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 JoVE Biology

使用微量的生物规格的纳米分光光度计核酸和蛋白的浓度测定

1

1Shimadzu, Scientific Instruments

Article
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    Summary

    这种沟通的BioSpec纳米的紫外 - 可见分光光度计双链DNA和蛋白质定量的准确性和可重复性的数据。即使与超小卷(1〜2 L),重现性优良,自动擦拭功能,同时可以提高吞吐量和更精确的结果最小结转结果。

    Date Published: 2/17/2011, Issue 48; doi: 10.3791/2699

    Cite this Article

    Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699, doi:10.3791/2699 (2011).

    Abstract

    在过去三十年,拥有先进的核酸定量程序明显。越来越多,分子生物学家需要小批量的分析,他们的实验中核酸样品一致。 BioSpec纳米不准确的,非重复性的结果,在当前的DNA定量方法所固有的,通过专门的光学和一个敏感的PDA检测器的问题提供了一个潜在的解决方案。 BioSpec - nano还具有自动化功能,例如,安装,测量和清洁仪器,从而省去繁琐,重复和不一致的光纤元素和手工清洗的位置。

    在这项研究中,DNA和蛋白质,以及测量的可重复性和准确性的量化数据呈现。自动样品接触和快速扫描可以在三秒钟内测量,造成出色的吞吐量。使用该软件的内置功能进行数据分析。用于计算DNA浓度的计算公式为:

    样品的浓度= DF(OD260 - OD320)·农协(1)

    凡DF =样品稀释倍数和农协=核酸浓度的因素。

    按照选定1待测核酸浓度的因素。

    可以表示为μg/ mL的蛋白浓度结果或进入E280和分子量值分别为痣/大号。当在e280Calc选项卡中输入的酪氨酸,色氨酸和半胱氨酸(二硫键)的残留值,消光系数的计算值作为E280 = 5500 ×(Trp残基)+ 1490 ×(Tyr残基)+ 125 ×(半胱氨酸二硫键) 。 E280的价值是用浓度计算软件。

    BioSpec纳米除核酸和蛋白质浓度测定,可用于许多其他分析超微量分光光度计,或用5毫米光程细胞作为一个标准的分光光度计。

    Protocol

    1。 DNA定量的程序

    1. 打开仪器。
    2. BioSpec纳米软件从PC桌面上打开。
    3. 点击简单核酸双链DNA标签(图1)。
    4. 该软件将建立与仪器的通信和运行初始化序列。这验证,该仪器是按规范进行。
    5. 选择0.7或0.2毫米的光程滑块。这种选择的光程,所有的计算都基于所选择的路径长度。
    6. BioSpec纳米软件,请点击设置Autowiping设置下一步。选择1或2。
    7. 加入2μL(0.7毫米)H 2 O或底座上的缓冲区。
    8. 点击空白的空白测量或F6。每次选择一个新的光程是要记录一个空白。
    9. 加入2μL的样品基座上。
    10. 单击“开始在软件或按下仪器上的启动按钮。上面的窗口移动,使样品液滴的接触。氙弧灯可以观察到。
    11. 同一样品重复3次,以确定可重复性。
    12. 所有的数据记录保存。芽文件。
    13. 要保存为PDF或CSV文件。,单击“保存PDF / CSV或F9键。结果也可以保存为。csv文件,使用适当的选择“保存”选项卡。

    2。蛋白质定量议定书“

    1. 选择蛋白定量选项卡(图2)。
    2. 输入消光系数E280,如果知道的话。
    3. 如果不知道E280计算使用e280Calc。
    4. 选择0.7或0.2毫米的光程滑块。
    5. 点击安装Autowiping设置。选择2个或以上。
    6. 移取3μL(0.2毫米)H 2 O或底座上的缓冲。
    7. 点击空白的空白测量或F6。
    8. 移取3μL蛋白质样品基座。
    9. 单击“开始在软件或按下仪器上的启动按钮。
    10. 同一样品重复3次,以确定可重复性。
    11. 记录所有的数据将被保存为。芽文件
    12. 要保存为PDF或CSV文件。,单击“保存PDF / CSV或F9键。

