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 JoVE Biology

Respirometric皂甙通透心脏纤维的氧化磷酸化的评估

1, 1,2, 2, 1,2

1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Medicine, University of Calgary, 2Faculty of Kinesiology, University of Calgary

Article
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    Summary

    皂甙与respirometric氧化磷酸化的分析,结合通透的纤维制备提供了线粒体功能的综合评估。线粒体呼吸在生理和病理状态下,可以反映不同监管规定的影响,包括线粒体相互作用,形态和生物化学。

    Date Published: 2/28/2011, Issue 48; doi: 10.3791/2431

    Cite this Article

    Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers. J. Vis. Exp. (48), e2431, doi:10.3791/2431 (2011).

    Abstract

    线粒体参与能量代谢,氧化应激,细胞凋亡,延缓衰老,线粒体encephalomyopathies和药物毒性,线粒体功能的调查代表心脏生理学的一个重要参数。鉴于此,技术来衡量心脏线粒体功能的需求。一项技术,它采用一种综合的方法来衡量线粒体的功能是respirometric氧化磷酸化(OXPHOS)分析。

    respirometric OXPHOS评估的原则是围绕利用克拉克电极测量氧气浓度。通透的纤维束消耗氧气,氧气浓度在封闭腔下降。使用选择底物抑制剂 - 解偶联剂滴定协议,电子提供电子传递链的特定网站,使线粒体功能的评价。之前线粒体功能的respirometric分析,机械和化学的筹备技术是利用通透肌纤维肌膜。化学通透采用皂素,在保持细胞结构的同时,有选择性的细胞膜穿孔。

    本文深入介绍了在准备测量耗氧量的皂素皮肤的心脏纤维,以评估线粒体OXPHOS所涉及的步骤。此外,故障排除建议以及具体的基板,可用于确定在特定网站的电子传递链的线粒体功能抑制剂和uncouplers提供。重要的是,所描述的协议可能很容易地应用到各种动物模型和人体样本的心脏和骨骼组织。

    Protocol

    1。试剂准备

    1. 1稍作修改,准备放松和保存液(RP解决方案) 。简言之,RP解决方案包括2.77mM CAK 2 EGTA,7.23mM K 2 EGTA,20MM咪唑,0.5mm的二硫苏糖醇,牛磺酸20MM,50MM的K - MES,6.56氯化镁2,5.7mM三磷酸腺苷,磷酸肌酸14.3mM,pH值7.1调整,在室温(RT)。通过0.45微米的过滤器进行消毒过滤的解决方案。分成15毫升的部分(猎鹰聚丙烯管)保存在-20 ° C配方的讨论。
    2. 线粒体Respirometry解决方案(MiR05)准备,正如先前所描述 2含有EGTA 0.5MM,3MM 氯化镁2 .6 H 2 O,牛磺酸20MM,10MM KH 2 PO 4,20MM的HEPES,为1g / L BSA,钾乳糖60MM, 110MM蔗糖,pH值7.1,调整为30 ° C。通过0.45微米的过滤器进行消毒过滤的解决方案。在-20 ° C到50毫升的部分(猎鹰聚丙烯管)和存储的鸿沟见配方的讨论。 MiR05氧气溶解度的因素,在30 ° C和37 ° C为0.92 3 。

