JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

העקרונות הבסיסיים של טיהור באמצעות כרומטוגרפיה לנוזל סופר - פרסומת

Jo-Ann M. Jablonski1, Christopher J. Hudalla1, Kenneth J. Fountain1, Steven M. Collier1, Damian Morrison1

1Chemistry Commercial Operations, Waters Corporation

Article
    Downloads
    Comments Metrics
     

    Sign in to register to receive emails with product information.

    Abstract

    למרות כרומטוגרפיה לנוזל סופר (SFC) אינה שיטה חדשה, preparative SFC הופך יותר ויותר פופולרי יותר עם התקדמות תוכנה מכשור, וכימיה. עקרונות יסוד לבידוד תרכובות עם SFC דומים כללי היסוד של כרומטוגרפיה preparative בקנה מידה גדול נוזלי. במחקר זה, אנו ממחישים את השפעת קצב הזרימה, פירוק מדגם ממס, סלקטיביות טור על הבידוד של תרכובות מתערובת. עמודות ארוז עם צפיפות מיטה אופטימום (OBD) טכנולוגיה 1 ועם כימיה התאמת להבטיח הרחבה קל וצפוי של סולם קטן יותר הפרדות preparative.

    Protocol

    1. לדוגמא הכנה

    • מתחם תערובת 1: coumarin, איבופרופן, ו קרבמזפין, 20 מ"ג / מ"ל ​​כל מתנול
    • מתחם תערובת 2: איבופרופן קרבמזפין, 20 מ"ג / מ"ל ​​כל מתנול
    • מתחם תערובת 3: איבופרופן קרבמזפין, 20 מ"ג / מ"ל ​​כל DMSO (sulfoxide דימתיל)
    • מתחם תערובת 4: 10 מ"ג / מ"ל ​​Fenoprofen, 15 מ"ג / מ"ל ​​Ketoprofen, 20 מ"ג / מ"ל ​​Flavone, 20 מ"ג / מ"ל ​​איבופרופן, ו 20 מ"ג / מ"ל ​​coumarin של מתנול

    2. ניסיוני תנאי

    1. אנליטי כרומטוגרפיה בוצעה על מערכת תחנת שיטת ווטרס SFC.
      טור: Viridis SFC 2-Ethylpyridine טור, 5 מיקרומטר, 4.6 x 150 מ"מ, חלק מספר 186004937.
    2. Preparative כרומטוגרפיה בוצעה על מערכת Prep ווטרס SFC 100 UV בימוי. עמודות:
      • Viridis SFC 2-Ethylpyridine טור OBD, 5 מיקרומטר, 150 x 19 מ"מ, מספר חלק 186004945
      • Viridis OBD עמודה SFC סיליקה, 5 מיקרומטר, 150 x 19 מ"מ, מספר חלק 186004918
      • Viridis SFC 2-Ethylpyridine טור OBD, 5 מיקרומטר, 100 x 19 מ"מ, מספר חלק 186004944
    3. שיטה פרמטרים אחרים:
      • טמפרטורה טור: 40 ° C
      • מתנול: Cosolvent
      • נפח הזרקה, ספיקה, והדרגות: מדווחות במספרים

    3. נציג תוצאות

    קצב הזרימה

    קצב זרימת בשימוש הפרדות preparative LC מוגבלת על ידי מספר גורמים, כולל אורך ו קוטר של הטור, גודל החלקיקים ואת backpressure המערכת. צמיגות נמוכה פחמן דו חמצני, המרכיב העיקרי של השלב ניידים SFC, מאפשרת את השימוש ספיקות גבוהות יותר מאלה המשמשים בדרך כלל כרומטוגרפיה נוזלית. Backpressure הקשורים אורך הטור הוא גם נמוך יותר, המאפשר שימוש של עמודות יותר כדי להגדיל את הרזולוציה. ספיקה גבוהה להגדיל את התפוקה על ידי הפחתת כמות של זמן כדי להשלים ההפרדה. כפי שמוצג באיור 1, הפרופיל chromatographic זהה ברמות ספיקה שונה ובלבד שיפוע שיפוע לידי ביטוי השינוי אחוזים נפח הטור נשאר קבוע .. מטרה זו מושגת על ידי הפחתת הזמן לרוץ בשיעור זהה את קצב הזרימה הוא גדל.
    איור 1

    לדוגמה פירוק וטעינה מרכך

    בידוד תרכובות מתערובות דורש כי המדגם להיות מסיס לחלוטין לפני הזריקה. מתנול, הנפוצים ביותר שיתוף ממס ב SFC, לא solubilize כל דגימות על ריכוזים גבוהים נדרש בדרך כלל טיפוסי הפרדות preparative. כמויות גדולות של ממיסים כמו מתנול יכול להגביל את היכולת של מסה הטור בשל תופעות ממס חזק שיכול לעוות את כרומטוגרפיה. הנחל משנה זריקה, פטנט התצורה הסטנדרטי של כל הכנה מערכות ווטרס SFC, נועדה להפחית את האפקט הזה ממס. דימתיל sulfoxide (DMSO) משמש באופן קבוע במעבדות טיהור solubilize הרבה סוגים שונים של תרכובות. איורים 2, 3 להמחיש עד כמה זריקות DMSO ב SFC יכול לגרום העמסה גבוהה רזולוציה טובה יותר עבור יישומים achiral לעומת דגימות מוזרק מתנול.

    הערה: לקבלת יישומים כיראליות, זהירות צריך להיחשב DMSO יכול לפגוע קשות שלב המסורתית מצופה נייח כיראליות. אם DMSO צריך להידרש מסיסות המדגם, טור כיראלי משותקת יש לבחור.
    איור 2
    איור 3

    בררנות

    ב SFC, מספר עמודות נבדקים באופן שגרתי כדי לקבוע אשר מספק את הפתרון הטוב ביותר ובצורה שיא עבור רכיבים בתערובת. רזולוציה טובה בין תרכובות מוביל isolations של תרכובות מטרה עם טוהר גבוהה. בדוגמה הבאה, העמודה 2-ethylpyridine מראה הפרדה מעולה של כל חמשת תרכובות בתערובת המדגם. תערובת מדגם זהה לנתח על עמודה סיליקה מראה רק שלוש פסגות רכיב כי יש לו סלקטיביות שונה. Coumarin ואיבופרופן coelute בערך 0.8 דקות flavone ו fenoprofen coelute מעט מאוחר יותר. Flavone ואיבופרופן גם לשנות את סדר elution על הטור סיליקה. Ketoprofen היטב להפריד בין כל הפסגות האחרות הן על עמודות.
    איור 4

    דרוג

    תערובות מדגם גולמי מנותחים בדרך כלל עם שיפוע הקרנה שמתחיל מ - אחוז נמוך של ממיס אורגני ומסתיים אחוז גבוה יותר של ממיס אורגני תוך זמן קצר יחסית. אם תרכובות עניין נפתרות היטב, שיפוע עשוי להיות מדורגים ישירות לטיהור. כאשר תרכובות כל elute לפני ההשלמת הדואר של שיפוע והם נפתרה במלואה, ירידה פשוטה אורך השיפוע מקובל. שיעורי זרימה מהירה בשימוש SFC בשילוב עם מילויים שונה משמעותית לקצר את הזמן הנדרש לטיהור מוחלט של תרכובות מטרה.

    הפרדות קנה מידה מחייב התאמת כימיה עמודה גודל החלקיקים וכן כרכים הזרקת מדורגים בהתאם והדרגות. ווטרס preparative עמודות SFC עמוסים טכנולוגיה OBD, הבטחת יציבות המיטה מעולה וביצועים דומים ווטרס עמודות אנליטי SFC. OBD עמודות preparative ארוזים לישון בצפיפות אשר תואם את הטור אנליטית המקבילה. הליך חדשני מייצרת עמודות preparative עם יציבות reproducibility מעולה, ויעילות.

    המחקר טוען מתבצעת בקנה מידה קטן כדי לקבוע כמה המונית מדגם ניתן לטעון על הטור. המטרה היא למקסם את העומס מבלי להתפשר על הרזולוציה. רזולוציה משופרת שיא מוביל המון גבוה וטוהר טוב יותר עבור תרכובות מבודדות. טעינת עמודה גבוהה מפחיתה את מספר ריצות נדרש לקבלת חומר די לניסויים הבאים. כרומטוגרפיה מן המחקר טוען מתואר באיור 5. נפח שמרנית 35 הזרקה μL מציג רזולוציה טובה בין כל התרכובות בתערובת והיא מדורגים לאחר מכן לטווח preparative על העמודה גדול. בהיקף כולל של 600 μL היה מוזרק על 19 x 150 מ"מ טור SFC preparative. איור 6 משווה את כרומטוגרפיה באמצעות צבע שונה בקנה מידה קטן בעומס המקסימלי עם כרומטוגרפיה בקנה מידה גדול המשמש לבידוד. הסלקטיביות היא זהה, גורם קריטי בעת שימוש כרומטוגרפיה אנליטית ככלי צופיות עבור בידוד הבדלים purification.The בזמן שימור ברזולוציה בין אנליטיות preparative chromatograms ניתן לייחס גורמים שונים, לרבות אמצעי אחסון של המערכת למצב זריקה. בפרט, המגביל פטנט זרם הזרקה * מצב מועסק לכל preparative מערכות ווטרס SFC, למזער את השפעת הממס ולכן שיפור התפוקה והיעילות.
    * פטנט אמריקאי # 6576125
    איור 5
    איור 6

    Discussion

    • העקרונות הבסיסיים של כרומטוגרפיה נוזלית ניתן ליישם כרומטוגרפיה לנוזל סופר (SFC).
    • כרומטוגרפיה נוזל סופר קריטי ניתן לרוץ בקצב זרימה מוגברת עושה isolations מהר יותר והעלאת התפוקה.
    • דוגמאות עם מסיסות מוגבלת יכול להיות מומס sulfoxide דימתיל וטיהר באמצעות SFC. שימוש DMSO לפירוק מדגם הופך את תהליך טיהור קל יותר על ידי צמצום חוסר הוודאות הקשורים מסיסות המדגם.
    • החלטה וטעינה של דגימות מומס DMSO ניתן לשפר לעומת דגימות אותו מומס מתנול. רזולוציה טובה יותר מדגם מוביל מוצרים עם טוהר גבוה. העמסה גבוהה משפרת את היעילות של תהליך טיהור.
    • הסלקטיביות טור משפיע על הפרדת מרכיבי התערובת. הקרנת עמודות שונות עם מילויים מהיר מוביל החלטה על איזו עמודה preparative להשתמש עבור בידוד תרכובות במדגם.
    • היכולת בקנה מידה בין אנליטיות preparative עמודות OBD מוביל הפרדות זהה בשני סולמות קטנים וגדולים, ובלבד נפח הזרקה, מדרון, שיפוע וזמן הם מדורגים נכון את הכימיה ואת גודל החלקיקים נשארים קבועים. מדרגיות טור מסיר את אי הוודאות זיהוי השיא, ובכך להקל על תהליך יעילות גבוהה יותר לטיהור.

    Disclosures

    אין ניגודי אינטרסים הכריז.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Method Station SFC System Waters More information available at www.waters.com Analytical SFC system
    SFC-UV Prep 100 Waters More information available at www.waters.com Preparative SFC System
    Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine, 4.6 x 150 mm, 5 μm Column Waters 186004937 Analytical SFC Chromatography Column
    Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column Waters 186004945 Preparative SFC Chromatography Column
    Viridis™ SFC Silica OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column Waters 186004918 Preparative SFC Chromatography Column
    Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 100 mm, 5 μm Column Waters 186004944 Preparative SFC Chromatography Column

    References

    1. Optimum Bed Density (OBD) Columns: Enabling Technology for Laboratory-Scale Isolation and Purification. Waters White Paper 720001939EN 2006 Nov.

    Comments

    1 Comment

    We have to write a paper about the next question:
    "We wish to purify ibuprofen. In litterature one can find two possible methods: column chromatography with ethyl acetate as solvent, and recristallisation out of methanol. Wich technique is to choose? Is the initial purity and the nature of the impurities of importance to answer this question?"

    I found this video by searching for ibuprofen and column chromatography. Since this is my first year and second semester bachelor in biochemics, I am not sure wheter this video can give a (partial) answer to the question or not. That is because i don't fully understand everything that is said in this video. Can someone please give me some feedback on this?
    Reply

    Posted by: AnonymousFebruary 16, 2012, 10:28 AM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter