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Neocortex की एक Organotypic स्लाइस तैयारी से पूरे सेल रिकॉर्डिंग

, , ,

Department of Anatomy and Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center

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Cite this Article: Neocortex की एक Organotypic स्लाइस तैयारी से पूरे सेल रिकॉर्डिंग

Foehring, R. C., Guan, D., Toleman, T., Cantrell, A. R. Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex. J. Vis. Exp. (52), e2600, doi:10.3791/2600 (2011).

Abstract: Neocortex की एक Organotypic स्लाइस तैयारी से पूरे सेल रिकॉर्डिंग

हम चूहे neocortex से पिरामिड न्यूरॉन्स में वोल्टेज gated पोटेशियम चैनलों की अभिव्यक्ति और कार्यात्मक भूमिका का अध्ययन किया गया. इन चैनलों के लिए विशिष्ट औषधीय एजेंटों की कमी के कारण, हम चैनल अभिव्यक्ति से छेड़छाड़ करने के लिए एक आनुवंशिक दृष्टिकोण ले लिया है. हम एक organotypic संस्कृति तैयारी (16) का उपयोग क्रम में सेल आकारिकी और प्रांतस्था के लामिना पैटर्न को बनाए रखने के लिए. हम आम तौर पर प्रसव के बाद दिन 8-10 पर तीव्र neocortical स्लाइस को अलग और संस्कृति में स्लाइस को बनाए रखने के 3-7 दिनों के लिए. यह हमें तीव्र स्लाइस के साथ हमारे काम में उन लोगों के लिए एक समान उम्र में न्यूरॉन्स अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है और टुकड़ा में विपुल उत्तेजक कनेक्शन के विकास कम से कम. हम परतों द्वितीय / तृतीय या वी में नेत्रहीन पिरामिड न्यूरॉन्स की पहचान वर्तमान या वोल्टेज क्लैंप में पूरे सेल पैच दबाना के साथ अवरक्त (आईआर) रोशनी और अंतर हस्तक्षेप विपरीत माइक्रोस्कोपी (डीआईसी) का उपयोग से रिकॉर्ड है. हम जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती पोटेशियम चैनल डीएनए (जीन बंदूक) के biolistic अभिकर्मक का उपयोग करने के लिए उनके कार्य का अध्ययन करने के लिए चैनलों की अभिव्यक्ति में हेरफेर. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को आसानी से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के लिए सीडीएनए के साथ सह - अभिकर्मक के बाद epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा की पहचान कर रहे हैं. हम एक ही टुकड़ा से ही परत में आसन्न, untransfected न्यूरॉन्स ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की रिकॉर्डिंग की तुलना.

Protocol: Neocortex की एक Organotypic स्लाइस तैयारी से पूरे सेल रिकॉर्डिंग

1. टुकड़ा करने की क्रिया के दिन से पहले तैयारी

हमें लगता है कि यह और अधिक कुशल है करने के लिए शल्य चिकित्सा उपकरणों आटोक्लेव और समाधान टुकड़ा करने की क्रिया के दिन से पहले तैयार है.

  1. आटोक्लेव उपकरणों. (सर्जरी और टुकड़ा करने की क्रिया अर्द्ध बाँझ परिस्थितियों के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं). निम्नलिखित संकुल, व्यक्तिगत आटोक्लेव कागज में लिपटे आटोक्लेव:
    • सर्जरी पैकेज रंग: # 22 स्केलपेल ब्लेड संभाल, कैंची, संदंश
    • कस्टम टुकड़ा करने की क्रिया पैकेज: 3 (ब्लेड पकड़ घुंडी और 2 स्नान हासिल knobs) knobs और ब्लेड गार्ड (slicer से उस्तरा ब्लेड धारण: Campden Vibroslice, MA572 #), व्यक्तिगत लिपटे (क्योंकि इसे ठंडे बस्ते में डाल दिया जाएगा) धातु कक्ष बनाया ( स्नान (निर्माता plexiglass एक दोहराया autoclaving नहीं सामना करेंगे) slicer, hemostat, कैंची, संदंश, के लिए नमूना).
    • कांच के बने पदार्थ पैकेज: दो 50 एमएल beakers और एक 25 एमएल बीकर
  2. विभाज्य घोड़े सीरम (Hyclone दाता घोड़ा # एसएच 30074: Thermoscientic). विभाज्य ~ 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में 11 घोड़े सीरम की एमएल. (10ml सीरम की जरूरत है. जब सीरम thawed है, आप 11 एमएल से जो अपेक्षित 10 एमएल aspirate करने के लिए की जरूरत है क्योंकि बुलबुले फार्म का होगा). स्टोर एक -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में सीरम aliquoted.
  3. विभाज्य मीडिया. बाद मीडिया की बोतलें खोल रहे हैं, वे केवल ~ 4 सप्ताह (पीएच परिवर्तन के कारण) के लिए स्थिर रहे हैं. स्लाइस ताजा मीडिया के साथ बेहतर जीवित रहते हैं.
    • हम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध (500 एमएल की बोतलों में खरीदी), मीडिया, प्लस घोड़े सीरम के तीन प्रकार का उपयोग करें. मीडिया हैं: HMEM Lonza (Biowhittaker मिनिमल आवश्यक मीडिया प्लस HBSS और HEPES, कोई glutamine: # 12-137F सूचि), HBSS (GIBCO हैंक्स खारा, 24020-117 # buffered), और सदस्य (GIBCO न्यूनतम आवश्यक मध्यम, # 12360 - ) 038. तालिका 2 देखें.
    • मीडिया (HMEM, HBSS, और सदस्य) के तीन प्रकार के प्रत्येक के लिए, विभाज्य ~ चार 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में से प्रत्येक में 50 एमएल मीडिया के 500 एमएल की बोतल से. Parafilm aliquoting के बाद सभी ट्यूबों. फ्रिज में स्टोर सदस्य, और दुकान HMEM और कमरे के तापमान पर HBSS.
    • संस्कृति मीडिया घोड़े सीरम, HMEM, और HBSS (नीचे देखें, तालिका 2) के एक मिश्रण के होते हैं. सदस्य धोने मीडिया के रूप में प्रयोग किया जाता है.
  4. समाधान काटना (तालिका 3) बनाओ. 125 NaCl, 3 KCl, 2 नाह 1.25 4 पीओ, NaHCO 3 26, 2 मिमी 2 CaCl, 2 मिमी 2 MgCl, और 20 मिमी ग्लूकोज: काटना समाधान (मिमी) से बना है. हम आम तौर पर 250 मिलीलीटर (बड़ा फ्लास्क में मात्रा लाने) बनाते हैं. Osmolality की जाँच करें (310 ~ होना चाहिए) और पीएच (7.2-7.3).