    2。组织准备

    A.心脏纤维机械准备

    1. 由卡尔加里动物保健大学和程序批准使用委员会和遵守加拿大的实验室动物科学实验的准则协会。
    2. 颈椎脱位固定的鼠标是首选的方法。另外,intraperotineal(IP)或戊巴比妥钠注射氯胺酮和甲苯噻嗪(80和10mg/kg的,分别)0.5mg/kg可管理。注:戊巴比妥钠是一种可逆抑制剂NADH脱氢酶(复杂)4。
    3. 取出心脏,置于培养皿,培养皿中含有冰(图1A)的RP解决方案。小心地取出任何结缔组织和/或脂肪使用解剖镜下。
    4. 切沿隔了一半的心。海关10 - 25毫克的湿重(WW)的组织切割,从左心室心内膜表面(图1B)。确保切口是沿纤维方向,以尽量减少机械损伤心肌。
    5. 放置在一个单独的含冰RP解决方案的培养皿盘的解剖组织,子样本。使用解剖镜下切开成纵向条沿纤维方向的心脏,​​一个直径为1 - 1.5MM。
    6. 缩短与手术刀一个长度为2 - 4MM(图1C)条。
    7. 使用格外小心,锋利的钳机械单独的纤维束。最后的纤维束应该包含最多的6-8纤维,通过小面积的联系连接,重量不超过5毫克WW。 1 - 3mg的WW心脏纤维建议。从外观上看,心肌组织应该改变,从原来的红色,淡粉色着色(图1D)。

    B.心脏纤维束化学制剂

    1. 将12孔板上冰。
    2. RP的解决方案,以尽量减少钙的污染5冲洗以及(S)。
    3. 机械准备的纤维束传输到一个含有3ml的冰冷的RP 50ug /毫升皂素的解决方案。注:皂素含量不依赖于解决方案中的心肌目前量。
    4. 在冰上温和搅拌孵育20分钟。

    C.心脏纤维束洗涤

    1. 冲洗与MiR05新井,以尽量减少钙污染5。
    2. 心脏束传输新井含10ML冰冷MiR05。在冰上温和搅拌孵育10分钟。
    3. 重复(1-2)与新鲜MiR05 2-3倍。重复洗涤步骤,以确保拆除或皂甙,三磷酸腺苷,ADP和纤维束的任何剩余的基板。

    D.湿重测定

    1. 前直接呼吸分析,湿重是通过印迹上吸水的表面,使用镊子(滤纸)个人的纤维束(1 - 3mg的WW),5S的纤维表面,直到所有的水分是远离邪恶。
    2. 使用另一个吸水的表面,除去多余的液体从钳。
    3. 皮的规模,并放在一个塑料纤维束的重量质量测量的船。
    4. 心脏纤维束传输到一个新的井用冰冷MiR05。纤维束是准备氧气消耗评估。

    3。 Respirometric OXPHOS分析

    A. Respirometric设备

    1. 该实验室采用,并建议两腔的滴定注射oxygraph(Oroboros,Oroboros仪器Oxygraph2 - K)。 Oxygraph 2 - K提供高利用仪器的硬件和软件(DatLab),最大限度地减少器乐背景在很大程度上有助于决议respirometry耗氧量的文物。
    2. 校准oxygraph是一个必不可少的步骤,以尽量减少仪器耗氧量的混杂影响。校准变化上oxygraph略有不同。参考oxygraph用户手册的具体程序。

