Medición de las respuestas de luz circadianos y aguda en ratones con actividad rueda para correr

Abstract

Los ritmos circadianos son las funciones fisiológicas del ciclo que durante un período de aproximadamente 24 horas (circadiano-circa: aproximada y diem: día) ^{1, 2.} Ellos son los responsables de nuestro tiempo de sueño / los ciclos de vigilia y la secreción de la hormona. Desde este momento no es, precisamente, las 24 horas, se sincroniza con el día solar por la entrada de luz. Esto se logra a través de la entrada fótica desde la retina hasta el núcleo supraquiasmático (SCN), que actúa como el marcapasos principal sincronizar los relojes periféricos en otras regiones del cerebro y los tejidos periféricos al ciclo de luz oscuridad del medio ambiente ^7.3. La alineación de los ritmos del medio ambiente a este ciclo de luz oscuridad en particular organiza eventos fisiológicos en el nicho correcto temporal, que es crucial para la supervivencia ^8. Por ejemplo, los ratones duermen durante el día y son activos durante la noche. Esta capacidad de consolidar la actividad ya sea a la parte de la luz o la oscuridad del día se conoce como photoentrainment circadiano y requiere la entrada de luz al reloj circadiano ^9. La actividad de los ratones en la noche es particularmente robusto en presencia de una rueda para correr. La medición de este comportamiento es un método mínimamente invasivo que puede ser utilizado para evaluar la funcionalidad del sistema circadiano, así como la entrada de luz a este sistema. Los métodos que se cubren aquí se utilizan para examinar el reloj circadiano, la entrada de luz a este sistema, así como la influencia directa de la luz sobre el comportamiento de rueda para correr.

Protocol

1. Configuración del equipo

1. Preparación de los grupos de animales es muy importante cuando se crea cualquier experimento conductual. Para la actividad de rueda para correr, todos los ratones que ser hombres, emparejados por edad, y si es posible a partir de cruzamientos entre hermanos. Lo ideal sería que los ratones más jóvenes, de aproximadamente 3 meses de edad, se utilizan para la actividad de rueda para correr.
2. Antes de colocar los animales en las ruedas, la habitación tiene que estar completamente de configuración. Esto incluye la preparación de cada jaula con una rueda, una rueda de la revolución de la sonda, una pequeña cantidad de camas del ratón en la parte inferior de cada jaula y abundante comida y agua durante 2 semanas.
3. Iluminación de la habitación es muy importante, al establecer la rueda jaulas de funcionamiento es importante para medir la intensidad de la luz en cada jaula para verificar que usted está consiguiendo una iluminación uniforme en cada jaula. Además, al elegir una fuente de luz, busque uno con un amplio espectro que cubre 450 nm-650 nm. Muchas compañías ofrecen "luz día" o "espectro completo", bombillas fluorescentes, que cumplen este criterio. (Ver Figura 1)

2. Montaje del ensayo

1. En la introducción de los ratones de la jaula de rueda para correr, hacerlo en un ciclo de luz que se acerque el ciclo luz / oscuridad que se alojaron anteriormente con el.
2. Trate de distribuir uniformemente los ratones para garantizar un mejor medio ambiente similar para todos los grupos. Por ejemplo, abstenerse de toda agrupación de un grupo de ratones en un área particular, como un estante. Esto sin darse cuenta podrían introducir una variable adicional.
3. Antes de hacer cualquier perturbación del ciclo de luz o de medición de la actividad, usted debe dar a los ratones de aproximadamente una semana para aclimatarse a la nueva jaula, y la rueda. A un ratón que no se están ejecutando en las ruedas después de una semana debe ser removido de la jaula y se sustituye con otro ratón.
4. Una vez que haya un grupo de animales de forma estable con ruedas, puede comenzar la creación de ciclos de luz / oscuridad para poner a prueba distintas hipótesis. Los ciclos de luz diferentes se tratan en detalle en la parte 3.

3. Los ensayos experimentales

1. Para photoentrainment ensayo, empezar por los ratones de la vivienda en una luz de 12 h: 12 h oscuridad ciclo. Un ejemplo de esto sería la luz desde las 7:00 am-7: 00pm, mientras que las luces permanecen fuera de 19:00-7:00 am. Además, la reducción de la intensidad de la luz por la parte de luz de 12 h del ciclo se exponen las diferencias en la sensibilidad a la luz de photoentrainment. Los ratones se debe dar dos semanas para photoentrain y antes de cambiar la intensidad de la luz. (Figura 2)
2. Un aspecto adicional de photoentrainment es la capacidad de volver a ajustar o re-entrenar los ritmos circadianos de una nueva luz / oscuridad ciclo. Esto puede ser examinado por el avance del ciclo luz / oscuridad que los ratones se encuentran en tal manera que las luces se encienden y se apagan antes. Por lo general, los ciclos de luz se adelantan a las 6 horas, por ejemplo, en lugar de un ciclo de luz de 7:00 am-7: 00pm, sería 1:00 am-1: 00pm. Esto también puede ser examinado por retrasar el ciclo de luz. Los ratones suelen ser capaces de re-entrenar a los 5-7 días. (Figura 3)
3. Estos paradigmas no lo hacen, sin embargo, una evaluación completa de la funcionalidad del reloj circadiano endógeno. Los ratones de la vivienda en condiciones de oscuridad constante se puede utilizar para medir el período circadiano endógeno también se conoce como el período de funcionamiento libre. En los animales nocturnos como ratones de tipo salvaje, el período endógeno es menos de 24 horas lo que significa que empezarán a publicarse en la rueda un poco más temprano cada día. (Figura 2) La hora exacta de este período varía ligeramente entre las diferentes cepas de ratón. Por ejemplo, el período de funcionamiento libre de los ratones C57 es de aproximadamente 23,3 horas, mientras que en BALB / cJ ratones que es de 22,5 horas ^10.
4. Después de determinar el período de funcionamiento libre, en constante entrada de luz oscura condiciones para el sistema circadiano puede ser examinada a través de cambio de fase. Cambio de fase es la capacidad de un pulso de luz aguda de cambiar el reloj circadiano. Cambio de fase se puede lograr mediante la administración de un pulso de luz corta (15 minutos; 1000lux) durante la fase activa de los ratones alojados en la oscuridad constante y medir el inicio de la actividad en los días siguientes al pulso de luz. (Figura 4) Estudios previos han producido las curvas de respuesta (denominado curvas de respuesta de fase) que describen la cantidad y la dirección del cambio de base en qué momento la luz se le da ^{11, 12.} Por ejemplo, un minuto 15, 1000 lux luz pulsada dan 4 horas después del inicio de la actividad (CT16), dará lugar a un retraso de dos horas de actividad, mientras que el pulso de luz mismo da 8 horas después del inicio de la actividad (CT20), dará lugar a un avance de 2 horas. (Figura 4)
5. Para probar el efecto directo de la luz sobre la actividad de rueda para correr, un pulso de luz puede ser administrada a los ratones durante la fase oscura / activo. La presencia de la luz en este momento se inhiben de ruedas corriendo actividad. Mientras que la duración de este pulso de luz puede variar, hemos encontrado que un pulso de 3 horas a partir de 2 horas después del comienzo de la fase oscura es más informativa. (Figura 5) En algunos casos, puede ser útil para consolidar la actividad previa a esta prueba, usted puede hacer esto por cambiar este ciclo de luz a una luz de 16 horas: 8 h oscuridad ciclo una semana antes de la administración del pulso de luz.
6. Esta inhibición de la actividad de rueda para correr directamente por la luz puede ser examinado en todas las fases del ciclo circadiano mediante el uso de un ultradianos (T7) el ciclo de luz ^13. Este ciclo se compone de 3.5h luz: 3,5 h oscuridad durante la duración de una semana ^13. Los ratones no son capaces de photoentrain permitiendo pulsos de luz a caer en todos los puntos en el ciclo circadiano en el transcurso de este tratamiento de 1 semana. (Figura 6)
7. Al igual que en condiciones de oscuridad constante, los ratones de la vivienda en luz constante se revela una característica periodo de funcionamiento libre. Sin embargo, este período será más largo que el período se encuentra en constante oscuridad. La duración del período de funcionamiento libre de luz constante se correlaciona positivamente con la intensidad de la luz ^14, como la cantidad de luz aumenta también lo hace la longitud libre funcionamiento período. (Figura 7) Sin embargo, los ratones rara vez muestran períodos mayores a 26 horas. En cambio, bajo la luz brillante, su actividad será arrítmico. Por esta razón, es la intensidad de luz es una consideración importante si va a comparar la duración del período de luz constante.
8. Al decidir que para llevar a cabo estas perturbaciones luz, recuerde que los ciclos de luz antes puede afectar a los ritmos circadianos. Por esta razón, lo mejor es comenzar con los primeros tratamientos más suaves y se mueven progresivamente a los tratamientos de luz más intenso. Por ejemplo, los ensayos photoentrainment, oscuro constante, y los cambios de fase son muy leves y no parecen conducir a efectos de larga duración. Por otro lado, el ciclo de T7 y la luz son constantes tratamientos de luz muy dura y puede dar lugar a arritmias y se debe reservar para el final del experimento.