    3。代表性的成果:

    1。 DNA定量结果

    图3显示了一个典型的双链DNA样本的测量数据。也显示浓度和OD 260/280比值计算。图4包含DNA定量的测试结果的重复性。在图3和图4显示了结果的数据是非常明显低的相对标准偏差为0.26%重复性。

    注1:

    DNA定量不准确,可能会出现缓冲液成分的存在,这可能在紫外区的吸收。也有必要使用一个同质的样品溶液。由于吸管样本量只有1-2微升,准确卷小心吹打没有出台任何气泡是必需的。

    2。蛋白质定量结果

    图5表示蛋白质BSA浓度的分析。 μg/ mL的蛋白浓度是基于E280价值。图6显示了可重复性的分析。 BioSpec纳米措施浓度精确 - 不仅对DNA也为蛋白质,这是显而易见的,相对标准偏差为0.51%的。

    注2:蛋白质浓度的影响因素

    精确的蛋白浓度测定是可行的,当有不稳定的最低pH值,缓冲液,温度,或添加剂造成的影​​响。大多数纯化的蛋白质经过加工的各个步骤,因此它是可能的,该蛋白可能包含表面活性剂或其他添加剂,可能会干扰与液滴的形成。对于这样的样品,用5毫米光程的石英细胞是强烈建议。

    图1
    图1双链DNA定量的分析物的选择窗口。

    图2
    图2分析物非标记的蛋白质定量选择窗口。

    图3
    DNA定量有代表性的数据图3。

    图4
    图4。重复性DNA定量数据

    图5
    蛋白质定量的有代表性的数据图5

    “图6”/> 图6。蛋白质定量的重复性数据

    Discussion

    BioSpec -纳米经过精心设计,以解决目前在DNA定量方法的固有问题,如不一致的结果和繁琐的手工劳动,。每次测量只需3秒,让经验丰富的分子生物学家分析多个样品约3-6分钟。独特的雨刮器功能,不仅提高了测量的吞吐量,同时也消除了手工清洗基座的需要,造成测量之间可以忽略不计结转。此外,测试使用的DNA样本包含1000纳克/μL仅2湿巾,表示结转小于2纳克/μL。

    一个5毫米的光程细胞的可用性提供了一个选项分析稀核酸和蛋白样品,并扩展其他应用程序使用此仪器。

    Disclosures

    Suja Sukumaran,博士是谁在这篇文章中精选仪器日本岛津公司的雇员。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioSpec-nano Shimadzu Corporation
    Calf Thymus DNA Sigma-Aldrich
    Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich

    References

    1. Aisubel, F., et al., Short Protocols in Molecular Biology. 4th edition WILEY (1999).
    2. Pace, C. N., et al., How to measure and predict molar absorption coefficient of a protein. Protein Science, Vol 4, p 2411-2423.

    Comments

    5 Comments

    COULD YOU PLEASE TELL ME HOW TO MEASURE MOLAR ABSORPTION CŒFFICIENT OF PARTICULAR COMPOUND?
    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 20, 2011, 5:53 AM

    COULD YOU PLEASE TELL ME HOW TO MEASURE MOLAR ABSORPTION CŒFFICIENT OF PARTICULAR COMPOUND?

    CAN I GET SOFTWARE OF SCHIMADZU UV-1800 SPECTROPHOTMETER FOR MY PC?
    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 20, 2011, 5:55 AM

    We would be happy to help you with your question(s). Can you e-mail me your full contact info so I can direct you to the appropriate Shimadzu office? Kevin, kgmclaughlin@shimadzu.com
    Reply

    Posted by: AnonymousJuly 20, 2011, 9:21 AM

    can u please tell me what is the price of the Shimadzu UV spectrophotometer?
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 10, 2011, 11:00 AM

    Dear Israr: Happy to help. Please send me your full contact information so I can have the appropriate person from Shimadzu contact you. Regards, Kevin, kgmclaughlin@shimadzu.com
    Reply

    Posted by: AnonymousNovember 10, 2011, 12:52 PM

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