The Journal of Visualized Experiments (JoVE) is a peer reviewed, PubMed-indexed video journal. Our mission is to increase the productivity of scientific research.
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Department of Pathology, University of California, Irvine (UCI)
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Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. J. Vis. Exp. (7), e267, doi:10.3791/267 (2007).
Immunocytochemistry उपस्थिति का निर्धारण करने के लिए एक बहुत शक्तिशाली और काफी सरल विधि, subcellular स्थानीयकरण, और ब्याज, सबसे अधिक संवर्धित कोशिकाओं में एक प्रोटीन के एक प्रतिजन के रिश्तेदार बहुतायत है. इस प्रोटोकॉल एक आसान कदम है कि शोधकर्ताओं के संरक्षण के लिए प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी जबकि बाहर उनके धुंधला उच्च गुणवत्ता, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य गुणात्मक और मात्रात्मक डेटा हो रही है सक्षम हो जाएगा की श्रृंखला का पालन करें. प्रस्तुत इस प्रोटोकॉल के दो पहलुओं है कि धुंधला के लिए आवश्यक एंटीबॉडी की मात्रा के संरक्षण में मदद कर रहे हैं. एक के लिए, कोशिकाओं के छोटे, परिपत्र coverslips कि एक ऊतक संस्कृति की थाली के कुओं में रखा जाता है पर बड़े हो रहे हैं. निर्धारण के बाद, coverslips पर कक्षों प्लेट के कुओं से हटाया जा सकता है है. एंटीबॉडी धुंधला के लिए, कोशिकाओं के साथ coverslip parafilm पर एक एंटीबॉडी समाधान के छोटे ड्रॉप पर उलटा है और parafilm को सुखाने को रोकने का एक दूसरा टुकड़ा के साथ कवर किया जाता है. इस पद्धति का उपयोग करके, केवल ~ एंटीबॉडी समाधान के 25 μl प्रत्येक (या नमूना) coverslip के लिए दाग के लिए की जरूरत है. इस प्रोटोकॉल मानव तंत्रिका स्टेम / अग्रदूत साबित कोशिकाओं (hNSPCs) के immunostaining का वर्णन है, लेकिन कई अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
दिन 1: जर्मन ग्लास Coverslips तैयारी और सीडिंग कक्ष
नोट: जर्मन कांच coverslips अक्सर संवर्धन प्राथमिक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं और न्यूरॉन्स के लिए बेहतर हैं . हम निम्नलिखित सफाई प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए कोशिका आसंजन और प्रसार में सुधार. एक छोटे से रैक में स्थिति coverslips कि coverslip के दोनों पक्षों के लिए तरल उपयोग की अनुमति होगी. पहले 10 मिनट के लिए 1% Liquinox में सेते coverslips, विआयनीकृत जल के साथ 3 washes के द्वारा पीछा किया. सुनिश्चित करें कि कोई भी साबुन के बुलबुले रहते. अगला, 30 मिनट के लिए 1M एचसीएल में सेते फिसल जाता है, विआयनीकृत जल के साथ 3 washes के द्वारा पीछा किया. पर सूखी coverslips 65 डिग्री सेल्सियस रातोंरात. एक गिलास पकवान और बाँझ आटोक्लेव coverslips स्थानांतरण.
दिन 2: Permeabilizing फिक्सिंग, अवरुद्ध है, और कक्ष के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ना
नोट: हम निम्नलिखित 4% paraformaldehyde लगानेवाला का उपयोग करने के लिए सेल आकारिकी की रक्षा . नुस्खा पीएच संक्रमण paraformaldehyde समाधान में जाने के लिए अनुमति भी शामिल है. हम इस विधि के बजाय गर्मी के उपयोग के paraformaldehyde भंग पसंद करते हैं क्योंकि उच्च तापमान चींटी एसिड, जो पृष्ठभूमि धुंधला वृद्धि हुई है जब प्रतिदीप्ति का उपयोग कर सकते हैं की पीढ़ी के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. लगानेवाला मदद के कुछ घटक cytoskeletal संरचना (2 MgCl और EGTA) की रक्षा करने के लिए, जबकि दूसरों को समग्र आकारिकी (sucrose) को बनाए रखने में मदद.