4. Análisis de los datos

1. Ruedas corriendo actividad se recoge y el número de revoluciones de la rueda que ocurren dentro de un período de tiempo determinado agrupada. Este intervalo de caja o de muestreo es normalmente de 10 minutos. Los datos pueden visualizarse en una hoja de cálculo Excel muestra el número de revoluciones de la rueda en cada bandeja. Esto puede ser útil para la cuantificación y la comparación de las revoluciones de las ruedas. Los datos también se pueden mostrar como una actogram por el que se representa la cantidad de actividad en cada bandeja por la altura de una barra de color negro como un histograma. (Figura 2)
2. Inicio de actividad se define como el comienzo de la pelea de la actividad predominante. Los parámetros exactos pueden variar entre cada individuo, pero por lo general, buscamos la primera pelea de la actividad que dura más de 30 minutos.
3. Para analizar la capacidad de los ratones a photoentrain, hay varias medidas que pueden ser examinadas. Un método común utilizado para considerar un ratón que se photoentrained es la observación de una relación estable entre el inicio de la actividad del ratón y el desplazamiento de la luz, así como un gran porcentaje de la actividad del ratón se limita a la fase oscura.
4. El inicio de la actividad aporta más información cuando se mira en re-arrastre a un avance del ciclo luz / oscuridad, mientras que la actividad de desplazamiento es más informativa que el examen de reentrada a los retrasos en el ciclo luz / oscuridad. Los ratones suelen tardar 5-7 días para volver a entrenar por completo su actividad de rueda para correr a un avance de 6 horas o retraso del ciclo luz / oscuridad. Considerar la posibilidad de un ratón de nuevo arrastrado, sobre todo en respuesta a un avance, se debería observar una relación estable entre el inicio de la actividad y el desplazamiento de la luz. Esta relación debe ser similar a lo observado antes de que el avance del ciclo de luz y debe permanecer por lo menos tres días. (Figura 3)
5. Para calcular el período, tanto en luz constante oscuro y constante, los inicios de la actividad deben ser determinados por 2 semanas y están equipadas con una línea de regresión. Como se mencionó anteriormente, en ratones de tipo salvaje, el período de oscuridad constante será de menos de 24 horas, mientras que el período de luz constante será mayor de 24 horas. (Figuras 2 y 7)
6. Al calcular el cambio después de un pulso de luz, comience por las líneas de regresión apropiado para inicios la actividad durante al menos 5 días antes y cinco después del pulso de luz. Calcular la diferencia entre estas dos líneas de regresión para determinar la magnitud del cambio de fase. (Figura 4)