बाद कदम (# 2 और # 3) टुकड़ा करने की क्रिया के दिन पर प्रदर्शन कर रहे हैं.

2. सर्जरी, टुकड़ा करने की क्रिया, और Organotypic संस्कृति

यह अन्य सभी प्रक्रियाओं बनाम एक अलग स्थान में सर्जरी प्रदर्शन करने के लिए महत्वपूर्ण है. हम मस्तिष्क को हटाने के लिए सर्जरी के लिए एक वैक्यूम हुड (सगंधित) का उपयोग करें. एक लामिना का प्रवाह हुड जैसे टुकड़ा करने की क्रिया और स्लाइसें और समाधान की जोड़तोड़ अर्द्ध बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन प्रक्रियाओं के लिए प्रयोग किया जाता है.

  1. समाधान तैयार है. (इन प्रक्रियाओं की जरूरत है बाँझ शर्तों के तहत प्रदर्शन नहीं के रूप में समाधान बाद में एक चरण में फ़िल्टर किया जाएगा.).
    1. काटना समाधान (तालिका 3) की तैयारी. बुलबुला 95% की एक मिश्रण हे कम से कम 20 मिनट (पीएच स्थिर और सुनिश्चित करें कि सभी लवण समाधान में हैं) के लिए 2 / 5% सीओ 2 के साथ समाधान. 1 मिमी Pyruvic एसिड (चयापचय अवरोध करनेवाला) and0.6 मिमी एस्कॉर्बेट एंटीऑक्सीडेंट () जोड़ें.
    2. पिघलना घोड़े सीरम की एक विभाज्य (11 एमएल).
  2. लामिना का प्रवाह हुड तैयार है (सभी प्रक्रियाओं के लिए दस्ताने पहनते हैं, EtOH के साथ दस्ताने तर). इस खंड में, हम काम के क्षेत्र में एक साफ, काम अर्द्ध बाँझ अंतरिक्ष प्रदान करने के लिए तैयार करते हैं. हम भी समाधान को फ़िल्टर करने के लिए उन्हें बाँझ जाएगा.
    1. ~ 1 घंटे के लिए यूवी प्रकाश का उपयोग लामिना का प्रवाह हुड के भीतर काम करने की जगह बाँझ (यूवी प्रकाश प्लास्टिक भागों को नुकसान तो हम theCampden Vibroslice कवर हम टुकड़ा करने की क्रिया के लिए उपयोग करने के लिए, नीचे देखें). 70% EtOH के साथ सभी सतहों को साफ (slicer की प्लास्टिक knobs छोड़कर: EtOH नुकसान होगा). इसके अलावा आमतौर पर लामिना का प्रवाह हुड के तहत वर्तमान में pipetter और pipets, EtOH बोतल, गोंद, और टयूबिंग 95% 2 हे / 5% सीओ 2 और 100 2 हे से जुड़े हैं.
    2. लामिना का प्रवाह हुड के अंतर्गत निम्नलिखित प्लेस:
      • Autoclaved टुकड़ा करने की क्रिया पैकेज
      • 250 एमएल काटना समाधान
      • Millipore व्यक्त प्लस फिल्टर: 250 एमएल [0.2 सुक्ष्ममापी फिल्टर (SC6PU02RE #) काटना समाधान फ़िल्टर करने के लिए]:
      • संस्कृति मीडिया अवयव:
        • 20 एमएल HMEM
        • 10 एमएल HBSS
        • 10 एमएल घोड़ा सीरम
      • कांच के बने पदार्थ पैकेज: autoclaved beakers
      • सदस्य धोने मीडिया के 50 एमएल
      • Pipetter (Drummondpipet - सहायता)
      • सात प्लास्टिक हस्तांतरण pipettes (# फिशर 13-711-20). समाधान और मीडिया बुदबुदाती के लिए इन स्लाइस और समाधान, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गैस समाधान के लिए नाली के रूप में में सेवा (95% 2 हे / 5% सीओ 2 हे 2) को स्थानांतरित करने के लिए उपयोग किया जाता है.
      • Cyanoacrylate गोंद
      • रेजर ब्लेड या कैंची (प्लास्टिक कटौती).
      • बाँझ # 22 स्केलपेल ब्लेड
      • Millicell सेल संस्कृति (0.4 सुक्ष्ममापी, 30 सुक्ष्ममापी व्यास, 03050 # PICM) आवेषण 6 अच्छी तरह से एक थाली के लिए 3 आवेषण
      • 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट (ओं) (Corning: costar 3516 #)
    3. फ़िल्टर तैयार 250 एमएल काटना समाधान का उपयोग कर एक 250 एमएल Millipore फिल्टर (ऊपर देखें).
      विभाज्य एक 50 एमएल बीकर में समाधान काटना के 40 एमएल. समाधान और 210 एमएल फ्रीजर में काटना समाधान शेष (-20 डिग्री सेल्सियस) काटना के 40 एमएल विभाज्य रखें. लक्ष्य ~ 4 ° खोपड़ी (बीकर में 40 एमएल) से हटाने के बाद मस्तिष्क को प्राप्त करने के लिए सी और काटने (210 एमएल) के लिए एक कीचड़दार मिश्रण के रूप में इन समाधानों का उपयोग है.
    4. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखें धातु टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष (आटोक्लेव कागज के साथ कवर). यह टुकड़ा करने की क्रिया के दौरान काटना समाधान और मस्तिष्क ठंडा रखने में मदद करता है.
    5. संस्कृति मीडिया तैयार है और कुओं (बुलबुला संस्कृति मीडिया मत करो - यह झाग) में डाल दिया.
      • 50 एमएल प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में 40 एमएल संस्कृति मीडिया तैयार:
        • 20 एमएल HMEM 10 + एमएल + घोड़े सीरम की 10 एमएल विभाज्य (टेबल 2) HBSS मिक्स
        • फ़िल्टर संस्कृति (बाँझ) मीडिया 50 एमएल Millipore steriflip 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर (SCGP00525 #) का उपयोग.
      • 6 अच्छी तरह से एक थाली के 3 तिरछे दूरी कुओं (Corning: costar # 6 +३,५१६ अच्छी तरह से संस्कृति क्लस्टर) में 1.1 एमएल संस्कृति मीडिया रखें. प्लेस 6-अच्छी तरह से 37 में मीडिया / प्लेट संस्कृति ° सी इनक्यूबेटर में कम से कम एक घंटे के लिए.
    6. बाँझ कैंची या रेजर ब्लेड के साथ, छोटा हस्तांतरण pipets (स्लाइस स्थानांतरित करने के लिए उपयोग) 4. कटौती ट्यूब समाप्त होता है आगे के लिए बुदबुदाती समाधान के लिए गैसों फैलाने संशोधन के बिना उपयोग किया जाता है. इन ट्यूबों लाइनों के 95% 2 हे / 5% सीओ 2 या 100% समाधान के लिए 2 हे के टैंक से कनेक्ट .
    7. फ़िल्टर धो मीडिया (50 एमएल) 50 एमएल Millipore steriflip 0.22 सुक्ष्ममापी फिल्टर (SCGP00525 #) का उपयोग. धो मीडिया रेफ्रिजरेटर में रखें.
  3. सर्जरी के लिए तैयार है. समाधान करने के लिए सर्जरी के बाद मस्तिष्क (शून्य डाकू) को स्वीकार करने के लिए और तेजी से टुकड़ा करने की क्रिया और संस्कृति के लिए तैयार (लामिना का प्रवाह हुड) करने की अनुमति के लिए तैयार होना चाहिए. हम एक निर्वात हुड के तहत सर्जरी प्रदर्शन करते हैं. यह महत्वपूर्ण है कि सर्जरी के एक अलग क्षेत्र में प्रदर्शन किया जा करने के लिए बाल और शरीर के तरल पदार्थ अर्द्ध बाँझ लामिना प्रवाह हुड से दूर रखना.
    1. मीडिया और समाधान तैयार.
      • फ्रीजर से 40 एमएल काटना समाधान के साथ 50 एमएल बीकर निकालें और खोपड़ी से हटाने के बाद मस्तिष्क प्राप्त करने के लिए वैक्यूम हुड के नीचे डाल दिया. ~ 25 एमएल बीकर में इस ठंड काटना समाधान के 10 एमएल डालो. यह लामिना का प्रवाह हुड मस्तिष्क परिवहन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
      • फ्रीजर से 210 एमएल काटना समाधान निकालें और लामिना का प्रवाह हुड में डाल (टुकड़ा करने की क्रिया और टुकड़ा संग्रह के लिए).
      • फ्रीजर से धातु टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष निकालें और लामिना का प्रवाह हुड के नीचे डाल दिया.
      • बुलबुला दोनों 95% 2 हे / 5% सीओ 2 (कट प्लास्टिक हस्तांतरण pipettes उपयोग के समाधान के लिए टयूबिंग कनेक्ट) के साथ समाधान काटने .
    2. वैक्यूम हुड के नीचे निम्नलिखित मदों (30 एमएल काटना समाधान पहले से ही मौजूद है और 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ बुदबुदाती है) प्लेस :
      • 25 एमएल बीकर autoclaved
      • Autoclaved शल्य चिकित्सा उपकरण, दस्ताने, संदंश
    3. 100% 2 हे के साथ रेफ्रिजरेटर और बुलबुला से मीडिया को धो (कट प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक के अंत का उपयोग करें के समाधान के लिए टयूबिंग कनेक्ट) निकालें.
  4. सर्जरी (वैक्यूम प्रवाह हुड के नीचे प्रदर्शन). इस कदम के लिए टुकड़ा करने की क्रिया के बाद के लिए मस्तिष्क को हटाने के लिए आवश्यक है. यह जानवर त्याग और ठंड, oxygenated काटना समाधान में मस्तिष्क रखने के बीच के समय को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह भी महत्वपूर्ण है मस्तिष्क आघात को कम करने. सभी प्रक्रियाओं पशु देखभाल और उपयोग समिति, टेनेसी विश्वविद्यालय के स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र द्वारा अनुमोदित किया गया.
    1. हम Sprague-Dawley चूहों से P6-P17 (हम P8-P10 पसंद करते हैं) का उपयोग करें. कवर 2-4 एल प्लास्टिक के कंटेनर में रखें चूहा. संज्ञाहरण के लिए, ~ 1 एमएल isofluorane धुंध का एक टुकड़ा है एक प्लास्टिक की जाली के नीचे स्थित करने के लिए लागू किया जाता है (ताकि संवेदनाहारी जानवर से संपर्क नहीं करता है). Isoflurane के साथ चूहे anesthetize जब तक पशु areflexive है. EtOH के साथ दस्ताने तर.
    2. बाद चूहे anesthetized है, बड़े स्केलपेल के साथ पशु सिर काटना, और मस्तिष्क को हटा दें. में मस्तिष्क रखोठंड के 30 एमएल युक्त बीकर (~ 4 डिग्री सेल्सियस) ~ 30 सेकंड के लिए काटना समाधान. ध्यान से 25 एमएल बीकर लामिना का प्रवाह हुड बाल या रक्त के हस्तांतरण को कम करने के लिए मस्तिष्क हस्तांतरण.
    3. बदलें दस्ताने (तर EtOH साथ).
    4. ठंड काटना समाधान में स्थानांतरण मस्तिष्क लामिना का प्रवाह डाकू (25 एमएल बीकर).
  5. मस्तिष्क स्लाइस और संस्कृति के लिए तैयार हैं. इस चरण में, उन्मुख मस्तिष्क हम अनावश्यक मस्तिष्क के ऊतकों को हटाने, और कटौती और मस्तिष्क स्लाइसें इकट्ठा. हम तो स्लाइस धोने, एक जाल डालने पर प्रत्येक टुकड़ा जगह है, 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेटों में जाल आवेषण जगह, और हस्तांतरण इनक्यूबेटर संस्कृति के लिए प्लेट (स्लाइस के साथ).
    1. ओरिएंट और ब्लॉक मस्तिष्क (सेरिबैलम और ललाट पोल को हटाने, आंशिक मध्य sagital ~ कट ललाट प्रांतस्था अंत से आधा रास्ता बनाने के लिए यह दो स्लाइस के साथ - साथ काटने की अनुमति देता है - एक प्रत्येक गोलार्द्ध से - लेकिन अभी भी दोनों hemsipheres एक साथ एक के लिए दुम अंत में बरकरार रखती है मंच पर गोंद के लिए स्थिर आधार). गोंद cyanoacrylate साथ मंच पर मस्तिष्क अवरुद्ध. ललाट प्रांतस्था और frontoparietal प्रांतस्था का राज्याभिषेक स्लाइस में कटौती के साथ प्लेस मस्तिष्क. अतिरिक्त स्केलपेल के रूप में टुकड़ा के आकार को सीमित करने की जरूरत में कटौती करें.