कक्ष के लिए 4% Paraformaldehyde लगानेवाला
| अभिकर्मकों और कदम: | लगानेवाला के 100 एमएल के लिए राशि : |
| MilliQ पानी | 75 मिलीलीटर |
| Paraformaldehyde (धूआं हुड में बाहर तौलना) | 4 जी |
| 10N NaOH हलचल, और dropwise जोड़ने जब तक समाधान को साफ करता है | के रूप में की जरूरत |
| 10X पीबीएस | 10 मिलीलीटर |
| 1M 2 MgCl | 0.5 मिलीलीटर |
| 0.5 एम EGTA | 2 मिलीलीटर |
| Sucrose | 4 जी |
| 6N एचसीएल, 7.4 पीएच के लिए टाइट्रेट | के रूप में की जरूरत |
| MilliQ पानी | 100 मिलीलीटर के लिए लाने |
| 4 ° C में 1 सप्ताह के लिए स्टोर. 37 तक गर्म डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें इससे पहले | |
1% में एक पूर्व निर्धारित एकाग्रता प्राथमिक एंटीबॉडी (जो उम्मीद है कि ब्याज की प्रोटीन के लिए विशिष्ट है) पतला BSA / पीबीएस (5% / BSA पीबीएस से कमजोर पड़ने से तैयार). प्लेस एक गिलास parafilm के साथ कवर प्लेट पर प्राथमिक एंटीबॉडी (25 मिमी coverslip प्रति 30 μl, 18 मिमी coverslip प्रति 20 μl, 12 मिमी coverslip प्रति 15 μl) पतला. तय कोशिकाओं के साथ coverslip उठाओ, जैसे कि कोशिकाओं नीचे चेहरा, और यह एंटीबॉडी समाधान ताकि कोशिकाओं एंटीबॉडी के साथ संपर्क में हैं पर रखना पलटना. पूरे का निर्माण पर एक दूसरे parafilm पट्टी रखें. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते हैं.
3 दिन: धुलाई, माध्यमिक एंटीबॉडी ऊष्मायन, परमाणु दाग और बढ़ते
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इस प्रोटोकॉल hNSPCs कि एंटीबॉडी की मात्रा आवश्यक minimizes और विश्वसनीय सेल धुंधला देता है के लिए एक immunostaining प्रक्रिया का वर्णन. प्रक्रिया के रूप में वर्णित intracellular प्रतिजनों के लिए सबसे अच्छा है, लेकिन कोशिका की सतह अणुओं दाग या cytoskeleton की धुंधला बढ़ाने के लिए संशोधित किया जा सकता है.
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लेखकों के लिए बच्चों के अस्पताल, Emory विश्वविद्यालय में parafilm धुंधला तकनीक में प्रारंभिक शिक्षा के लिए hNSPC संस्कृतियों और डॉ. गैरी Bassell प्रदान करने के लिए ऑरेंज काउंटी अनुसंधान संस्थान में राष्ट्रीय मानव तंत्रिका स्टेम सेल संसाधन के डॉ. फिलिप एच. Schwartz स्वीकार करते हैं करना चाहते हैं.
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| German glass (Deutsche Spiegelglas) coverslips | Tool | Carolina Biological | WW-63-3029 | 12,15,18, 22, 25 mm coverslips available |
| Liquinox phosphate-free detergent | Reagent | Sigma-Aldrich | Z273279 | very viscous |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Reagent | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Laminin, natural mouse | Reagent | Invitrogen | 23017-015 | |
| EMEM (1X) | Reagent | Mediatech, Inc. | MT-10-010-CV | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
| 24 well plate | Tool | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| Triton X-100 | Reagent | Fisher Scientific | BP151-500 | very viscous |
| Paraformaldehyde | Reagent | Sigma-Aldrich | P6148 | potential carcinogen, use caution when using it in powder and solution form |
| Bovine Serum Albumin, IgG-free | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 001-000-161 | |
| Hoechst 33342 | Reagent | Invitrogen | H-1399 | |
| Vectashield | Reagent | Vector Laboratories | H-1000 | viscous |
1. Flanagan, L.A., J. Chou, H. Falet, R. Neujahr, J.H. Hartwig, T.P. Stossel. Filamin A, the Arp2/3 complex, and the morphology and function of cortical actin filaments in human melanoma cells. J. Cell Biol. 155(4): 511-8, 2001.
2. Flanagan, L.A., L.M. Rebaza, S. Derzic, P.H. Schwartz, E.S. Monuki. Regulation of human neural precursor cells by laminin and integrins. J. Neurosci. Res. 83(5): 845-856, 2006.
3. Flanagan, L.A., B. Ziaeian, T. Palmer, P.H. Schwartz. Immunocytochemical analysis of stem cells. In Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide. J.F. Loring, R.W. Wesselschmidt, and P.H. Schwartz, eds. Elsevier/Cell Press, 2007.
4. Marchenko, S., Flanagan, L.A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments, (7). http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (22 August 2007).
5. Marchenko, S., Flanagan, L.A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments, (7). http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (22 August 2007).
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ReplyPosted by: AnonymousOctober 11, 2007, 6:24 AM