5. Resultados representante

Al mirar los registros de rueda para correr, usted debe esperar para ver de varias horas de funcionamiento continuo en cada ratón. Debido a que los ratones son animales nocturnos, esta en funcionamiento, o la fase activa, se correlaciona con el período de oscuridad en la presencia de un ciclo luz / oscuridad. Los ratones sin correr en condiciones constantes también se han limitado este período de actividad sostenida en representación de la fase activa de su libertad de movimientos, el ritmo. En la oscuridad constante, esto será inferior a 24 horas y la luz constante,más de 24 horas. La administración de una de 15 minutos 1000lux pulso de luz 4 horas después del inicio de la actividad (CT16) dará lugar a la aparición de actividad en diferido en los días siguientes al pulso de luz.

Figura 1: espectros de la luz A. Representante. El espectro de la luz producida por el sol es amplia y relativamente imparcial entre 400 nm y 700 nm, que es la parte visual del espectro de luz. B. El espectro de un pico de luz incandescente en el rango infrarrojo, lo que lleva a su tendencia de color rojo, con baja intensidad en la zona azul. C. La lámpara fluorescente típica, consiste en picos discretos de luz que van a aparecer "blanco" a la vista. D. Sin embargo, las bombillas fluorescentes de luz diurna tiene un espectro amplio y mayor frecuencia de picos discretos. El resultado es una fuente de luz que no es tan caliente como una bombilla incandescente, pero tiene un espectro más amplio que un tubo fluorescente normal.

Figura 2: photoentrainment circadianos. El actogram es un gráfico de la actividad de un solo ratón en días consecutivos, se trazan en el eje, y el tiempo se representa en el eje-x. Las barras de color negro representan el número de revoluciones de la rueda, y el fondo está sombreado para dar una indicación del ciclo luz / oscuridad. En los días 1-8, el ratón se encuentra en una luz 12:12: oscuridad ciclo. Durante este tiempo, el ratón comienza a funcionar en el desplazamiento de las luces y consolida su actividad en la fase oscura. Durante la fase de luz, la actividad es mínima. El día 9, las luces se apagan, dejando el ratón en la oscuridad constante. Sin un ciclo de luz, no hay entrada para el reloj circadiano, que se traduce en el reloj corriendo en su tiempo endógeno. Como puede ver, la actividad comienza más temprano cada día una indicación de que el reloj endógeno de este animal es de menos de 24 horas.

Figura 3: Re-arrastre. Arrastre de volver a paradigmas implican cambiar el ciclo de luz hacia adelante o hacia atrás forzando el reloj circadiano para ajustar al ciclo de luz nueva. En este ejemplo, el ciclo se adelanta 6 horas en el día 9 y luego retrasó seis horas el día 20. En ambos casos, se requieren varios días para la completa re-arrastre, sin embargo dependiendo de la dirección del movimiento, el efecto es más pronunciado, ya sea en la aparición o el tiempo de compensación.

Figura 4: Los ritmos circadianos cambio en respuesta a pulsos cortos de luz. A. Los animales alojados en la oscuridad constante free-run con un período de menos de 24 horas. El día 8, a 15 minutos en 1000-lux pulso de luz se administra 4 horas después del inicio de la actividad (CT16). En los días siguientes, un cambio en el tiempo la actividad de inicio se observa. El cambio de fase es la diferencia en el tiempo del animal inicio prevista (determina a partir de su actividad antes de que el pulso de luz) y el tiempo que realmente empezará a ejecutarse en los próximos días el pulso de luz.
B. La curva de respuesta de fase para los ratones muestra la cantidad y la dirección del cambio que se produce en respuesta a un breve pulso de luz en determinados momentos circadianos. Un pulso de luz durante el día subjetivo (CT0-12) no puede inducir un cambio significativo, conocido como la zona muerta. Desde CT12-19, un retraso de fase puede ser inducida con la demora máxima se produce en respuesta a un pulso de luz en el CT16. CT entre 19 y 24, el ritmo de actividad se avance en la respuesta a un pulso de luz con el avance máxima se produce en respuesta a un pulso de luz en el CT20.