    2. मस्तिष्क के साथ निष्फल धातु का टुकड़ा करने की क्रिया कक्ष (जो हिल ऊतक slicer से जुड़ा हुआ है) में मंच प्लेस और बर्फ का ठंडा स्नान के साथ भरने, काटना समाधान बुदबुदाती. 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ एक 50 एमएल (में स्लाइस इकट्ठा) बीकर और बुलबुला में ~ शेष काटना समाधान के 30 एमएल डालो .
    3. एक हिल ऊतक slicer (विश्व परिशुद्धता उपकरण, Sarasota, FL, संयुक्त राज्य अमरीका Campden Vibroslice # MA572) के साथ 250-300 सुक्ष्ममापी स्लाइस काटें. कि 30 एमएल काटना समाधान होता है बीकर में प्लेस स्लाइसें. स्लाइस आप संस्कृति (आमतौर पर 3-6) के लिए इच्छा की संख्या, प्लस कुछ अतिरिक्त लीजिए.
    4. एक 35 मिमी, प्लास्टिक पेट्री डिश में प्लेस ~ 2 एमएल धो मीडिया: स्लाइसें धो लें. काटना समाधान से धो मीडिया के साथ प्लास्टिक पेट्री डिश सभी स्लाइस स्थानांतरण. स्लाइस 3 बार धो, ताजा धो मीडिया का उपयोग हर बार. अलग हस्तांतरण pipettes प्रयोग स्लाइस हस्तांतरण, मीडिया जोड़ने, और बेकार समाधान aspirate.
    5. संस्कृति मीडिया (, नए हस्तांतरण विंदुक एक अलग 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में) स्लाइस स्थानांतरण. जाल आवेषण के लिए पैकेजिंग से निकालें सबसे ऊपर है, लेकिन पैकेजिंग में आवेषण छोड़.
    6. डालने के (चित्र 1 ए) के बीच में स्थिति स्लाइस: संस्कृति मीडिया से जाल आवेषण (cuttransfer विंदुक के साथ) के लिए स्थानांतरण स्लाइसें. संस्कृति मीडिया का एक छोटा सा के साथ टुकड़ा के साथ आ जाएगा. एक अक्षुण्ण हस्तांतरण विंदुक का उपयोग, टुकड़ा डालने पर नीचे रखने के तुरंत बाद अतिरिक्त संस्कृति मीडिया को हटा दें. डालने के केंद्र में स्थिति टुकड़ा (यह biolistic अभिकर्मक की सुविधा और बाद में रिकॉर्डिंग के लिए टुकड़ा हटाने के लिए यह आसान बनाता है) की कोशिश करो.
    7. संस्कृति मीडिया में जगह जाल डालने टुकड़ा / 6 अच्छी तरह से थाली में (चित्रा 1 बी). Mesh.When 3 / आवेषण स्लाइस के तहत हवाई बुलबुले के गठन को रोकने सावधान रहो 6 अच्छी तरह से थाली, जगह इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से थाली वापस में हैं. ~ 1 घंटे के लिए 37 ° सी इनक्यूबेटर में स्लाइस सेते हैं.
  6. Transfect जीन गन का उपयोग कर स्लाइस (जैव रेड Helios). यह टुकड़ा करने की क्रिया और 6 अच्छी तरह से थाली में जाल पर नियुक्ति के बाद तुरंत किया जा सकता है, लेकिन हम आमतौर पर 37 में 1 घंटे के लिए सेते ° सी स्लाइस को स्थिर करने के लिए और फिर कोशिकाओं transfect. सीडीएनए "गोलियों" बनाने और जीन गन का उपयोग करने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए, refs देखें. 17-22.
    1. प्लास्टिक "cartidges" "गोलियों" युक्त लोड. (हम सीडीएनए लेपित गोलियों के रूप में सोने के कणों को देखें. इस प्रकार, कई बुलेट प्लास्टिक "कारतूस" में निहित हैं). प्रथम स्थान मुक्त छोड़ दो (कोई "कारतूस"). कारतूस सीडीएनए - लेपित गोलियों से युक्त के साथ हर दूसरे स्थान पर लोड. प्लेस जीन बंदूक में कारतूस धारक.
    2. कोई कारतूस के साथ बैरल फायरिंग से साफ बंदूक.
    3. कारतूस के साथ एक बैरल अग्रिम. इनक्यूबेटर और जगह से लामिना का प्रवाह हुड के तहत छह अच्छी तरह से थाली निकालें. 6 अच्छी तरह से थाली के शीर्ष बस के ऊपर बंदूक पकड़ो. ऊर्ध्वाधर पकड़ो. ~ 100 साई पर गोली मारो.
    4. अग्रिम बैरल, स्पष्ट, दोहराने. टुकड़ा प्रति एक गोली मार दी.
    5. शूटिंग के बाद, / इनक्यूबेटर स्लाइस आवेषण के साथ 6 अच्छी तरह प्लेटें वापसी.
  7. संस्कृति स्लाइस (अर्द्ध बाँझ परिस्थितियों के तहत). स्लाइस और 6 अच्छी तरह से प्लेटों के सभी जोड़तोड़ EtOH के साथ और लामिना का प्रवाह हुड के तहत EtOH के साथ क्षेत्र की सफाई के बाद, संतृप्त दस्ताने पहने किया जाना चाहिए. हम संस्कृति विभिन्न समय अवधि (आमतौर पर 2-7 दिन) के लिए स्लाइस तीव्र टुकड़ा करने की क्रिया प्रक्रिया से वसूली की अनुमति देने के लिए और नए प्रोटीन करने के लिए नेतृत्व करने के लिए अभिकर्मक के लिए समय की अनुमति.
    1. 2-7 दिनों के लिए संस्कृति (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) इनक्यूबेटर में (Forma वैज्ञानिक मॉडल +३,११० #) .
    2. मीडिया हर दूसरे दिन बदलें: तीन खाली कुओं नए मीडिया जोड़ें, कम से कम 1 घंटे के लिए इन्क्यूबेटर में जगह. नए तरह EtOH साफ घुमावदार संदंश के साथ टुकड़ा झिल्ली / हटो. Aspirateपुराना मीडिया. इनक्यूबेटर की थाली लौटें.

3. पिरामिड कक्ष से स्लाइसें में रिकार्ड

यह इस प्रोटोकॉल के दायरे से परे है पूरे सेल रिकॉर्डिंग तकनीकों पर विस्तृत शिक्षा प्रदान करने के लिए. हम कैसे स्लाइस रिकॉर्डिंग कक्ष को हस्तांतरण करने के लिए और हमारे रिकॉर्डिंग के विवरण प्रदान करते हैं पर जानकारी प्रदान के लिए सेट अप है, खासकर के रूप में संबंधित रिकार्डिंग के लिए ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की पहचान करने के लिए.

  1. हम हार्वर्ड GC150TF-10 Sutter पी 87 क्षैतिज खींचने का उपयोग गिलास से इलेक्ट्रोड खींच. इलेक्ट्रोड MΩ कोशिकी समाधान में 2-6 कर रहे हैं. इलेक्ट्रोड KMeSO 4 आंतरिक (3 टेबल देखें) के साथ भर रहे हैं .
  2. दस्ताने पहनें. इनक्यूबेटर से छह अच्छी तरह से थाली निकालें. लामिना का प्रवाह हुड के तहत, ध्यान EtOH - साफ, घुमावदार संदंश के साथ एक डालने / जाल टुकड़ा हटा दें. इनक्यूबेटर में छह अच्छी तरह से थाली बदलें और रिकॉर्डिंग क्षेत्र से दर्ज किया जा टुकड़ा हस्तांतरण. हमारे मामले में यह एक अलग प्रयोगशाला में है. हम एक कवर 35 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में डालने / टुकड़ा ले. इस कदम के बाद, दस्ताने नहीं पहना की जरूरत है (संस्कृतियों या इनक्यूबेटर contaminating की कोई संभावना नहीं).
  3. # स्केलपेल 11 के साथ दूर झिल्ली कट. संदंश या लचीला धातु पट्टी के द्वारा आपूर्ति तनाव के खिलाफ काटें. (यह आवश्यक हो एक कैंची के साथ अंतिम कटौती खत्म कर सकते हैं). संदंश का प्रयोग, संलग्न जाल के साथ एक ओलिंप BX50 WI ईमानदार खुर्दबीन के मंच पर रिकॉर्डिंग कक्ष टुकड़ा हस्तांतरण.
  4. हम एक Axon उपकरण Multiclamp 700B और PClamp 10 में प्रवर्धक डाटा अधिग्रहण प्रोटोकॉल का उपयोग करें. इलेक्ट्रोड स्थिति Sutter मछली-200 manipulators और PC-200 नियंत्रक के साथ नियंत्रित किया जाता है. हम IR-डीआईसी प्रकाशिकी के साथ एक ओलिंप BX 50WI ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए परतों द्वितीय / तृतीय या वी. में पिरामिड न्यूरॉन्स हम एक एकल IR के प्रति संवेदनशील (ओलिंप OLY-150 या DAGE MTI) कैमरा और ProVideo 1201B मॉनिटर का उपयोग करने के लिए कल्पना कल्पना टुकड़ा में कोशिकाओं. 33 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर 2-3 एमएल / मिनट पर दिया: स्लाइसें कृत्रिम मस्तिष्कमेरु तरल पदार्थ (3 टेबल aCSF) carbogenated स्नान कर रहे हैं
    आमतौर पर, हम टुकड़ा प्रति 10-50 ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं पाते हैं. कक्ष खुर्दबीन ऐपिस lookingthrough और एक FITC फिल्टर (एक बुर्ज उद्देश्यों के ऊपर और माइक्रोस्कोप के ऐपिस नीचे स्थित माउंट में एक फिल्टर पहिया पर घुड़सवार) के साथ epifluorescence का उपयोग द्वारा स्थित हैं. यह हमें आईआर - डीआईसी और epifluorescence के बीच आसानी से स्विच करने के लिए सेल प्रकार का निर्धारण, कि सेल (सेल epifluorescence के तहत हरी प्रकट होता है और एक गोली शामिल) ट्रांसफ़ेक्ट है की अनुमति देता है, और है कि सेल स्वस्थ है (सेल 3 आयामी है और चिकनी सतह है नाभिक नहीं सूजन, सेल सूजन सिकुड़ा हुआ है या नहीं).
    हम परतों द्वितीय / तृतीय या वी में पिरामिड न्यूरॉन्स (चित्रा 1 देखें) लक्ष्य. पिरामिड कोशिकाओं को एक शिखर परत की दिशा में मैं, कई वृक्ष के समान spines, और नाशपाती के आकार सोम आरोही dendrite की उपस्थिति द्वारा पहचाने जाते हैं. लेयर सेल घनत्व और पिया करने के लिए सापेक्ष स्थान द्वारा निर्धारित किया जाता है. टुकड़ा की सतह पर आम तौर पर कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट स्वस्थ नहीं होगा. हालांकि इसे और अधिक कठिन है तीव्र स्लाइस के साथ तुलना organotypic टुकड़ा के भीतर गहरे कोशिकाओं कल्पना, हम आम तौर पर टुकड़ा सतह के नीचे 20-50 सुक्ष्ममापी से स्वस्थ, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं कल्पना कर सकते हैं. हम मानक पूरे सेल रिकॉर्डिंग तरीकों का उपयोग करें. हम दृश्य मार्गदर्शन के अंतर्गत और वोल्टेज दबाना में सकारात्मक दबाव के साथ सेल दृष्टिकोण. जवानों वोल्टेज क्लैंप के तहत कोमल चूषण (1 एमएल सिरिंज का उपयोग) के साथ हासिल किया है. एक GΩ मुहर प्राप्त करने पर, अतिरिक्त चूषण कक्ष में तोड़ करने के लिए लागू किया जाता है. हम तो या तो वर्तमान या वोल्टेज दबाना में रिकॉर्डिंग करते हैं.
    रिकॉर्डिंग के अंत में, हम सत्यापित करें कि सेल दर्ज हरी है, एक गोली शामिल है, और जाहिरा तौर पर नकारात्मक या सकारात्मक दबाव का जवाब है. स्लाइस, सेल परतों, सर्जरी के समय आयु, और संस्कृति में समय के बीच भिन्नता के लिए नियंत्रण करने के लिए, हम हमेशा एक ही परत से untransfected नियंत्रण कक्षों से रिकॉर्डिंग के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के हमारे रिकॉर्डिंग जोड़ी और ट्रांसफ़ेक्ट सेल के 50 सुक्ष्ममापी साथ स्थित है.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

