
5
-
Ca (OH) 2
-
20
-
-
2 MgCl
3
1
-
5
4 MgSO
-
-
-
2
HEPES
10
10
10
15
HEDTA
-
10
-
EDTA
-
-
1
-
CS-spartate
-
-
-
125
BAPTA
-
-
-
12
ग्लूकोज़
10
10
10
-
तालिका 1. पूरे सेल CARC वर्तमान रिकॉर्डिंग के लिए समाधान .
सभी रसायनों सिग्मा Aldrich, सेंट लुइस, MO से खरीदे गए थे.
पैच विंदुक समाधान और प्रत्येक स्नान 10 समाधान के बीच तरल जंक्शन क्षमता (LJ) निर्धारित करते हैं . LJ मूल्य उपयुक्त जगह में अपने अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सहेजें. उदाहरण के लिए, पल्स कार्यक्रम में "प्रवर्धक" विंडो में "LJ" नियंत्रण में LJ मान सम्मिलित हैं.
कॉन्फ़िगर और उत्तेजना प्रोटोकॉल, प्रयोगों से पहले अपने अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के उपयुक्त स्थान के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है, बचाने के लिए. पल्स कार्यक्रम में, हम "पल्स पीढ़ी" विंडो में अधिग्रहण प्रोटोकॉल सेट. चित्रा 1. उत्तेजना प्रोटोकॉल -120 से अवधि में 50 एमएस के 100 mV वोल्ट रैंप हर 0.2 लागू किया जाता है - 2 (5 - 0,5 हर्ट्ज). रैंप के बीच होल्डिंग क्षमता (वी घंटे) 30 mV पर बनाए रखा है.
5. माइक्रोस्कोप स्टेज पर बढ़ते कक्ष
पाली - एल Lysine के साथ ~ 20 मिनट और एच 2 हे के साथ धोने और फिर कोशिकाओं चढ़ाना से पहले हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के साथ के लिए रिकॉर्डिंग कक्षों कोट.
सेल निलंबन की प्लेट 500 μL 0.2-0.5 x10 6 कोशिकाओं से युक्त कक्ष और 20 मिनट के लिए सेते में 37 डिग्री सेल्सियस
एक कक्ष धारक में संलग्न कोशिकाओं के साथ रिकॉर्डिंग कक्ष सुरक्षित. हम एक कस्टम कक्ष धारक, जहां आधार coverslip के नीचे का समर्थन करता है जबकि शीर्ष भाग coverslip के शीर्ष के खिलाफ धीरे प्रेस. का उपयोग करें
उलटा माइक्रोस्कोप के मंच पर चैम्बर धारक रखें.
प्रेषित प्रकाश में कोशिकाओं पर ध्यान दें. हम एक 40x तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करें.
स्नान में संदर्भ / एजी AgCl इलेक्ट्रोड रखें.
Multibarrel, गुरुत्वाकर्षण संचालित छिड़काव प्रणाली संरेखित करें. अंतर्वाह ट्यूब की टिप एक 45 ° कोण पर coverslip देखने के क्षेत्र के लिए बंद करने के लिए रखा जाना चाहिए.
चूषण ट्यूब अंतर्वाह ट्यूब की टिप करने के लिए विपरीत स्थिति.
साथ चैम्बर Perfuse फॉस्फेट बफर (पीबीएस) खारा या HBSS दूर धोने के लिए सेल संस्कृति मीडिया और शिथिल संलग्न कोशिकाओं.
6. CRAC चैनल धाराओं रिकॉर्डिंग
खोजें एक सेल है कि मजबूती coverslip से जुड़ा हुआ है. हम आम तौर पर एक औसत आकार, एक चिकनी बाहरी सतह के साथ दौर कक्ष का चयन करें.
+ मुक्त, 3 मिमी 2 मिलीग्राम + युक्त स्नान # (1 टेबल) 1 8-10 SERCA पंप ब्लॉक मिनट के लिए 0.5-1 सुक्ष्ममापी thapsigargin युक्त समाधान 2 Ca के साथ रिकार्डिंग कक्ष Perfuse. हम इस कदम दुकान gigaseal गठन के लिए पहले खलाना प्रदर्शन करते हैं.
एक Eppendorf microloader और एक पी 20-विस्थापन विंदुक का प्रयोग, पैच विंदुक विंदुक समाधान (तालिका 1) के साथ भरने और प्रवर्धक headstage पर विंदुक धारक में पैच विंदुक सम्मिलित. Ca 2 + chelator BAPTA विंदुक समाधान में शामिल है निष्क्रिय स्टोर व्यय करना और + निर्भर CRAC चैनल निष्क्रियता 2 Ca कम.
स्नान में प्रवेश करने से पहले पैच विंदुक के अंदर सकारात्मक दबाव (एच 2 हे ~ 3 इंच) की एक छोटी राशि लागू करें. हम एक कस्टम बनाया दबाव चूषण दबाव हवा और वैक्यूम लाइनों के लिए एक पैच विंदुक के अंदर सकारात्मक या नकारात्मक दबाव बनाने के लिए जुड़े डिवाइस का उपयोग करें.
माइक्रोस्कोप के माध्यम से दृश्य नियंत्रण के तहत स्नान में कम पैच विंदुक. "आस्टसीलस्कप" विंडो में, आप एक विंदुक के माध्यम से बह वर्तमान देखना चाहिए. वर्तमान आयाम में एक परिवर्तन कदम की तरह एक छोटे आयाम वोल्टेज पल्स (नाड़ी परीक्षण) पूर्व निर्धारित मैक्रो द्वारा लागू द्वारा प्रेरित किया जाना चाहिए. इस समय, आप विंदुक प्रतिरोध का मूल्य निर्धारित करने में सक्षम होना चाहिए. हमारे pipettes के प्रतिरोध आमतौर पर 5-6 MΩ.
"ओफ़्सेट" विंदुक और संदर्भ इलेक्ट्रोड के बीच उत्पन्न संभावित सही.
माइक्रोस्कोप के माध्यम से दृश्य नियंत्रण के तहत, पिपेट टिप सेल करने के लिए करीब लाने के लिए जब तक यह छू कोशिका झिल्ली.
पैच विंदुक (एच 2 हे की 20-40 इंच) के अंदर नकारात्मक दबाव लागू करें .
"आस्टसीलस्कप" खिड़की में gigaseal गठन मॉनिटर. तुम वर्तमान के आयाम, परीक्षण नाड़ी, घट जाती है और> GΩ 5 प्रतिरोध बढ़ जाती है विंदुक के मूल्य द्वारा प्रेरित देखेंगे. एक फ़े के भीतर आमतौर पर gigaseal रूपोंw सेकंड, लेकिन यह 1-2 मिनट ले के लिए एक स्थिर gigaseal हासिल कर सकते हैं.
विंदुक समाई ("सी - फास्ट") के लिए क्षतिपूर्ति.
अतिरिक्त नकारात्मक एक 20 सीसी सिरिंज का उपयोग कर दबाव लागू करके पैच झिल्ली तोड़.
होल्डिंग 30 mV के लिए संभावित सेट. एक सकारात्मक होल्डिंग क्षमता के लिए कैल्शियम पर निर्भर CRAC चैनल निष्क्रियता को रोकने में मदद करता है.
सेल की झिल्ली समाई ("सी धीमी गति से") के लिए क्षतिपूर्ति, बचाने के लिए या सी धीमी मूल्य रिकॉर्ड.
उपयोग प्रतिरोध "आर" मूल्य की जाँच करें. हमारे प्रयोगों में, आर एस आम तौर पर 7-20 MΩ.
+ मुक्त मिमी 3 मिलीग्राम 2 स्नान + युक्त समाधान # 1 2 Ca में 0.5 हर्ट्ज की एक आवृत्ति (चित्रा 1) के साथ वोल्टेज रैंप की एक श्रृंखला को लागू करने के लिए शुरू करो. इस समाधान में, CRAC वर्तमान negligibly छोटे है के रूप में "लीक" 2 मिलीग्राम + के लिए CRAC चैनलों के गरीब पारगम्यता के कारण वर्तमान के साथ तुलना. सहेजें और वर्तमान भविष्य के विश्लेषण में स्नान समाधान # 1 में "लीक" धाराओं के रूप में दर्ज निशान का उपयोग करें. -100 एम वी में "लीक" वर्तमान के पूर्ण आयाम से कम या 5 फिलीस्तीनी अथॉरिटी के लिए बराबर होना चाहिए. यदि कक्ष "टपका हुआ" है, और एक नया पैच विंदुक और एक नया सेल का उपयोग पर प्रयोग शुरू करना बंद करो.
CRAC (मैं Ca - CRAC) चैनलों के माध्यम से Ca 2 + वर्तमान रिकॉर्ड करने के लिए, 20 मिमी 2 + युक्त स्नान समाधान Ca 2 # (तालिका 1) के साथ छिड़काव वाल्व स्विचन द्वारा 2 + मुक्त 3 मिमी 2 मिलीग्राम स्नान + युक्त समाधान CA # 1 की जगह. यह Ca के लिए 2 + CRAC चैनलों के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देता है और एक आवक वर्तमान उत्पादन . "आस्टसीलस्कप" विंडो में, आप भीतर मैं Ca CRAC (चित्रा 2) सुधार के विकास देखेंगे. नकारात्मक voltages पर वर्तमान आयाम के बारे में 1 2 CRAC वर्तमान + निर्भर potentiation Ca के कारण मिनट के लिए वृद्धि जारी रहेगी.
5 हर्ट्ज, जो CRAC चैनलों के माध्यम से क्षणिक + ना मौजूदा रिकॉर्ड के लिए आवश्यक है के लिए वोल्टेज रैंप के साथ उत्तेजना की आवृत्ति बढ़ाएँ.
बदलें 20 मिमी 2 Ca + युक्त ना + युक्त द्विसंयोजक कटियन मुक्त समाधान # 3 (तालिका 1) के साथ # 2 छिड़काव वाल्व स्विचन द्वारा स्नान समाधान . "आस्टसीलस्कप" विंडो में, तुम बड़े आयाम की एक क्षणिक विकास के भीतर ना सुधार देखने + CRAC चैनल (ना CRAC मैं, चित्रा 2) के माध्यम से होगा मौजूदा.
एक 20 मिमी 2 + युक्त स्नान समाधान # 2 "लीक" वर्तमान अभिलेख प्रयोग के अंत में 1-5 ला + 3 सुक्ष्ममापी युक्त Ca लागू हो सकते हैं. हालांकि, हम इस दृष्टिकोण क्योंकि समय के साथ "लीक" वर्तमान परिवर्तनों उपयोगी नहीं मिल रहा था और यह बड़े या छोटे प्रयोग के अंत में हो सकता है. हम 2 CA में दर्ज वर्तमान + मुक्त मिमी 3 मिलीग्राम 2 + युक्त एक "लीक" वर्तमान के रूप में प्रयोग की शुरुआत में स्नान समाधान # 1. लेना पसंद करते हैं
आगे के विश्लेषण के लिए दर्ज वर्तमान निशान सहेजें.
7. डेटा विश्लेषण
विश्लेषण सॉफ्टवेयर में बचाया मौजूदा रिकॉर्ड पुनर्प्राप्त करें. हम विश्लेषण के लिए पल्स कार्यक्रम का उपयोग करें.
शुरुआत में और वोल्टेज रैंप के अंत में वर्तमान आयाम उपाय. हम आम तौर पर एम वी -100 और 100 mV पल्स कार्यक्रम के "आस्टसीलस्कप" विंडो में कर्सर के जोड़े का उपयोग वर्तमान आयाम उपाय.
वर्तमान amplitudes के मूल्यों को आगे के विश्लेषण और चित्रमय प्रस्तुति के लिए एक ग्राफिक प्रोग्राम में निर्यात. हम उत्पत्ति वैज्ञानिक रेखांकन और विश्लेषण सॉफ्टवेयर, संस्करण 7 का उपयोग करें.
8. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 2. एक आराम मानव टी सेल में CRAC धाराओं (ए), CRAC -100 (भरा हलकों) एम वी और 100 mV (खुला हलकों) में पूरे सेल वोल्टेज दबाना विन्यास में दर्ज धाराओं के समय पाठ्यक्रम. Gigaseal गठन से पहले, कक्ष ~ 10 मिनट के लिए 2 CA में preincubated था + मुक्त मिमी 3 मिलीग्राम 2 + युक्त स्नान समाधान # 1 0.5 सुक्ष्ममापी thapsigargin युक्त. तोड़ने के बाद, स्नान समाधान sequentially निम्नानुसार लागू किया गया: 2 Ca + मुक्त 3 मिमी 2 + युक्त स्नान समाधान # 1 (0 Ca + 3 मिलीग्राम), 20 मिमी से 2 Ca स्नान + युक्त समाधान # 2 का पालन मिलीग्राम (20 Ca), द्विसंयोजक मुक्त स्नान समाधान - कटियन # 3 (DVF), स्नान समाधान # 2 (20 सीए) द्वारा पीछा द्वारा पीछा किया. कक्ष वोल्टेज के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है रैंप के एक श्रृंखला के साथ प्रेरित किया गया था. रैंप की आवृत्ति में 5 स्नान समाधान # (DVF) 3 और अन्य सभी समाधान में 0.5 हर्ट्ज हर्ट्ज था. नोट: 20 मिमी Ca 2 + युक्त स्नान समाधान # 2 और DVF स्नान समाधान # 3 में तेजी से मैं ना - CRAC क्षणिक विकास के आवेदन के बाद मैं CA-CRAC की धीमी विकास . (बी), प्रतिनिधि वर्तमान निशान 2 CA में वोल्टेज रैंप के दौरान + मुक्त 3 मिमी मिलीग्राम 2 स्नान + युक्त समाधान # (1 दर्ज"रिसाव"), 20 मिमी 2 Ca + स्नान समाधान युक्त # 2 (20 Ca), स्नान और समाधान # 3 (DVF). (सी, डी), मैं (सी)Ca CRAC और ना CRAC मैं (डी) के वर्तमान वोल्टेज रिश्तों को "लीक" वोल्टेज रैंप के दौरान 20 मिमी में 2 स्नान + युक्त Ca दर्ज धाराओं से वर्तमान subtracting द्वारा प्राप्त # 2 (20 Ca), स्नान और समाधान # (DVF) 3 पैनल में दिखाया गया है (बी) समाधान.
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मानव टी कोशिकाओं के आराम में CRAC धाराओं के electrophysiological जांच एक चुनौतीपूर्ण कार्य है क्योंकि इन कोशिकाओं में अंतर्जात CRAC वर्तमान आयाम छोटे छोटे सेल आकार (आराम मानव टी सेल व्यास 5-8 सुक्ष्ममापी की रेंज में है) के कारण है. यहाँ, हम एक कदम दर कदम प्रक्रिया को मज़बूती से आराम मानव टी परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear से अलग लिम्फोसाइटों में CRAC धाराओं रिकॉर्ड मौजूद हैं. यह तकनीक हमारे शरीर विज्ञान और आराम टी कोशिकाओं में CRAC चैनलों के कार्यात्मक अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए बेहतर सामान्य और रोग प्रतिरक्षा सेल प्रतिक्रिया की प्रकृति को समझने के लिए अनुमति देता है. इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, एक मानव टी कोशिकाओं के रूप में सक्रिय मानव टी कोशिकाओं, monocytes, और मैक्रोफेज के रूप में अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं में अच्छी तरह से आराम में CRAC धाराओं उपाय कर सकते हैं.
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हम सुविधाओं और आयन चैनल के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट वातावरण के साथ हमें प्रदान करने के लिए फिजियोलॉजी और झिल्ली जीवविज्ञान, विश्वविद्यालय कैलिफोर्निया डेविस विभाग के लिए आभारी हैं.
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Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch (2010).
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