    B.代表质量控制/技术验证协议

    1. 确保MiR05已被添加到oxygraph商会住房极谱氧传感器(POS)和空气饱和度和平衡的MiR05,给予足够的时间在37 ° C之前,把oxygraph商会鼠心脏纤维。
    2. 心脏纤维样本被放置在oxygraph商会激起MiR05。注意:确保搅拌棒聚偏氟乙烯或PEEK涂层的搅拌棒(直径6mm)。
    3. 使用氧气充式注射器,增加氧气浓度为250 - 550uM oxygraph商会。应该指出,限制甚至50%空气饱和度6以上透纤维制剂的氧气浓度。允许氧气浓度稳定5-10分钟。
    4. 使用一个25μL汉密尔顿microsyringe,加入10μL2M谷氨酸和800mm的苹果酸5μL获得终浓度分别为10mm和2mm。这些滴定允许基底复杂我支持呼吸(国家2;缺乏的ADP)的决心。氧气通量应稳定在大约5分钟滴定。应该提供适当的准备非常重复性的状态2耗氧量。
    5. 稳定的氧气消耗2 - 5分钟,加入终浓度为5MM(饱和)500MM的ADP20μL,使用一个25μL汉密尔顿microsyringe最大(状态3)线粒体呼吸,通过复杂的一些研究使用的浓度高ADP的,然而,重要的是要注意,只在5MM 7以上的浓度达到饱和度大于90 %。
    6. 稳定的氧气消耗2 - 5分钟,加4mm的细胞色素c5μL获得的终浓度为10μM,一个10μL汉密尔顿microsyringe,使用线粒体外膜(OMM)完整的质量控制分析。
    7. 稳定的氧气消耗2 - 5分钟,加4毫克/毫升寡1μL,使用10μL汉密尔顿microsyringe,抑制ATP合酶。这滴定步骤将提供内线粒体膜完整性的验证。
    8. respirometric OXPHOS评估。保留样本干重或线粒体标记决心。
    9. 删除oxygraph玻璃商会MiR05。 (DDH 2),用蒸馏水洗净,分庭至少三次。
    10. 洗净商会与100%的乙醇(酒精)去除乙醇水溶性抑制剂,如寡至少三次。
    11. 与最后的70%乙醇洗涤商会洗持久30分钟消毒oxygraph商会与70%乙醇三次。
    12. MiR05除了为新的实验滴定协议之前确保商会含有的POS DDH 2 O冲洗至少5倍
    13. 可能会变成一个精心策划的滴定的respirometry研究实验和诊断的目的而定的协议包括验证滴定法可作为一个单独的协议(图2)或滴定。

    4。代表性的成果:

    在适当的准备小鼠心脏纤维耗氧量是评价质量控制协议,如在图2所示。图3-5提供了不正确准备的心脏纤维经常遇到的例子。呼吸控制率(RCR)在respirometry的一个重要指标。此参数表明氧耗和氧化磷酸化之间的耦合。在通透的纤维准备工作,RCR是呼吸的状态3相对过剩状态4到状态2或者状态3寡和/或苍术苷,ATR诱导率。此外,RCR可以用来作为一种质量保证标志,并能识别的耦合变化,从实验或病理干预造成5。那么加上通透小鼠心脏的准备产生一个3-6之间的RCR取决于孵化解决方案, 利用1,8,9

    细胞色素C的滴定是用来作为一个适当的组织准备工作的验证。细胞色素c是一种蛋白质在intermembrane空间位于线粒体内膜10。当线粒体外膜是否完好,内源性细胞色素c在intermembrane空间和外源性细胞色素c的滴定对呼吸的影响甚微(图2)。如果线粒体外膜被破坏,内源性细胞色素c可以从intermembrane空间释放,并会抑制呼吸到外源性色素此外彗星(图3)。适当的准备经验,只有在氧气通量的细胞色素c在5-15% 范围 5除了轻微升高。此外,本实验滴定允许病理或实验应激对线粒体外膜完好的影响评估。如果一个细胞色素c的作用是经验丰富,确保在机械的组织和/或降低皂甙浓度准备。

    寡和/或ATR此外是用来评估泄漏呼吸的改变,氧的消耗,促进ADP 磷酸 11 。此外,该滴定步骤可以用来作为一个适当的样品制备的验证。控制或野生型纤维应敏感,这除了和经验,在氧气通量的显着减少。低RCR和寡和/或ATR在一个相对升高的氧气通量的敏感性降低,表明在制备过程中的内在线粒体膜(图4)损坏。的损害可能是诱发在机械分离的心肌纤维内线粒体膜是皂素相对不太容易受到侮辱,线粒体外膜。然而,机械和化学制剂可能会作相应的调整,以避免不当准备心脏纤维5,12

    ,从小鼠的皂素皮肤纤维束不应停留超过2h,6h以上或MiR05解决方案中的RP解决方案。缺乏反应底物抑制剂 - 解偶联剂在图5可以看出滴定,可指示潜伏期延长。随后的努力应尽量减少动物牺牲和氧气消耗测量之间的时期。

    图1
    图1。小鼠心脏纤维束机械的准备。答:对整个心脏紧随剥离。 B.一个10 - 25毫克样品前左心室。 C.心肌组织分为1mm直径2 - 4mm的长条状。 D.最后心脏纤维束,准备与皂甙的化学通透。

    图2
    图2。适当的组织的代表准备利用极谱评估结果。状态2氧气通量是通过复杂的I基板谷氨酸和苹果酸(M / G)和支持是显着刺激的ADP(状态3)此外。无刺激作用外源性细胞色素c除了表明线粒体外膜完好。氧耗的灵敏度,以寡表明线粒体膜的完整性是否完好。氧浓度在2毫升封闭室是确定的蓝线。在2毫升封闭腔心脏组织样本耗氧量的红线代表。苹果酸和谷氨酸,M / G,二磷酸腺苷,ADP公司; CYTO彗星细胞色素C,寡,岛

    图3
    图3。细胞色素c的效果验证测试利用极谱评估。状态2氧气通量是通过复杂的I基板谷氨酸和苹果酸(M / G)和支持是显着刺激的ADP(状态3)此外。外源性细胞色素c除了刺激的效果表明线粒体外膜的完整性被破坏。氧浓度在2毫升封闭室是确定的蓝线。在2毫升封闭腔心脏组织样本耗氧量的红线代表。 M / G二磷酸腺苷,ADP,细胞色素C,苹果酸和谷氨酸,CYTO C.

    图4
    图4内线粒体膜的完整性验证测试,利用极谱评估。状态2氧气通量支持复杂我基板谷氨酸和苹果酸(M / G)和一个氧的消耗相对较弱的刺激,此外,ADP(状态3)。敏感性差,消耗氧气寡内线粒体膜损坏。氧浓度在2毫升封闭室是确定的蓝线。在2毫升封闭腔心脏组织样本耗氧量的红线代表。苹果酸和谷氨酸,M / G;二磷酸腺苷,ADP寡,O。

    图5
    图5。极谱评估MiR05延长潜伏期。耗氧量是不敏感的ADP除了外生此外,谷氨酸和苹果酸(M / G)和氧耗(状态3)减少。外源性细胞色素c此外,麻木不仁的耗氧量,以寡没有刺激作用的经验。缺乏应对extramitochondrial洗液增加,表明线粒体功能稳定受到损害。氧浓度在2毫升封闭室是确定的蓝线。在2毫升封闭腔心脏组织样本耗氧量的红线代表。 M / G二磷酸腺苷,ADP,细胞色素C,苹果酸和谷氨酸,CYTO C.

    1。注:试剂准备
    K 2 EGTA 100MM储备溶液的制备

    试剂名称 终浓度(毫米) g/100 mL的H 2 O
    乙二醇双(2 - aminoethylether) - N,N,N',N“ -四乙酸(EGTA) 100 3.805
    氢氧化钾(KOH) 200 1.15

    注意:在室温调节pH至7.4。

    制备的Ca 2 EGTA 100mm的联合解决方案

    试剂名称 终浓度(毫米) g/100 mL的H 2 O 评论(可选)
    乙二醇双(2 - aminoethylether) - N,N,N',N“ -四乙酸(EGTA) 100 3.805 加热至80 ° C,轻度搅拌。
    碳酸钙( 碳酸钙 100 1.001 钙调节各种细胞器的功能,包括线粒体钙浓度必须精确。确保完成所有碳酸钙的增溶。最终的解决方案必须是完全透明的。 碳酸钙是最初与EGTA和一些水混合,以激活形成的碳酸二氧化碳蒸发。这种反应可能会加速升温至80 ° C。
    氢氧化钾(KOH) 200 1.15 用KOH中的CO 2蒸发完成后。

    注意:在室温调节pH至7.4。

    松弛的制备和保存液(RP的解决方案 1

    试剂终浓度(毫米) 每公升评论
    K 2 EGTA 7.23 72.3毫升
    CAK 2 EGTA 2.77 27.7毫升
    咪唑 20 1.36克
    二硫苏糖醇 0.5
    牛磺酸 20 2.52克
    腺苷二钠水合物5' -三磷酸(ATP) 5.7 3.14克
    磷酸肌酸(PCr) 14.3 4.0克
    氯化镁(MgCl 2的 6.56 0.624克
    K - MES 50 14.0克

    注意:在室温下的pH值调整至7.1

    制备线粒体Respirometry解决方案(MiR05解决方案)2

    试剂终浓度(毫米) 每公升评论(可选)
    乙二醇双(2 - aminoethylether) - N,N,N',N“ -四乙酸(EGTA) 0.5 0.190克作为一个钙螯合剂
    镁氯化(氯化镁2 .6 H 2 O) 3.0 0.610克纤维制备的质量不能无Mg 2 +的测试。
    牛磺酸 20.0 2.502克牛磺酸是一种膜稳定剂和抗氧化剂。 20MM是细胞内的浓度在心里。
    磷酸二氢钾(KH 2 PO 4) 10.0 1.361克
    20.0 4.77克
    - 乳糖酸钾 60.0 120毫升0.5米
    K -乳糖
    股票
    0.5M的K -乳糖股:35.83克乳糖酸100毫升H 2 O和pH值在室温下7.0。音量调整到200毫升DDH 2 O。用于复制的细 ​​胞内K +浓度。然而,此前使用的是氯化钾,高CL -抑制线粒体肌酸激酶的功能。
    蔗糖 110.0 37.65克作为一种活性氧清除剂使用。
    牛血清白蛋白(BSA) 1克/升 1克作为一种膜稳定剂,抗氧化剂,钙和游离脂肪酸的螯合剂。

    注:在30 ° C调整pH值至7.1

    3。注:Respirometric OXPHOS分析
    B.选择基板,uncouplers和抑制剂

    线粒体Respirometry分析选定的衬底名单

    基板 [股票] 制备音量每2毫升 [决赛] 评论
    腺苷5' -二磷酸钾盐二水(ADP) 500MM 246mg /毫升DDH 2 O。在室温调节pH至7.1。彗星在250μL分装储存在-80 °。 20ul 5MM 为了保持常数Mg 2 +的 +在respirometry实验中添加0.6 MOL 氯化镁 2 / MOL ADP公司。
    抗坏血酸 800MM 0.1584克/毫升DDH 2 O。商店在200μL分装于-20 ° C。对光敏感 5微升 2MM 为底物,与TMPD平行使用时的行为。必须正确自动氧化的氧气通量。
    细胞色素C 4MM 50毫克/毫升DDH 2 O。商店在250μL分装于-20 ° C。 5微升 10UM
    羰基氰化物
    P -(三氟甲氧基)
    苯腙(FCCP)
    0.1MM 0.254mg/10 mL 100%的乙醇。 500μL分装在玻璃瓶存放在-20 ° C。 1μL的步骤作为一个解偶联剂。确定最大的电子传输能力和磷酸化系统的电子传输的任何限制。
    谷氨酸 2M 0.3742克/毫升DDH 2 O。在室温调节pH至7.1。商店在250μL分装于-20 ° C。 10ul 10MM NADH脱氢酶的底物的行为(复杂)。
    马拉特 800MM 0.1073克/毫升DDH 2 O。在室温调节pH至7.1。商店在250μL分装于-20 ° C。 5ul 2MM NADH脱氢酶的底物的行为(复杂)。不能支持单独呼吸。
    丙酮酸 1M 11mg/0.1毫升DDH 2 O。准备好新鲜。 5微升 2.5MM NADH脱氢酶的底物的行为(复杂)。
    琥珀酸 1000MM 1.3505克/ 5毫升DDH 2 O。在室温调节pH至7.1。商店在250μL分装于-20 ° C。 20ul 10MM 琥珀酸脱氢酶(复合物Ⅱ)作为基板的行为。
    N,N,N',N' -四甲基
    pphenylenediamine
    盐酸(TMPD)
    200MM 47.1mg /毫升DDH 2 O。加入终浓度为10mm 0.8M的抗坏血酸,以防止自动氧化,在200μL,分装保存于-20 ° C。 5微升 0.5MM 自氧化的蓝色色素的外观明显的股票解决方案。为底物,与TMPD平行使用时的行为。必须正确自动氧化的氧气通量。

    线粒体Respirometry分析选定的抑制剂名单

    基板 [股票] 制备卷,每2毫升会所 [决赛] 评论
    抗霉素A 5MM 27.4mg/10 mL 100%的乙醇。商店在250μL分装于-20 ° C。 1微升 2.5μM 辅酶Q:细胞色素 c还原酶抑制剂(综合三)</ TD>
    苍术苷 50MM 40毫克/毫升DDH 2 O。商店在250μL分装于-20 ° C。 30μL 0.75 ATP合酶的抑制剂。
    4毫克/ mL的 4毫克/毫升100%的乙醇。商店在200μL分装于-20 ° C。 1微升 ATP合酶的抑制剂。
    氰化钾 1M 65.1mg /毫升DDH 2 O。准备好新鲜。在室温下调整pH值至7.1 1微升 1MM 细胞色素 C氧化酶抑制剂(复杂四) 。利用以下TMPD和抗坏血酸滴定访问自氧化。
    鱼藤酮 0.1MM 0.39mg/10 mL 100%的乙醇。商店在250μL分装于-20 ° C。光敏感。 1微升 0.05μM NADH脱氢酶抑制剂(复杂)。然而,可能需要较高浓度,商会,以减少鱼藤酮保留开始概述。

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    Discussion

    皂甙通透的心脏纤维技术,提供了一个独特的妥协之间在体外和体内线粒体OXPHOS耗氧量评估。这种技术的优点包括增加生理的相关性比较孤立的细胞结构线粒体被保留下来。虽然质膜降解,细胞内的膜结构,包括线粒体12,14,14肌质网, 丝和17的骨架1,保持不变。此外,线粒体和细胞骨架,17之间的相互作用也保持不变。透纤维线粒体增加稳定性。啮齿动物纤维的筹备工作,为6h和人类的纤维样本显示长达 24小时18,2的稳定,可以存储在冰冷保留地解决方案。线粒体的经验迅速洗液的平衡。这使得对特定网站的电子传递链的分析直接控制,在加入底物,抑制剂和uncouplers 1, 5。此外, 在原位技术,这需要一个组织只有几毫克。

    皂甙皮肤纤维技术的限制,不能被忽略。心脏线粒体是异构的,由两个亚群组成。肌膜和interfibrillar 原位线粒体respirometry评估没有能力区分亚群5线粒体的总人口。此外,各种细胞的代谢产物和细胞质因素调节线粒体的功能。这些胞质的心脏纤维组件都将丢失期间的通透性,导致无法在体内 环境 5中的确切评估线粒体的过程。

    报告问题是一个重要的问题。测量耗氧量可根据湿重或干重表示,然而,线粒体密度是每组织肿块7时,在呼吸通量异质性的主要因素。重要的是要明白,呼吸率和变化是很大的参考状态的选择影响的解释。 respirometric OXPHOS透纤维的结果进行直接比较,费率,必须表达了一个共同的参考标记,如线粒体DNA,柠檬酸合成酶的活性,细胞色素c氧化酶的活性,和/或细胞色素aa3含量19。

    总之,透纤维制备respirometry分析结合使用,使心脏线粒体的综合功能的评估。各种病理状态和遗传模型,利用这种技术。这些措施包括药物引起的毒性评价,老龄化,糖尿病,充血性心衰,缺血性损伤和氧化应激线粒体生理学5,20。几个优秀的皂甙通透的光纤技术和极谱氧的消耗评估的方法评价和手稿已经察看1,5,14,20和强烈推荐。

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    Disclosures

    没有利益冲突的声明。

    Acknowledgements

    这项研究是由加拿大卫生研究院和加拿大基因组研究所的支持。的JS从阿尔伯塔省遗产基金会加拿大的医学研究,心脏及中风基金会和加拿大糖尿病协会举行的薪水支持奖。实验室要感谢Oroboros仪器的技术援助,在通透的皂素纤维技术收购。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    100% Ethanol Fisher Scientific HC600
    70% Ethanol Fisher Scientific HC-1000
    Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) Sigma-Aldrich A5285
    Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free Sigma-Aldrich A-6003
    Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
    Ascobic acid Sigma-Aldrich A4403
    Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma-Aldrich A2383
    Atractyloside Sigma-Aldrich A6882
    Calcium carbonate Sigma-Aldrich C4830
    Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
    Cytochrome c Sigma-Aldrich C7752
    Digitonin Sigma-Aldrich D141
    Dithiothreitol Sigma-Aldrich D9779
    Ethylene glycol-bis-(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) Sigma-Aldrich E4378
    Glutamic acid Sigma-Aldrich 27647
    HEPES Sigma-Aldrich H4034
    Imidazole Sigma-Aldrich I5513
    Ketamine Pfizer Pharma GmbH Ketaset
    Lactobionic acid Sigma-Aldrich 153516
    Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M9272
    Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) Sigma-Aldrich M9272
    Malic acid Sigma-Aldrich M1000
    MES Sigma-Aldrich M3671
    N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) Sigma-Aldrich T3134
    Oligomycin Sigma-Aldrich O4876
    Phosphocreatine Sigma-Aldrich P7936
    Potassium Chloride Sigma-Aldrich P9541
    Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P5958
    Potassium cyanide Fluka 60178
    Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
    Rotenone Sigma-Aldrich R8875
    Saponin Sigma-Aldrich 47036
    Sodium Pentobarbital Ceva Sante Animale 1715 138 Conc. 54.7 mg/ml
    Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
    Succinic acid Sigma-Aldrich S3674
    Sucrose Sigma-Aldrich S7903
    Taurine Sigma-Aldrich T8691
    Xylazine Bayer AG Rompun
    ddH2O
    Ice
    Oroboros Oxygraph-2k Oroboros Instruments
    Kimwipes VWR international 21905-026
    15ml polypropylene centrifuge tubes VWR international 89004-368
    50ml polypropylene centrifuge tubes VWR international 89004-364
    Straight Jewelers Forceps George Tiemann & Co. 160-50B
    Curved Jewelers Forceps George Tiemann & Co. 160-57B
    Straight Surgery Scissors George Tiemann & Co. 105-402
    Sterile Surgical Blade VWR international BD371610
    0.45-μm Syringe filters VWR international CA28145-485
    pH meter VWR international CA11388-308
    Glass Petri dishes VWR international 89000-300
    12-well Polystyrene Tissue Culture Plates VWR international 82050-926
    Plate Stirrer VWR international 97042-594
    Fisherbrand Microbars Fisher Scientific 14-511-67
    Weigh Scale VWR international CA11278-162
    10μl Hamilton Micro Syringe Fisher Scientific 14-815-1
    25μl Hamilton Micro Syringe Fisher Scientific 14-824-7
    50μl Hamilton Micro Syringe Fisher Scientific 14-824-5
    Nalgene Squeeze Bottles Wilkem Scientific LNA2407-1000
    Polystyrene Weighing Dishes VWR international 89106-750
    Dissecting Microscope Olympus Corporation

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