चित्रा 1A एक तीव्रता से तैयार 6 अच्छी तरह संवर्धन के लिए एक थाली में सम्मिलन के लिए झिल्ली पर बैठे टुकड़ा से पता चलता है. यह टुकड़ा एक P10 पिल्ला चूहे से मोटर और somatosensory प्रांतस्था शामिल है. पिया सफेद बात और बाईं करने के लिए striatum के साथ आंकड़े के सही करने के लिए है. चित्रा 1b / टुकड़ा अच्छी तरह से में झिल्ली, ~ 1.1 एमएल संस्कृति मीडिया में डूब से पता चलता है. Organotypic संस्कृति के लिए हमारा लक्ष्य के लिए प्रांतस्था के सामान्य लामिना पैटर्न बनाए रखने के लिए है, संस्कृति के दौरान सुखाने सतह को रोकने के लिए, और अंततः संस्कृति में कई दिनों के बाद से दर्ज किया जा सकता टुकड़ा में जीवित कोशिकाओं के एक उच्च अनुपात का उत्पादन (कोशिकाओं या सिकुड़ा हुआ नहीं सूजन, सूजन कम से कम सेल नाभिक, आईआर - डीआईसी प्रकाशिकी में कक्षों की चमकदार और तीन आयामी उपस्थिति). चित्रा 1C में 3 दिनों के बाद एक परत III पिरामिड न्यूरॉन के somatosensory प्रांतस्था का एक organotypic टुकड़ा में IR डीआईसी और epifluorescence छवियों से पता चलता हैसंस्कृति (P10 जानवर से). चित्रा 1D एक अलग टुकड़ा की एक epifluorescence छवि है, कई परत वी GFP (हरी कोशिकाओं) के लिए सीडीएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं दिखा.

चित्रा 2 में प्रतिनिधि निशान से पता चलता है वर्तमान और वोल्टेज क्लैंप रिकॉर्डिंग 3 दिनों (P10 पशु) के लिए एक परत वी organotypic टुकड़ा संस्कृति के बाद पिरामिड सेल से. चित्रा 2A overshooting कार्रवाई संभावित (एपी) से पता चलता है. चित्रा 2B s 2, 400 PA लगातार चालू इंजेक्शन के जवाब में दोहराव फायरिंग से पता चलता है. ये निशान एक नियमित रूप से spiking परत वी न्यूरॉन के सामान्य electrophysiological गुण (यह भी देख तालिका 1) से संकेत मिलता है. चित्रा 1C 1 सुक्ष्ममापी (TTX) tetrodotoxin वोल्टेज gated ना + धाराओं ब्लॉक की उपस्थिति में एक परत वी पिरामिड न्यूरॉन से एक रिकॉर्डिंग वोल्टेज दबाना है. निशान -70 एम वी के एक होल्डिंग क्षमता से 500 एमएस -90 एम वी और 70 एम वी (कदम के बीच 10 mV पर) के बीच विभिन्न क्षमता के लिए वोल्टेज कदम के जवाब में धाराओं के एक परिवार के हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. Organotypic टुकड़ा संस्कृति ए. चूहा ज्ञानेन्द्रिय प्रांतस्था के Millicell फिल्टर जाल डालने पर P10 चूहे से स्लाइस. पिया ठीक है, गहरे सफेद बात और छोड़ दिया करने के लिए striatum है. midline ऊपरी छोर पर है. बी तीन टुकड़ा और जाल सम्मिलित ~ 1 एमएल संस्कृति मीडिया में डूबे हुए है और (एक में के रूप में एक ही जानवर) 6 अच्छी तरह से थाली के असन्निकट कुओं में रखा. सी. (ऊपरी) आईआर - डीआईसी और (कम) organotypic संस्कृति में परत III neocortical पिरामिड सेल (P10 पशु, संस्कृति में 3 दिन) की छवियों epifluoresent. "गोली" डीआईसी छवि (काला क्षेत्र) में दिखाई नोट. डी. GFP के लिए सीडीएनए के साथ biolistic अभिकर्मक के बाद कई परत न्यूरॉन्स वी के प्रतिदीप्त छवि.

चित्रा 2
चित्रा 2. Organotypic टुकड़ा संस्कृति में neocortical पिरामिड कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग ए. परत III के पिरामिड कक्ष में लड़ाई (P10 जानवर से, संस्कृति में 3 दिनों के बाद) suprathreshold 10 एमएस वर्तमान इंजेक्शन के जवाब में संभावित. बी s 2, 400 PA वर्तमान इंजेक्शन के जवाब में एक अलग, परत वी पिरामिड न्यूरॉन (P10 चूहा, संस्कृति में 3 दिन) से दोहराए फायरिंग. यह एक नियमित रूप से spiking न्यूरॉन था. सी. एक अलग परत वी पिरामिड न्यूरॉन (P10 चूहा, संस्कृति में 3 दिन) से रिकॉर्ड वोल्ट दबाना. 1 सुक्ष्ममापी TTX वोल्टेज gated Na + वर्तमान ब्लॉक उपस्थित थे. जावक, कश्मीर + -70 एम वी (प्रोटोकॉल सही में) का एक धारण क्षमता से 500 एमएस वोल्टेज कदम के एक परिवार के के जवाब में धाराओं. Voltages एक 10 mV तरल जंक्शन क्षमता के लिए ठीक थे. पहुँच प्रतिरोध ~ MΩ था 9. श्रृंखला प्रतिरोध के लिए कोई मुआवजा या झिल्ली समाई नियोजित किया गया था.

तालिका 1. नियंत्रण बनाम GFP ट्रांसफ़ेक्ट पिरामिड कोशिकाओं (;: इन विट्रो में 3-4 दिनों organotypic टुकड़ा p10 चूहे से स्लाइस) के इसी तरह के बिजली के गुणों. मीन + मीन की मानक त्रुटि (कोशिकाओं की संख्या). आरएमपी = आराम झिल्ली क्षमता, Rn = इनपुट प्रतिरोध, एपी = संभावित कार्रवाई, एपी के लिए पांचवीं = वोल्टेज दहलीज; HW = आधा आयाम पर एपी चौड़ाई.

इलाज आरएमपी (mV) Rn (MΩ) एपी आयाम पांचवीं (mV) HW (एमएस)
नियंत्रण -72 ± 1 (21) 119 ± 17 (11) 84 ± 2 (24) -45 ± 1 (21) 1.7 ± 0.1 (19)
केवल GFP -77 ± 1 (9) 123 ± 7 (5) 87 ± 2 (24) -45 ± 2 (9) 2.1 ± 0.2 (7)

तालिका 2. वाणिज्यिक मीडिया ये मीडिया खरीदा और इस्तेमाल किया असंशोधित (उनकी रचनाओं उपलब्ध निर्माता से ऑन लाइन कर रहे हैं ).

1 धो मीडिया: सदस्य (# GIBCO 12,360)
संस्कृति मीडिया: 20 एमएल HMEM 1 (Lonza Biowhittaker), + 10 HBSS1 एमएल (Gibco, 24020-117) + 10 एमएल घोड़ा serum1 (Hyclone # एसएच 30,074.03)

तालिका 3. समाधान (मिमी में सांद्रता).

NaCl 125, 3 KCl, CaCl 2 2, 2 MgCl 2, 1.25 2 नाह पीओ 4, 26 3 NaHCO 20, ग्लूकोज (7.4 पीएच, 310 MOsm / एल): समाधान काटना.
कृत्रिम मस्तिष्कमेरु द्रव (बाह्य रिकॉर्डिंग) aCSF: 125 NaCl, KCl 3, 2 2 CaCl, 2 2 MgCl 1.25 2 नाह पीओ 4, 26 3 NaHCO 20, ग्लूकोज (7.4 पीएच, 310 MOsm / एल).
आंतरिक रिकॉर्डिंग (वर्तमान दबाना): 130.5 KMeSO4, 10 KCl, 7.5 NaCl, 2 2 MgCl, 10 HEPES, एटीपी 2, 0.2 GTP, EGTA 0.1 (7.2 पीएच, 285-295 mOsm / एल).
आंतरिक (वोल्टेज दबाना) रिकॉर्डिंग: 55 4 KMeSO, 55 KOH, 2 2 MgCl, 20 HEPES, 6 creatine फॉस्फेट, एटीपी 4, 0.5, GTP 10 BAPTA leupeptin 0.1 (7.2 पीएच, 285-295 mOsm / एल) .

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Discussion: Neocortex की एक Organotypic स्लाइस तैयारी से पूरे सेल रिकॉर्डिंग

हम चूहा neocortex (4, 9-11) से पिरामिड न्यूरॉन्स में वोल्टेज gated पोटेशियम चैनलों के अभिव्यक्ति और कार्यात्मक भूमिकाओं अध्ययन किया गया. क्योंकि इन चैनलों लिए विशिष्ट औषधीय एजेंटों की कमी के, हम चैनल अभिव्यक्ति (1,14,15,17-19) छेड़खानी के लिए एक आनुवंशिक दृष्टिकोण उपयोग. . हम +१ organotypic संस्कृति (; 5-8; 2,3 12,13,15-22) तैयारी उपयोग Stoppini एट अल (16) के दृष्टिकोण से संशोधित, क्रम में सेल आकारिकी और प्रांतस्था का लामिना पैटर्न बनाए रखने . हम प्रसवोत्तर 6-17 दिनों पर तीव्र neocortical स्लाइस अलग और 2-7 दिनों लिए संस्कृति में स्लाइस बनाए रखने. इस हमें समान आयु वर्ग न्यूरॉन्स तीव्र स्लाइस साथ हमारे काम में उन अध्ययन अनुमति देता और टुकड़ा में विपुल उत्तेजक कनेक्शन की विकास minimizes. हम परतों द्वितीय / III या वी में नेत्रहीन पहचान पिरामिड न्यूरॉन्स अवरक्त () IR रोशनी और पूरे सेल पैच दबाना के साथ अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) वर्तमान या वोल्टेज-क्लैंप में माइक्रोस्कोपी का उपयोग से रिकॉर्ड. जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती पोटेशियम चैनल डीएनए के Biolistic अभिकर्मक (जीन बंदूक) चैनलों की अभिव्यक्ति हेरफेर उनके समारोह (1,14,15,17) अध्ययन किया है. GFP लिए सीडीएनए साथ सह अभिकर्मक करके, ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं आसानी epifluorescence माइक्रोस्कोपी तहत पहचाना हैं. हम वही टुकड़ा (1,17) से वही परत में सन्निकट, untransfected न्यूरॉन्स ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की रिकॉर्डिंग तुलना.

यहाँ कवर प्रक्रियाओं के कोई भी मुश्किल हैं, तथापि कुछ विवरण ध्यान बहुत परिणाम सुधार कर सकते. हमारे हाथों में, सेल व्यवहार्यता सर्वश्रेष्ठ है जब संस्कृतियों ~~ P8-P10 जानवरों से स्लाइस से बना रहे. यह महत्वपूर्ण है स्लाइसिंग और स्लाइस की संवर्धन दौरान अर्द्ध बाँझ स्थितियों बनाए रखने. बैक्टीरियल संदूषण रोकने हम वाद्ययंत्र आटोक्लेव और यूवी प्रकाश और EtOH, फिल्टर समाधान, पहनने दस्ताने, और मस्तिष्क के हटाने और बनाने स्लाइस बीच परिवर्तन दस्ताने साथ शल्य क्षेत्र स्वच्छ. बैक्टीरियल संदूषण के परिणामों गरीब ऊतक व्यवहार्यता और इन्क्यूबेटरों कीटाणुराहित कर लेना आवश्यकता शामिल. सभी मस्तिष्क स्लाइसें के साथ रूप, व्यवहार्यता जानवर के बलिदान के बीच समय न्यूनतम और स्लाइसिंग द्वारा सुधार है. मस्तिष्क और रखा जा चाहिए स्लाइसिंग काटना समाधान की एक बर्फ ठंड गारा में जलमग्न मस्तिष्क के साथ किया जा चाहिए. धीमी गति पर ब्लेड के कम आयाम क्षैतिज कंपन साथ, स्लाइस.

एक अन्य संभावित समस्या बाहर जबकि इनक्यूबेटर में स्लाइस की सुखाने है. ब्याज और striatum की एक छोटे टुकड़ा (अभिविन्यास प्रयोजनों के लिए) के प्रांतस्था प्रतिबंधित: सुखाने स्लाइस कि छोटे हैं तैयारी द्वारा minimized किया जा सकता. बड़े स्लाइस इनक्यूबेटर में बाहर सूखी करते हैं और यह अधिक बड़ी स्लाइस साथ स्थिर रिकॉर्डिंग शर्तों प्राप्त मुश्किल है. स्लाइसें 250-300 सुक्ष्ममापी मोटी पर कटौती हैं. हम पाते हैं कि पतले स्लाइस (हम 250 सुक्ष्ममापी पसंद) कम सुखाने में परिणाम. जब इनक्यूबेटर को काटने समाधान से स्लाइस स्थानांतरित, हम स्लाइस धो कई बार, पहले धो मीडिया में और तब संस्कृति मीडिया में. यह महत्वपूर्ण है झिल्ली (टुकड़ा जाल करने देते करने अनुमति) स्थानांतरण बाद अतिरिक्त द्रव हटायें. लिए मोटा (जैसे, 300 सुक्ष्ममापी) स्लाइस, संस्कृति एक एकल ड्रॉप मीडिया टुकड़ा के शीर्ष पर से paced (जबकि यह झिल्ली पर बैठे है) मदद करता है सुखाने रोकने के. यह कार्यविधि टुकड़ा के शीर्ष सतह नम मीडिया के आंदोलन प्रधानमंत्री होता. संस्कृति मीडिया हर दूसरे दिन जगह भी सुखाने रोकता है और व्यवहार्यता बढ़ावा देता.

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Disclosures: Neocortex की एक Organotypic स्लाइस तैयारी से पूरे सेल रिकॉर्डिंग

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements: Neocortex की एक Organotypic स्लाइस तैयारी से पूरे सेल रिकॉर्डिंग

लेखकों बकाया तकनीकी सहायता लिए Mayumi Sakuraba और रेबेका Foehring धन्यवाद देना चाहूंगा. इसके अलावा, हम डीआरएस धन्यवाद ठहरना चाहते. रॉड्रिगो Andrade हमें अभिकर्मक लिए सीडीएनए constructs साथ प्रदान लिए organotypic टुकड़ा संस्कृति और biolistic अभिकर्मक प्रोटोकॉल और डा. Nerbonne कार्यान्वित में सहायता लिए. NS044163 NINDS (आरसीएफ के लिए) से: इस काम NIH अनुदान था समर्थित द्वारा.

Materials: Neocortex की एक Organotypic स्लाइस तैयारी से पूरे सेल रिकॉर्डिंग

Surgery / transfection / culture:

  1. Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
  2. Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
    • Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter
    • Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413)
    • disposable supplies for Helios from Bio-Rad:
      • 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264
      • Tefzel Tubing: #165-2441
  3. Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984-3766).

Media:

  1. Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
  2. HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  3. HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  4. MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  5. 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE
  6. Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20.
  7. 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525)

Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.

Recording:

  1. Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
  2. Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949
  3. Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  4. PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  5. lectrode position is controlled with Sutter ROE-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
  6. Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics
  7. IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360).

References: Neocortex की एक Organotypic स्लाइस तैयारी से पूरे सेल रिकॉर्डिंग

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3 Comments

Where did you get the flexible piece of metal you use to cut out the mesh?Is there a catalog #?

1

Reply

Posted by: Emily C.November 16, 2012, 7:00 PM

The metal tool to hold the mesh membrane is a custom made stainless steel piece of sheet metal (we made it in the lab). We use this tool as a guide for the scalpel which does the cutting. The front of the tool (which will be in contact with the mesh membrane) is about 1/2 inch to 3/4 inch wide and about 1/48 to 1/32 inch thick. The front border of this holder should be straight and smooth enough so that it can hold the mesh membrane down firmly to the bottom support (the plastic cover or a piece of glass). Therefore, when you are cutting the mesh membrane, the mesh membrane does not wrinkle. The cutting blade (scalpel) should go right along one side of this metal guide while the cultured slice appears over the other side of the metal guide. Sometimes you can find a similar sized stainless steel ruler from tool stores for this purpose.

Thanks,

3

Reply

Posted by: Robert F.November 19, 2012, 5:34 PM

Thank you very much! We will make our own piece of metal then.
Best,
Emily

4

Reply

Posted by: Emily C.November 19, 2012, 6:16 PM

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