Figura 5: Rueda de duración actividad se inhibe o enmascarados en respuesta a un pulso de luz en la noche. En este ejemplo, el ciclo de luz es de 16h luz: oscuridad 8h y consolida la actividad. Un pulso de luz de 3 horas comienza 2 horas después se apagan las luces en el día 4. Durante este tiempo, hay poca o ninguna actividad rueda de duración que muestra la capacidad de la luz para inhibir directamente la actividad. La actividad se reanuda tras el pulso de luz.

Figura 6: Ciclo de T7 se utiliza la luz para exponer los ratones a los pulsos de luz a lo largo del ciclo circadiano. El ciclo de T7 consta de 3,5 horas de luz seguido por 3,5 horas de oscuridad. En este ciclo, los ratones se mantienen un ritmo circadiano, sin embargo, también se mostrará el enmascaramiento de la actividad de rueda para correr durante los pulsos de luz. La cantidad de actividad durante la luz puede ser comparada con la cantidad de actividad durante la oscuridad de una medida de enmascarar lo que no está sesgada por el tiempo circadiano.

Figura 7: Período de alargamiento a la luz constante

Discussion

Los ritmos circadianos han sido medidos y registrados en diferentes organismos a lo largo de la historia. Si bien hemos descrito específicamente el método para la grabación de los ritmos de actividad en ratones, esta técnica puede ser fácilmente modificado para medir los ritmos de otros roedores como las ratas y hámsters, que se utilizan a menudo en los estudios circadianos. Sin embargo, el período de TCL y el tiempo para volver a entrenar en otros organismos pueden variar. Por ejemplo, el período freerunning de un hámster en una oscuridad constante es 24,0 horas, mientras que en ratones es de menos de 24 horas. En la circunstancia, que se está trabajando en un organismo, que no es adecuado para la actividad de rueda para correr, muchos de los paradigmas de la luz misma puede ser utilizada, sin embargo, un ritmo fisiológico diferente debe ser considerado. La medida más similar es la actividad general. En los seres humanos, monos y perros, los investigadores suelen utilizar actigrafía, que mide la cantidad de movimiento del individuo. En los seres humanos, la temperatura corporal y la secreción de melatonina también se suele medir y ambos han demostrado tener un ritmo circadiano, que es capaz de cambio de fase y poder volver a entrenar ^{15, 16.}

Mientras que nosotros pensamos de estos ritmos fisiológicos como hechos discretos, son muy interconectados. El ritmo de actividad de un animal puede estar estrechamente superpone con el ritmo de la temperatura corporal y es el inverso de un ritmo de sueño. Además, la secreción de melatonina que es a menudo utilizado como un marcador de la fase circadiana, se asemeja mucho al ritmo normal del sueño en los seres humanos. Debido a que estos ciclos están tan entrelazadas, el estudio de uno se puede informar y predecir los resultados de los demás. Por ejemplo, NPAS2 ratones mutantes, que mostró la actividad de la rueda de funcionamiento continuo, aunque la parte oscura de un ciclo de luz oscuridad, fueron examinados después de ¹⁷ defectos de sueño. Estos ratones se encontró que duermen menos en general, con la disminución que ocurre durante la fase oscura, la normal "hora de la siesta".

Actividad de rueda para correr proporciona una manera relativamente no invasiva para estudiar los ritmos circadianos. Los paradigmas se ha descrito anteriormente se puede utilizar para completar un análisis detallado del comportamiento circadiano. Además, los paradigmas, como photoentrainment y la vivienda en la oscuridad constante se puede utilizar como un estudio inicial de fenotipos circadianos antes de que más investigación se centró, como el análisis del sueño.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
11.5 cm running wheels	Mini Mitter
Vital View Software for Data Acquisition	Mini Mitter
Clock lab for data analysis	Actimetrics