JoVE   
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Biology

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Neuroscience

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Immunology and Infection

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Clinical and Translational Medicine

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Bioengineering

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Applied Physics

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Chemistry

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Behavior

  
You do not have subscription access to articles in this section. Learn more about access.

  JoVE Environment

|   

JoVE Science Education

General Laboratory Techniques

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Basic Methods in Cellular and Molecular Biology

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms I

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Model Organisms II

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Essentials of
Neuroscience

You do not have subscription access to videos in this collection. Learn more about access.

Automatic Translation

This translation into Swedish was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Biology

DNA-extraktion från paraffininbäddad Material för genetiska och epigenetiska Analyser

*1,2, *1,2, 3, 1,2,4

1Department of Integrative Oncology, BC Cancer Research Centre, 2Interdisciplinary Oncology Program, University of British Columbia - UBC, 3Photography/Video Production, Multi-Media Services, BC Cancer Agency, 4Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of British Columbia - UBC

* These authors contributed equally
Article
    Downloads Comments Metrics
     

    Summary

    Denna video visar protokoll för DNA-extraktion från formalinfixerade paraffininbäddade material. Detta är en flerdagars förfarande där vävnadssnitt är avparaffinerade med xylen, uppblött med etanol och behandlas med proteinas K för att rena och isolera DNA för efterföljande genspecifika eller genom hela analysen.

    Date Published: 3/26/2011, Issue 49; doi: 10.3791/2763

    Cite this Article

    Pikor, L. A., Enfield, K. S. S., Cameron, H., Lam, W. L. DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses. J. Vis. Exp. (49), e2763, doi:10.3791/2763 (2011).

    Abstract

    Sjukdomens utveckling och progression kännetecknas av frekventa genetiska och epigenetiska avvikelser inklusive kromosomala omdisponeringar, kopiera vinster nummer och förluster och DNA-metylering. Framsteg inom high-throughput, genomet hela profilering teknik, såsom mikroarrayer, har avsevärt förbättrat vår förmåga att identifiera och upptäcka dessa specifika förändringar. Men eftersom tekniken fortsätter att förbättras, är en begränsande faktor prov kvalitet och tillgänglighet. Vidare uppföljning klinisk information och sjukdom resultatet är ofta samlas år efter den första provtagning. Prover, är oftast formalinfixerade och paraffininbäddade (FFPE), lagras på sjukhus arkiv i många år decennier. DNA kan effektivt återhämtat sig från paraffininbäddade provexemplar om lämplig metod för utvinning tillämpas. Hög kvalitet DNA extraherat från bevaras på rätt sätt och förvaras prover kan stödja kvantitativa analyser för jämförelser mellan normala och sjuka vävnader och generering av genetiska och epigenetiska signaturer 1. För att extrahera DNA från paraffininbäddade prover kärnor vävnad eller microdissected vävnad utsätts för xylen behandling, som löser upp paraffin från vävnaden, och sedan uppblött med hjälp av en serie av etanol tvättar. Proteiner och skadliga enzymer som nukleaser därefter brytas ned av proteinas K. Tillsats av lyseringsbuffert, som innehåller denatureringsmedel som natriumdodecylsulfat (SDS), underlättar matsmältningen 2. Nukleinsyror renas från vävnaden lysat med buffert-mättade fenol och hög hastighet centrifugering som genererar en bifasisk lösning. DNA och RNA kvar i den övre vattenfasen, medan proteiner, lipider och polysackarider är bundet i mellan och organisk-faser respektive. Lagring av vattenfasen och upprepade fenol extraktioner genererar ett rent prov. Efter fenol extraktioner är RNas En tillsättas för att eliminera kontaminerande RNA. Ytterligare fenol extraktioner efter inkubation med RNas A används för att avlägsna alla återstående enzym. Tillägget av natriumacetat och isopropanol utfällningar DNA, och hög hastighet centrifugering används för att pellets DNA och underlätta isopropanol borttagning. Överskott salter som överförts från nederbörden kan störa efterföljande enzymatiska analyser, men kan tas bort från DNA genom tvättning med 70% etanol, följt av centrifugering att åter pellet DNA 3. DNA är resuspenderas i destillerat vatten eller buffert val, kvantifieras och förvaras vid -20 ° C. Renat DNA kan sedan användas i efterföljande program som inkluderar, men är inte begränsade till, PCR, array jämförande genomik hybridisering 4 (array CGH), T-DNA Immunoprecipitation (MeDIP) och sekvensering, vilket möjliggör en integrerad analys av vävnad / tumörprover.

    Protocol

    pH 8,0

    Discussion

    Biopsier eller kirurgiskt exciderad vävnader för histopatologiska analys och diagnos är ofta formalin fasta och paraffininbäddade (FFPE) för långtidsförvaring. Med det växande intresset för att förstå den genetiska grunden för sjukdomen, representerar förmågan att extrahera DNA från dessa prover en ovärderlig källa till diagnostiskt material som kan användas för genomisk analys och translationell studier. Historiskt FFPE proven ansågs inte en livskraftig källa för molekylär analys som nukleinsyror kan vara kraftigt modifierad av protein-nukleinsyra och protein-protein cross länkning 6. Men gör upptäckten att proteas matsmältningen frigör fragmenterade nukleinsyror som är lämpliga för efterföljande analyser inklusive PCR, array CGH, sekvensering och metylering profilering användningen av dessa värdefulla prover för genetisk analys 6.

    DNA-extraktion från paraffininbäddade vävnader är ett stabilt förfarande som bygger på differentiell löslighet att rena DNA. Extraherade DNA-kvalitet och kvantitet och framgången för efterföljande DNA-amplifiering är beroende av ett antal parametrar före, under och efter extraktion. Dessa inkluderar, men är inte begränsade till: typ och mängd av vävnad, vilken typ av fixativ som används för vävnad bevara, hur länge till upptagning, ålder paraffin block och lagringsförhållanden samt längden på önskat DNA-segment kan förstärks 1,7. Borttagning av paraffin från vävnaden är det mest kritiska steget för en lyckad extraktion som oupplöst paraffin leder till dålig prov kvalitet och hämning av PCR-amplifiering.

    Disclosures

    Inga intressekonflikter deklareras.

    Acknowledgements

    Vi vill tacka medlemmarna i Lam labbet för utvärdering och kritik av denna video och artikel. Detta arbete stöddes av medel från den kanadensiska Institutes for Health Research.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Xylene VWR international CABDH6216- 4 -
    1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes Sorenson BioScience 11510 -
    Spectrafuge 16M Microcentrifuge Labnet International C0160-B -
    Lysis Buffer 10 mM Tris-HCl pH8,
    100 mM EDTA pH 8,
    50 mM NaCl,
    0.5% SDS,
    200 μg/ml Proteinase K
    Proteinase K Stock Solution Invitrogen AM2548 20 mg/ml
    Proteinase K Stock Solution
    Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 Fisher Scientific BP1750I-400 -
    Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) Fisher Scientific BP1752I-400 -
    RNase A Roche Group 10109169001 100mg
    3M sodium Acetate pH 5.2 40.81g NaOAc in 80ml
    Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid
    Add dH2O to 100ml
    Autoclave
    ND 3300 Spectrophotometer NanoDrop - -

    References

    1. Santos, M.C., Saito, C.P. & Line, S.R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract 204, 633-6 (2008).
    2. Hilz, H., Wiegers, U. & Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins. Eur J Biochem 56, 103-8 (1975).
    3. Joseph Sambrook, D.R. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001).
    4. Kennett, J.Y., Watson, S.K., Saprunoff, H., Heryet, C. & Lam, W.L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp (2008).
    5. Thu, K.L. et al. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp (2009).
    6. Tang, W. et al. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc 2009, pdb prot5138 (2009).
    7. Hongxin Fan, M.L.G. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols 49, 1-4 (2001).

    Comments

    5 Comments

    Hi. This method can be used for mRNA extraction from this samples?. Have you used it for this proposal?.
    Thanks.
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 15, 2011, 9:27 AM

    This protocol has been optimized for DNA extraction
    Reply

    Posted by: Larissa P.April 15, 2011, 3:13 PM

    Jorge,

    This protocol has been optimized for DNA extraction only and should not be used for mRNA extraction
    Reply

    Posted by: Larissa P.April 15, 2011, 3:15 PM

    Yours work and video is very nice and learning....
    Reply

    Posted by: AnonymousApril 19, 2011, 6:51 AM

    How do you assess the amplificabilty of the extracted DNA?Do you amplify a housekeeping gene ie b globin ? do you run the DNA on agaros gel?
    Reply

    Posted by: AnonymousAugust 3, 2011, 4:41 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter